Visualizzare gli effetti di una prima esperienza positiva, tattile stimolazione, su dendritiche Morfologia e Synaptic connettività con Golgi-Cox colorazione

Sommario

Questo documento descrive le procedure per la stimolazione tattile dei cuccioli di ratto e successiva colorazione Golgi-Cox della morfologia neuronale. Stimolazione tattile è un'esperienza positiva che viene somministrato nel periodo perinatale da accarezzare cuccioli con un piumino famiglia. Golgi-Cox colorazione è una procedura affidabile che consenta la visualizzazione di interi neuroni.

Abstract

Per generare cambiamenti a lungo termine nel comportamento, esperienze devono essere producendo cambiamenti stabili nella morfologia neuronale e la connettività sinaptica. Stimolazione tattile è un'esperienza positiva presto che imita materna leccare e governare nel ratto. L'esposizione cuccioli di ratto a questa esperienza positiva può essere completato in modo semplice e conveniente, utilizzando materiali altamente accessibili, come uno spolverino famiglia. Utilizzando un disegno cross-figliata, cuccioli sono o accarezzati o lasciati indisturbati, per 15 minuti, tre volte al giorno per tutto il periodo perinatale. Per misurare i cambiamenti neuroplastici relativi a questa prima esperienza positiva, Golgi-Cox colorazione del tessuto cerebrale viene utilizzato. Per il fatto che Golgi-Cox impregnazione macchie un numero discreto di neuroni piuttosto che tutte le cellule, la colorazione del cervello roditore con soluzione Golgi-Cox permette la visualizzazione di interi elementi neuronali, compreso il corpo cellulare, dendriti, assoni, e spine dendritiche. La procedura di colorazione is svolto per diversi giorni e richiede che il ricercatore prestare molta attenzione ai dettagli. Tuttavia, una volta colorazione è completato, l'intero cervello è stato impregnato e può essere conservata indefinitamente analisi in corso. Pertanto, Golgi-Cox colorazione è una risorsa preziosa per lo studio della plasticità esperienza-dipendente.

Introduzione

Anche se ci sono molte tecniche riportate e utilizzate per l'esame delle prime esperienze negative sulla maturazione del cervello, come lo stress perinatale ^1,2, deprivazione sensoriale ^3, e la tossicità della droga ^4, ci sono pochissime le metodologie impiegate per esaminare gli effetti di esperienze positive in questo periodo di tempo. A parte l'arricchimento ambientale, stimolazione tattile è uno dei pochi cervello migliorando trattamenti con effetti dimostrati ^5. Stimolazione tattile è un metodo di stimolazione sensoriale per la pelle che simula il comportamento di ratto materno, leccare e governare. La sua accettazione generale come una manipolazione positiva nasce da studi che indicano che la stimolazione tattile migliorato la maturazione dei neonati prematuri e ratti neonati ^6. Inoltre, la ricerca in laboratorio Meaney ⁷ ha dimostrato che alti livelli di leccare materna e governare sono legati a risultati positivi nella prole. A causa di tinfluenze positive ueste, stimolazione tattile rapidamente evoluto in una strategia correttiva volta a ridurre l'ansia ^8, migliorando i risultati associati a lesioni cerebrali ^9-11, e attenuando droga sensibilizzazione ^12. Come tale, la stimolazione tattile è una tecnica utile per la promozione delle prime esperienze positive, con una comprovata capacità di riorganizzare radicalmente la morfologia neuronale e la connettività sinaptica del cervello in via di sviluppo.

Al fine di esaminare e quantificare i cambiamenti nella morfologia neuronale, è necessario visualizzare neuroni intatti. La procedura di colorazione Golgi-Cox è una modifica della tecnica di Golgi pubblicato alla fine del 1800 che fornisce colorazione discreta di un piccolo numero di neuroni completi ^13. Anche se la procedura sembra macchiare i neuroni a caso e la riproducibilità è comunemente citato come difetto principale, la visualizzazione permessi piccolo tasso impregnazione del tutto l'elemento neuronale, tra cui cell corpi, dendriti, le spine dendritiche, e assoni. Allo stesso modo, il tempo necessario per impregnare un dato cervello con soluzione Golgi è anche stata citata come una caduta. Tuttavia, dato che una volta colorazione è tessuto completo può essere conservata indefinitamente, e il tempo tra perfusione del cervello e visualizzazione di neuroni con un microscopio può essere completato in meno di 21 giorni, il periodo di tempo non è irragionevole. Inoltre, con piccole modifiche al protocollo, Golgi-Cox colorazione può essere efficacemente utilizzato per impregnare cervello di roditori da tutte le fasce d'età. Come cambiamenti a livello strutturale sono stati collegati a modifiche permanenti alle funzioni comportamentali e psicologiche, la tecnica di pittura Golgi-Cox fornisce ai ricercatori un valido strumento per misurare la neuroplasticità.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in accordo con il Consiglio canadese della cura degli animali e approvati dalla University of Lethbridge, Comitato Animal Care.

1. Allevamento e tattile stimolazione

1. Ordina ratte gravide da fornitori comuni animali o allevare cuccioli in casa utilizzando le procedure di allevamento standard di laboratorio.
2. Casa di tutti gli animali in una stanza a temperatura controllata di allevamento (21 ° C), ha mantenuto una luce 12:12 hr: ciclo di buio e di fornire l'accesso a cibo e acqua ad libitum.
3. Quando i cuccioli sono nati, ratti individualmente con la loro prole casa femminili.
4. Per evitare ulteriore stress correlato al maneggio subito dopo la nascita, inizia la stimolazione tattile dei cuccioli a P3.
5. Stimolazione tattile deve essere effettuata tre volte al giorno (09:00, 01:00 e 16:00) a partire da P3-P21 e cuccioli devono essere svezzati dalle loro madri a P21.
6. Quando si utilizza un disegno cucciolata croce, la metà dei cuccioli from ogni cucciolata subirà stimolazione tattile con l'altra metà serve come controlli. Assegna in modo casuale un numero uguale di cuccioli maschili e femminili di ogni gruppo. Per differenziare i cuccioli si sottopongono a stimolazione e controlli tattili, segnare un gruppo di cuccioli con un pennarello indelebile sulle zampe posteriori e la coda. Marcatura deve essere riapplicato ogni altro giorno.

Stimolazione tattile

7. Rimuovere dighe dalla loro gabbia a casa e metterli in una gabbia provvisoria con cibo e acqua. Mantenere la diga e la gabbia temporanea in camera allevamento / alloggio.
8. Pesare cuccioli di ratto come un gruppo prima della mattina seduta di stimolazione tattile (09:00). Per ogni sessione, trasporto ratto cuccioli loro gabbie a casa per una stanza prove distinte per la stimolazione tattile. Posizionare la gabbia di casa su una piastra elettrica che è impostato a 24 ° C.
9. Utilizzare una scheda rigida per dividere la gabbia a casa in due metà. Mettere cuccioli di ratto nelle tattili stimolazione gruppo uno e mezzo e di controllo cuccioli nell'altra metà.Impostare un timer per 15 min.
10. Utilizzando un morbido piumino-like, spazzolare tutti cuccioli nel gruppo stimolazione tattile allo stesso tempo per 15 min consecutivi. I cuccioli di ratto (~ P3-P12) ususally si stringono insieme e sembrano entrare in un ciclo di sonno profondo che rende molto facile per stimolare tutti i cuccioli in una sola volta. Come l'cuccioli di età, diventano più attivi, con alcuni cuccioli piedi e indagare durante la sessione. Lo sperimentatore deve continuamente muoversi cuccioli che vagano nel gruppo per garantire che ogni cucciolo riceve stimoli uguali.
11. Una volta che la sessione di 15 min è completa, trasportare i cuccioli torna alla camera allevamento e restituire la madre alla gabbia.
12. Ripetere questo processo tre volte al giorno per i 19 giorni di stimolazione tattile. Dopo l'ultima sessione di stimolazione tattile a P21, i cuccioli devono essere svezzati dalle loro madri. Pups devono poi essere alloggiati in gabbie con 5 o 6 altri animali svezzati dello stesso sesso.
13. Se i ratti stanno subendo senza ulteriori test, dovrebbero essere lasciati ONUdisturbati, la luce normale: ciclo scuro con accesso al cibo e ad acqua libitm (oltre a regolare pulizia e movimentazione gabbia) fino a raggiungere circa 100 giorni di età. Se il sottoporsi a altre manipolazioni sperimentali, gli animali devono essere trattati o testati in conformità a tali protocolli di laboratorio.

2. Sacrificio e Golgi-Cox colorazione

1. A circa P100, somministrare una dose eccessiva di sodio pentobarbital mediante iniezione IP ai topi e profumato intracardiaca con circa 100 ml di soluzione fisiologica 0,9%.
2. Estrarre i cervelli quando la perfusione è completa. Rimuovere il cervello dal cranio, tagliando il nervo ottico sotto con sforzo di mantenere intatto il cervelletto, i ricercatori possono scegliere di mantenere o rimuovere i bulbi olfattivi. Posizionare cervelli estratti in una bottiglia Nalgene opaco con 20 ml di soluzione Golgi-Cox ^14.
3. Tenere il cervello in soluzione Golgi-Cox per 14 giorni. Dopo 14 giorni, sostituire il Golgi-Csoluzione bue con una soluzione di saccarosio al 30%. Tenere il cervello nella soluzione di saccarosio per 2-5 giorni prima di sezionamento.

Nota: Se il cervello non possono essere sezionati entro 14 giorni il trasferimento alla soluzione di saccarosio, il ricercatore ha bisogno di sostituire il saccarosio con un nuovo stock di 30% di saccarosio. Il ricercatore può sostituire il saccarosio ogni due settimane per 4 mesi senza effetti negativi sulla colorazione.

4. Al fine di sezionare il cervello, il cervello dovrebbe essere asciugate e fissato alla fase di taglio con colla cyanocacrylic. Per evitare strappi o taglio irregolare, il ricercatore deve essere prudenti e garantire che l'intero cervello sia saldamente fissata al palco.
5. Il serbatoio vibratome deve essere riempito con una soluzione di saccarosio 6% ad un livello che copre la lama di taglio. Impostare i parametri vibratome ad una velocità ed ampiezza a 5, (il punto medio su entrambe le scale). Tagliate il cervello in 200 sezioni micron e posizionare le sezioni su un micro gelatinizzato 2%ambito diapositiva. Essere sicuri di mantenere i tratti bagnati durante il corso di sezionamento.
6. Quando tutte le sezioni di interesse sono stati raccolti, premere sezioni sui vetrini applicando pressione per i vetrini con la carta assorbente inumidita. Conservare i vetrini in un rack scorrevole nella camera umida fino a quando non sono pronti per essere macchiato. Essi dovrebbero rimanere nella camera umida per almeno 12 ore, ma non più di 4 giorni. Le diapositive devono essere umido e non dovrebbe essere consentito di asciugare.
7. Preparare il reggimento colorazione prima di iniziare il processo di colorazione. Etichetta dodici piatti di colorazione del vetro (10,7 x 8,5 x 6,8 centimetri) e di processo nel modo seguente:
   1. Acqua distillata - 1 min
   2. Idrossido di ammonio - 30 min (al buio)
   3. Acqua distillata - 1 min
   4. Kodak Fix for Film - 30 min (al buio)
   5. Acqua distillata - 1 min
   6. 50% di alcool - 1 min
   7. 70% Alcohol - 1 min
   8. 95% Alcohol - 1 min
   9. 100% alcohol - 5 min
   10. 100% Alcol - 5 min
   11. Soluzione (1/3 cloroformio, 1/3 HemoDe, 1/3 100% alcool) - 15 min
   12. HemoDe - 15 min

* Xilene può essere utilizzato in sostituirlo di HemoDe. Al fine di garantire la qualità della colorazione uniforme, nuove soluzioni dovrebbero essere utilizzati per ogni rack diapositiva elaborato.

8. Dopo gli ultimi 15 minuti di emersione in HemoDe, coprioggetto le diapositive con Permount.
9. Lasciare i vetrini per asciugare prima di esaminare con un microscopio.

Risultati

Quando questa procedura di colorazione è stata eseguita in modo appropriato, si genera colorazione coerente e uniforme dei dendriti e spine. Vedere la Figura 1 per una rappresentazione di Golgi-Cox colorazione neuronale. Questo procedimento produce colorazione che è paragonabile al recente sviluppato metodi in vitro e può consentire la visualizzazione di campi dendritiche che sono uninterruptable incorporamento seguente tessuti. La tecnica basata vibratome per Golgi-Cox colorazione è stato trovato per produrre più diffusa colorazione dei rami terminali e neuroni piramidali, di colorazione con uno celloidina-embedded e criostatate sezionata, ^15. Inoltre, poiché questo metodo di colorazione impregna l'intero cervello, tutte le sezioni possono essere analizzati immediatamente o in futuro. Come la posizione di cambiamento morfologico è che non è sempre evidente quando si genera un'ipotesi originale, questo processo permette l'esplorazione di regioni cerebrali supplementari und impedisce smaltimento di tessuto che può essere utile in futuro.

Questo metodo di colorazione può essere utilizzato per la colorazione affidabile di un cervello di ratto invecchiati (P0-vecchiaia). Tuttavia, quando la colorazione giovani cervelli (<1 grammo), il cervello dovrebbe rimanere solo nella soluzione Golgi-Cox per 6 giorni, anziché 14 giorni raccomandate per cervello adulto; tutte le altre procedure sono mantenute costanti. La difficoltà principale che si possono incontrare durante questo processo di colorazione Golgi-Cox è l'incapacità di produrre colorazione di alta qualità di regioni cerebrali centrali, compresa la talamo. Poiché l'intero cervello è impregnato Allo stesso tempo, le regioni centrali non possono ricevere concentrazioni ideali di macchia. Nonostante questa scoperta, la tecnica di Golgi-Cox produce eccezionale colorazione di regioni sottocorticali come l'ippocampo e striato. Una limitazione finale della procedura deriva dalla rimozione incompleta del sangue dal cervello durante il processo di perfusione. Il sangue può produrre artefatti nel tessuto cerebraleche rende difficile fotografare e tracciare i neuroni.

Tecniche di colorazione di Golgi-Cox forniscono una misura affidabile della morfologia dendritica e neuroanatomia che è utile per una vasta gamma di studi volti a esaminare le modifiche a livello neuronale. Nell'esaminare struttura neuronale nella corteccia prefrontale in seguito a stimolazione tattile nel primo periodo-postnatale, Golgi-Cox colorazione rivelato aumenti drammatici nella complessità dendritiche. Alterazioni anatomiche legate alla stimolazione tattile precoce può essere dimostrato visivamente confrontando densità delle spine dei neuroni piramidali da un ratto di controllo per piramidale neuroni da un ratto che ha subito la stimolazione tattile (vedere Figura 1). Inoltre, parametri quali arborization dendritica, lunghezza dendritica e densità delle spine possono essere calcolati e analizzati statisticamente per generare dati continuo che può essere confrontata tra animali. Per generare risultati affidabili, analisi deve essere effettuata su amminimo della tre animali per gruppo di trattamento e circa cinque neuroni per emisfero deve essere selezionato in modo casuale per ogni regione del cervello in fase di analisi. Figura 2 mostra la complessità dendritiche (spine / micron x micron di dendriti) di animali che hanno ricevuto la stimolazione tattile e animali che non . In entrambi i settori apicali e basilari dei neuroni analizzati dal mPFC (CG3), stimolazione tattile ha comportato la proliferazione dei parametri neuronali.

Figura 1. A. Rappresentante fotografia di un Golgi-Cox macchiato neurone piramidale dallo strato III area CG3 in un topo che ha ricevuto la stimolazione tattile durante lo sviluppo. B. rappresentativa ingrandita (1.000 X) fotografia di spine dendritiche sui dendriti dei terminali nel settore basilare di CG3 ; l'immagine più chiara a sinistra è un topo nel gruppo di controllo e l'immagine più scura RIght è da un topo che ha ricevuto stimolazione tattile.

Figura 2. La rappresentazione illustrativa della complessità dendritiche apicale e basilare media (spine / micron x micron) per i neuroni nella zona CG3 da ratti adulti che o hanno ricevuto la stimolazione tattile durante lo sviluppo o non abbia (* p <0.01).

Discussione

A causa della plasticità palese del cervello di sviluppo, è importante che le procedure sperimentali di prime esperienze sono accuratamente esaminati e tentativi di controllare per tutte le variabili intervenienti. Per questo motivo, un disegno cucciolata croce è impiegato durante la procedura di stimolazione tattile per garantire che i cuccioli stanno ricevendo esperienze simili in tutti gli altri domini di sviluppo. Inoltre, è anche importante che più cuccioli da più cucciolate sono selezionate per analisi per evitare la possibilità che gli effetti derivano da una polarizzazione in un singolo cucciolo o lettiera.

Stimolazione tattile si crede di imitare il naturale comportamento materno, leccare e governare, che è pensato per essere utile allo sviluppo prole. Sebbene la ricerca precedente ha sottolineato la prima settimana di vita (P0-P7) per essere un periodo critico per leccare e governare ^16, la vastità del cambiamento identificato secondo 18 giorni di tastimolazione ctile può implicare che, sebbene esistano periodi sensibili, l'esposizione è più superiore. E 'anche importante notare che i cuccioli ricevono stimolazione tattile in questo paradigma sperimentale sperimentano anche leccare e governare dalle loro madri, quindi la stimolazione tattile è in aggiunta al normale stimolazione somministrata dalla madre. Infine, bisogna anche essere consapevoli dei cambiamenti regione-dipendente. Sebbene la stimolazione tattile durante lo sviluppo è aumentata complessità dendritiche nella corteccia prefrontale, questo non garantisce che i cambiamenti strutturali di questa natura saranno evidenti in tutte le regioni del cervello. E 'possibile che la morfologia neuronale in altre regioni del cervello come la corteccia parietale, risponderebbe in maniera sorprendentemente diverso per la stessa esperienza. Tuttavia, poiché la procedura di stimolazione tattile è facilmente gestito e non presenta alcun rischio per la prole o dighe, ha il potenziale per servire come uno strumento prezioso per molti studi di ricerca volti a migliorare lo sviluppoal esiti.

Per quanto riguarda Golgi-Cox colorazione del tessuto cerebrale, i passaggi critici per la visualizzazione di successo di cellule neuronali sono i seguenti: 1) deve esserci un'adeguata perfusione del cervello con soluzione fisiologica. Perfusione improprio o insufficiente dei risultati di tessuto cerebrale in artefatti vasi sanguigni che rendono difficile effettivamente visualizzare cellule neuronali attraverso il labirinto dei vasi sanguigni, ma anche di complicare la possibilità di fotografare i neuroni colorati. 2) cervelli perfusi devono essere conservati in soluzione Golgi-Cox e soluzione di saccarosio al buio. Conservazione del tessuto cerebrale al buio riduce la colorazione di fondo del tessuto, aumentando ancora la possibilità di visualizzare con successo le cellule neuronali qualità. 3) Tessuto cerebrale è memorizzato nella soluzione di saccarosio in seguito alla di immagazzinamento 14 giornata soluzione Golgi-Cox. Quando il tessuto viene immerso nella soluzione di saccarosio al 30% per 2-5 giorni, i cervelli sono più flessibili che impedisce la rottura e strappo delle parti quandotaglio. È importante prevenire tessuto cerebrale rimanga nella soluzione di saccarosio di maggiori periodi di tempo (a meno che la soluzione di saccarosio è continuamente sostituito con soluzione fresca) perché conservazione prolungata in saccarosio riduce la qualità della colorazione. 4) Infine, una volta che i vetrini sono stati macchiati e la copertura scivolato, devono avere il tempo sufficiente per asciugare prima visualizzazione al microscopio. Se i vetrini non sono autorizzati a ventilare adeguatamente asciutto, il tessuto potrebbe scurirsi, riducendo la visualizzazione di successo dei neuroni corticali.

Cambiamenti stabili nel funzionamento psicologico e risposte comportamentali che si verificano in risposta alle esperienze sono ritenute essere facilitato dalla riorganizzazione della morfologia neuronale e connettività sinaptica ^17. Poiché questi cambiamenti strutturali forniscono una risorsa misurabile per plasticità esperienza-dipendente, l'uso di una procedura di colorazione affidabile è importante. Basato Questo vibratome procedura di colorazione Golgi-Cox fornisce macchia affidabilezione di rami sottili e spine dendritiche che possono non essere evidenti con altri protocolli come celloidina-embedding. Il carattere distintivo della procedura di Golgi-Cox deriva dalla sua capacità di macchiare solo una piccola frazione di elementi neuronali (1-10%), che consenta di risalire singoli neuroni per lunghe distanze. Nonostante il fatto che solo una piccola frazione di neuroni sono impregnati con la macchia, cellule che sono resi visibili, mantengono tutte le funzioni, tra cui corpo cellulare, dendriti, spine dendritiche e assoni. Inoltre, quando la procedura di colorazione viene eseguita correttamente, le cellule colorate distinguono chiaramente e distintamente su uno sfondo trasparente perché altre strutture corticali rimangono senza macchia e trasparente. Grazie alla realizzazione che cambiamenti persistenti nel funzionamento passivo devono essere correlati alla plasticità del sistema nervoso, ossia la capacità dei neuroni di modificare la loro struttura e la connettività, la procedura di colorazione Golgi-Cox fornisce ai ricercatori untecnica affidabile per visualizzare e quantificare questa plasticità.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bicromato di potassio	Fisher	P188
Cloruro di mercurio	Fisher	M1561
Cromato di potassio	Fisher	P220
Idrossido di ammonio	Fisher	A669-500
Kodak Rapid Fix	Vistek	Kodak 146 4016
EtOH-95 &	Alcoli commerciali anidri	Nessun numero di gatto Tutti	gli altri Et-OH sono diluizioni
Swiffers- Spolverini morbidi simili a piume	Safeway		Può essere trovato nella maggior parte dei negozi di alimentari
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S-9378
HemoDe	Electron Microscopy Sciences	23410
Permount	Fisher	Sp15
Vetrini	VWR	160004-365
Vetrini coprioggetti	VWR	062011-9