Il crescente utilizzo di zebrafish come modello animale richiede lo sviluppo di metodi efficaci per la consegna di quantità note di composti e soluzioni. La procedura descritta di seguito gavage consente la somministrazione orale di volumi precisi di soluzione affidabile, sicuro ed efficiente per zebrafish adulto.
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Articolo metodologico
Gavaging Zebrafish adulti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra è diventato un importante modello in vivo nella ricerca biomedica. Devono essere sviluppate e utilizzate per fornire i composti o agenti in soluzioni per la ricerca scientifica metodi efficaci. I metodi attuali per la somministrazione di composti per via orale per zebrafish adulti sono inesatte a causa della variabilità dei consumi volontaria da parte del pesce. Una procedura sonda gastrica è stato sviluppato per fornire quantitativi precisi di agenti infettivi per zebrafish per lo studio nella ricerca biomedica. Zebrafish adulto oltre 6 mesi di età sono stati anestetizzati con 150 mg / L di tampone MS-222 e gavaged con 5 ml di soluzione con flessibile catetere impianto tubo collegato a un taglio di 22-G punta dell'ago. Il tubo flessibile è stato abbassato nella cavità orale del zebrafish finché la punta del tubo prolungato oltre le branchie (circa 1 cm). La soluzione è stata poi iniettato lentamente nel tratto intestinale. Questo metodo è stato efficace 88% del tempo, con il pesce recuperando senza complicazioni. Questoprocedura è anche efficace come una persona può sonda gastrica 20-30 pesci in un'ora. Questo metodo può essere utilizzato per gestire con precisione gli agenti di malattie infettive studi, o studi di altri composti in zebrafish adulto.
Introduzione
I metodi attuali per la somministrazione di composti per via orale per zebrafish includono composti somministrazione superiore rivestite su alimentazione, mescolati in diete gelatina 1, bioencapsulated in salamoia gamberetti 2, mescolati con lipidi diete incapsulati 3, cera perline spruzzo 4 e attraverso le diete a base di glutine. 5 Limitazioni di questi metodi di somministrazione orale includono alti tassi di lisciviazione e il consumo di composti incompleta o imprevedibile per singolo esemplare. Queste variabili sono problematici perché in studi di malattie infettive, sapendo la dose infettiva somministrata per il pesce può essere fondamentale per il successo dello studio. Inoltre, il lavoro precedente ha dimostrato che alcuni composti somministrati in bagni di acqua provocano lesione tossica per zebrafish branchie prima che gli effetti intestinali che possono essere oggetto di studio si verificano. 6
Gavage è un metodo standard usato in altre specie animali da laboratorio per amministrare quantità precise di un prodotto con akconcentrazione nown di studio nel campo della ricerca biomedica e farmaceutica. Solo recentemente metodi per gavaging zebrafish stato descritto in letteratura. Una tecnica descritta è un metodo a due persona che utilizza una guaina catetere 24-G collegato a una pipetta 2-20 microlitri di consegnare 5 ml di soluzione. 7 Il metodo descritto avuto un tasso di mortalità del 8,7% e del 39% sulla prima e seconda prova, rispettivamente, la maggior parte della mortalità è stato attribuito a femmine gravide. La seconda tecnica sonda gastrica descritta utilizzate siringhe gavage a punta smussa per amministrare 5 ml di soluzione al medakas (Oryzias latipes). 8 Informazioni sulla mortalità non è stato fornito e il processo esatto di eseguire la sonda gastrica non è stato descritto. Secondo il Consiglio canadese sulla cura degli animali e la Zebrafish laboratorio, fino a 1% del peso corporeo del pesce può essere somministrata tramite sonda gastrica. 9,10 Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo ripetibile di erogare volumi precisi di com, sicuro ed efficientelibbre per via orale per zebrafish adulti di entrambi i sessi e in tutte le fasi della riproduzione. Tale procedura sia applicabile per ogni studio in cui è richiesto un dosaggio orale accurata di un composto.
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Protocollo
1. Preparazione della soluzione anestetica
- Preparare una soluzione di 150 mg / L di MS-222 in acqua sistema sia da una soluzione madre o dalla forma in polvere.
- Verifica del pH con un pHmetro.
- Tampone con bicarbonato di sodio come necessario fino a quando il pH è compreso tra 7-7.5.
- Preparare un serbatoio di acqua sistema libero da MS-222 per il pesce di recuperare in Il tempo di recupero è in genere meno di 1 min.
2. Preparazione del Apparato Gavage
- Tagliare la chiara 22-G impiantazione tubo per poco più di lunghezza approssimativa dalla bocca al bulbo intestinale del pesce. Inizialmente, suggeriamo anestetizzare un pesce per ogni nuovo gruppo viene utilizzato per ottenere la migliore stima della lunghezza necessaria.
- Spingere il tubo chiaro taglio impiantazione sul ½ pollice 22-G ago finché non è sicuro e non vi è alcun rischio di distacco. Se un ½ 22-C ago non è disponibile, tagliare un ago più lungo per approximately quella lunghezza.
- Quando completo, il tubo di impiantazione catetere deve estendersi circa 1 cm dalla punta dell'ago, o più breve se i pesci sono più piccoli.
- Collegare l'hub ago da 22 G per una 1-cc luerlok siringa.
3. Preparazione per Gavage
- Tagliare un solco in una spugna con una lama di bisturi.
- Immergere la spugna in acqua sistema libero da MS-222.
- Posizionare la spugna inumidita su una superficie piana.
- Elaborare la soluzione appropriata 5 microlitri per sonda gastrica nel catetere tubo 22-G e una siringa da 1 cc.
4. Anestesia e Gavage
- Veloce il pesce per almeno 24 ore prima della procedura.
- Mettere il pesce nella soluzione di MS-222 fino a che non perde il suo riflesso di raddrizzamento, e non risponde ad una pinna pizzico di coda, ma mantiene movimento dell'opercolo. Ciò richiede in genere circa 2-3 min.
- Togliere il pesce dalla soluzione anestetica e metterlo inla scanalatura nella spugna con la testa leggermente sporgente dalla spugna, ma le branchie coperte dalla spugna.
- Spostare la spugna in posizione verticale.
- Aprire la bocca del pesce zebra utilizzando il tubo del catetere 22-G.
- Inserire delicatamente il tubo fino a quando la punta è passato, le branchie (circa 1 cm o la lunghezza del tubo). Il tubo impianto non dovrebbe aver bisogno di essere costretti. Resistenza suggerisce il tubo può essere colpendo l'arco branchiale o cuore.
- Se c'è resistenza, ritirare delicatamente, riposizionare e riprovare.
- Iniettare il materiale lentamente.
- Durante l'iniezione, assicurarsi che la soluzione non esce attraverso le branchie o la bocca.
- Togliere il pesce dalla spugna e posto nel serbatoio di recupero.
- Recupero avviene tipicamente in meno di 1 min ed è indicata dal pesce nuotare eretta e mantenere l'equilibrio.
- Monitorare pesce per rigurgito come mostra la visualizzazione del pesce all'eliminazione attiva materiale dalla sua bocca, o nessun movimento dell'opercolo.
- Il pesce può essere restituito al loro serbatoio normale una volta che hanno recuperato.
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Risultati
Entrambi i sessi di pesci, tra cui femmine gravide sono state gavaged con successo (Figura 1). Una procedura di successo richiede meno di un minuto senza liquido visto uscire le branchie o la bocca. Il tubo entra facilmente, senza forza, senza sangue visto al momento della rimozione del catetere. La procedura è rapida, che richiede circa 10 minuti per gavage 3 a 4 pesce, con una media di 30-45 sec per pesci.
Zebrafish non deve essere gavaged con più di 5 pl di qualsiasi solu...
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Discussione
Significato
Questa tecnica è un miglioramento e fornisce diversi vantaggi rispetto le due tecniche descritte in precedenza per gavaging zebrafish adulto. Prima, l'uso di una spugna per trattenere il pesce permette una persona per effettuare la procedura, al contrario di una tecnica precedentemente descritta richiede due persone. 7 Secondo, tubi impianto del catetere è più flessibile di cateteri, che può aiutare a minimizzare il trauma secondario dovuto di perforazione in modo sim...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
La Rockefeller University Comparative Centro Bioscience fornito il supporto per questo progetto. Ringraziamo Janelle Monnas per l'assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| A spugna | |||
| 1-cc luer lock siringa | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 ago da 22 G (tagliare, se necessario) | Becton Dickinson Co | ||
| pHmetro | Sonda | ||
| 1 lama | |||
| [header] | |||
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
Riferimenti
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Ristampe e permessi
