Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.
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Articolo metodologico
Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie
In questo articolo
Sommario
Abstract
La scoperta di una maggiore infiltrazione di macrofagi nel tessuto adiposo (AT) di roditori obesi e gli esseri umani ha portato ad un intensificarsi di interesse contributo delle cellule immunitarie all'insulina locale e sistemica di resistenza. Isolamento e quantificazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie nel magri e obesi AT è oggi una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori immunometabolism; ancora estrema cura deve essere presa sia in stromale isolamento delle cellule vascolari e nella analisi di citometria a flusso in modo che i dati ottenuti siano affidabili e interpretabile . In questo video mostriamo come per tritare, digerire, e isolare la frazione di cellule vascolari-arricchito stromale immune. Successivamente, mostriamo come anticorpi etichetta macrofagi e linfociti T e come correttamente cancello su di loro in esperimenti di citometria a flusso. Sono forniti di flusso rappresentativi citometria trame di basso contenuto di grassi alimentati magra e ricca di grassi nutriti topi obesi. Un elemento critico di questa analisi è l'uso di anticorpi che fannoNon fluorescenza nei canali dove AT macrofagi sono naturalmente autofluorescenti, così come l'uso di controlli di compensazione adeguati.
Introduzione
Storicamente, il tessuto adiposo (AT) è stato visto come un organo inerte di stoccaggio dei lipidi, che si espande e si contrae in risposta al bilancio energetico. Ora capiamo che AT rappresenta un organo endocrino dinamica che secerne attivamente una serie di ormoni che influenzano direttamente il comportamento alimentare e l'omeostasi del glucosio sistemico. Inoltre, negli ultimi dieci anni c'è stato un crescente apprezzamento per le numerose popolazioni di cellule immunitarie che risiedono nella AT frazione stromale vascolare (SVF), così come il loro contributo alla AT omeostasi.
La possibilità di separare la AT adipociti e SVF....
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Protocollo
1. Reagenti e accessori per la
Prima di iniziare questo protocollo sperimentale, preparare i seguenti reagenti:
- 70% di etanolo
- PBS 1X
- 1X DPBS (senza Ca e Mg) integrati con 0,5% BSA
- FACS buffer: 1X DPBS (senza Ca e Mg), 2 mM EDTA, e l'1% FCS
- Tampone ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA in acqua
2. Raccolta e Preparazione del tessuto adiposo
- Euthanize topi secondo procedure IACUC approvati specifici per ogni istituzione.
- Bagnare completamente il pelo con il 70% di etanolo.
- ....
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Risultati
Collagenasi digestione di AT seguito da centrifugazione differenziale è stato utilizzato per isolare il SVF da cuscinetti di grasso dell'epididimo di topi maschi C57BL/6J alimentato un basso contenuto di grassi (10% kcal dai grassi) o ad alto contenuto di grassi (60% kcal dai grassi) dieta (LFD e HFD , rispettivamente) per 16 settimane. Cellule del SVF furono poi etichettati con anticorpi primari fluoroforo-coniugato a quantificare la percentuale di vitale ATM (Figura 1) e AT cellule T (figu.......
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Discussione
Crescente interesse per il ruolo del sistema immunitario nelle conseguenze metaboliche dell'obesità ha portato all'uso diffuso di citometria a flusso per caratterizzare cellule immunitarie del AT. Anche se il protocollo esatto varierà tra laboratori sulla base della loro esperienza e le attrezzature disponibili, i passaggi critici includono collagenasi digestione, centrifugazione differenziale, e la cellula antigene di superficie di etichettatura. Lo scopo del presente articolo è di fornire un protocollo dettagl.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
OCS è supportato da un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH è supportato da un American Heart Association Investigator Award Fondata (12EIA8270000). Esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nel VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa. Il VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa è supportata dalla Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DPBS (senza Ca o Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenasi | Sigma | C6885-5G | |
| soluzione di ioduro di propidio | Sigma | P4864-10 ml | |
| pila stabile 20 microlitri | Rainin | SS-L10 | |
| Puntali con filtro da 20 microlitri | Rainin | SRL10F | |
| stack stabile Punte da 250 microlitri | Rainin | SS-L250 | |
| Punte da 1000 microlitri | Rainin | GPS-L1000 | |
| Punte con filtro da 1000 microlitri | Rainin | GP-L1000F | |
| Punte con filtro da 250 microlitri | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| filtri fisher 100mn | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| piatto di peso medio | Fisherbrand | 02-202B | |
| foglio di alluminio | Fisherbrand | 1213100 | |
| forbici tritacarne | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| Provette coniche da 50 ml | BD Falcon | 14-959-49A | |
| provette FACS con filtro superiore | Falcon | 352235 | |
| Astuccio per pipette da 10 ml 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| provette a fondo tondo | BD Falcon | 352058 | |
| Siringa da 5 ml | BD Falcon | 309646 | |
| V | Costar | 07-200-107 | |
| pipetta a bulbo di trasferimento | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Tappetino adesivo | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Centrifuga per colture cellulari | Sorvall | 75253839 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentrazione: 0,5 - 1 μ g/ 106 cellule |
| Anti-topo di ratto F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Coniugato fluoroforo: APC Concentrazione: 0,2 μ g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: 17-4321 |
| Ratto anti-topo CD11b | eBioscience | 11-0112 | Coniugato fluoroforo: FITC Concentrazione: 0,5 μ g/ cellule 106 Numero di catalogo del controllo isotipo: 11/1/4031 |
| Criceto armeno anti-topo CD11c | eBioscience | 12-0114 | Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,8 μ g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipico: Dec-88 |
| Capra anti-topo MGL1/2 | R& Sistemi D | FAB4297P | Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,1 μ g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: IC108P |
| Capra anti-topo CD206 | R& Sistemi D | FAB2535P | Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,1 μ g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: IC108P |
| R& | Sistemi D | FAB5538P | Coniugato fluoroforo: PE Concentrazione: 0,1 μ g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: IC013P |
| Criceto armeno anti-topo TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Coniugato fluoroforo: APC Concentrazione: 0,2 μ g/ 106 cellule Numero di catalogo del controllo isotipo: 553956 |
| Ratto anti-topo CD8a | BD Biosciences | 552877 | Coniugato fluoroforo: PE-Cy7 Concentrazione: 0,8 μ g/ cellule 106 Numero di catalogo del controllo dell'isotipo: 552784 |
| anti-topo CD4 | BD Biosciences | 557956 Biosciences | : Alexa Fluor 700 Concentrazione: 0,2 μ g/ 106 celle Numero di catalogo del controllo dell'isotipo: 557963 |
Tabella 1. Elenco dei materiali e dei reagenti. |
Riferimenti
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-ind....
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Ristampe e permessi
