Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

Summary

Descriviamo un metodo analitico per stimare la durata del glutammato a membrane di astrociti da registrazioni elettrofisiologiche delle correnti trasportatore del glutammato negli astrociti.

Abstract

La più alta densità di trasportatori del glutammato nel cervello è trovato in astrociti. Glutammato trasportatori coppia il movimento del glutammato attraverso la membrana con il co-trasporto di Na ⁺ e 3 1 H ⁺ e la contro-trasporto di K ⁺ 1. La corrente stechiometrico generata dal processo di trasporto può essere monitorato con cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti. L'andamento temporale della corrente registrata è modellato dalla decorso temporale del profilo glutammato concentrazione a cui sono esposti gli astrociti, la cinetica di trasportatori del glutammato, e le proprietà elettrotoniche passivi di membrane astrociti. Qui si descrivono i metodi sperimentali e analitici che possono essere utilizzati per registrare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e isolare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato da tutti gli altri fattori che determinano la forma d'onda delle correnti trasportatore astrociti. I metodi qui descritti possono essere utilizzati per stimare la durata of flash-Uncaged e sinapticamente-glutammato rilasciato a membrane astrocitici in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale durante salute e di malattia.

Introduction

Astrociti sono uno dei più abbondanti tipi di cellule nel cervello con morfologia a forma di stella e sporgenze sottili membrane che si estendono per tutta la neuropil e raggiungono limitrofi sinaptica contatti ^1,2. Membrana cellulare Le astrociti 'è densamente ricco di glutammato molecole trasportatrici ^3. In condizioni fisiologiche, trasportatori del glutammato legano rapidamente glutammato extracellulare a lato della membrana e trasferirlo al citoplasma cellulare. Così facendo, i trasportatori mantenere bassa la concentrazione basale di glutammato nello spazio extracellulare ^4. Trasportatori del glutammato nei processi astrocit....

Protocol

1. Fetta di preparazione

1. Preparare 500 ml di soluzione di affettare / archiviazione contenente (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0,5 CaCl _2, 1,3 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 4 _MgCl2, 26,2 NaHCO _3, 1 NaH ₂ PO _4, e 22 di glucosio, 320 mOsm, pH 7.4
2. Utilizzare un bicchiere da 250 ml per preparare una camera di immersione per le fette, riempirlo con 200 ml di soluzione di affettare / archiviazione, scaldarlo a bagnomaria a 34 ° C e la bolla con il 95% di O _2, 5% di CO _2.
3. Mantenere il restante affettatura soluzione / memorizzazione in una bottiglia di vetro a 4 °....

Results

Il successo di questo approccio analitico descritto qui dipende criticamente ottenere registrazioni elettrofisiologiche alta qualità delle correnti Trasportatori dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale. In acute del mouse fettine di ippocampo, astrociti possono essere facilmente identificati sotto Dodt illuminazione o IR-DIC causa del loro piccolo corpo cellulare (Ø = 10 micron) e nucleo prominente (Figura 1). Loro caratteristico morfologia a stella può essere apprezzato con ep.......

Discussion

Qui si descrive un approccio sperimentale per ottenere registrazioni elettrofisiologiche da astrociti, un protocollo analitico per isolare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e un metodo matematico per ricavare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato dalle correnti transporter astrociti.

Il successo della analisi si basa sulla capacità di ottenere alta qualità registrazioni di patch clamp dagli astrociti e sulla precisione dei algoritmi di adattamento uti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 sale disodico	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX sale disodico	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotossina	Sigma	P1675
MNI-L-glutammato	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Elettrodi a
matrice	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Capillari in vetro borosilicato	World Precision Instruments	PG10165-4
Estrattore per micropipette in vetro a doppio stadio	Narishige	PC-10
Loctite 404 adesivo istantaneo	Ted Pella	46551
Lampada Xe	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics