Articolo metodologico

Un saggio di migrazione cellulare quantitativa per murini enterici neurali Progenitori

DOI:

10.3791/50709

⸱

18 settembre 2013

 ,  , 
1Molecular Genetics of Development Laboratory, Biological Sciences, UQAM

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un ex vivo delle cellule saggio di migrazione che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione delle cellule della cresta neurale in presenza di vari fattori di crescita.

Abstract

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Cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione transitoria e multipotenti cellule che proviene dal tubo neurale dorsale e migra ampiamente in tutto il vertebrato sviluppo dell'embrione. Oltre a fornire glia e neuroni periferici, NCC generare melanociti nonché la maggior parte dello scheletro cranio-facciale. Migrazione NCC e la differenziazione è controllata da una combinazione della loro origine assiale lungo il tubo neurale e la loro esposizione ai segnali extracellulari regionale distinti. Tale contributo di ligandi extracellulari è particolarmente evidente durante la formazione del sistema nervoso enterico (ENS), una complessa rete interconnessa di gangli neurale che controlla localmente (tra le altre cose) movimento intestinale muscolare e la motilità intestinale. La maggior parte della ENS è derivato da una piccola piscina iniziale di NCC che intraprendere un lungo viaggio per colonizzare - in un rostrale alla moda caudale - l'intera lunghezza del futuro dell'intestino. Tra le varie vie di segnalazione noti perinfluenza enterico colonizzazione NCC, GDNF segnalazione / RET è riconosciuto come il più importante. Infatti, la secrezione controllata spatiotemporally della RET ligando GDNF dal mesenchima intestino è principalmente responsabile per l'attrazione e la guida di-RET esprimere enterico NCC da e all'interno dell'intestino embrionale. Qui, descriviamo un ex vivo saggio migrazione cellulare, facendo uso di una linea di topi transgenici in possesso fluorescente NCC, che permette una precisa quantificazione della enterico potenziale migrazione NCC in presenza di vari fattori di crescita, tra GDNF.

Introduzione

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Cellule della cresta neurale (NCC) sono un tipo di cellula transitoria unica di vertebrati che si forma molti derivati ​​durante lo sviluppo embrionale. Questa popolazione di cellule si pone al confine della placca neurale, adiacente al ectoderma non-neurale 1. Durante neurulazione, piegatura dei luoghi placca neurale NCC lungo il bordo dorsale del tubo neurale formatura. NCC poi subire una transizione epitelio-mesenchimale, segregazione e la migrazione dal tubo neurale. NCC colonizzare varie strutture embrionali compresi il tratto digestivo dove formano l'intero sistema nervoso enterico (ENS), una rete interconnessa di gangli nervosi incorporato nella....

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Protocollo

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Dichiarazione etica

Gli esperimenti che coinvolgono i topi sono stati eseguiti a seguito Canadian Consiglio di linee guida per la cura degli animali per la cura e la manipolazione di animali utilizzati nella ricerca medica. Protocolli che comportano la manipolazione di animali sono stati approvati dal comitato etico istituzionale dell'Università del Quebec a Montreal (Comité de Protection des institutionnel Animaux, il numero di riferimento 0512-R3-650-0513).

1. Preparazione di Collagene Gel

Lavorare in modo sterile, sotto una cappa di coltura tissutale.

  1. Preparare compl....

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Risultati

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I seguenti risultati sono rappresentativi di quello ottenibile con la tecnica descritta qui (Figura 1). L'impiego di fattori di crescita (cioè GDNF) stimola la migrazione di GFP che esprimono enterico NCC dal espianto intestinale e nel gel di collagene (Figura 2). Sebbene alcune cellule escono espianto in assenza di fattori di crescita, questi non sono per lo GFP-etichettata e rappresentano entrata passiva. È necessario rimuovere la fetta intestinale dal gel di collagene per re.......

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Discussione

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Mostriamo come il nostro ex vivo espianto cultura tecnica può essere utilizzata per quantificare con precisione enterico migrazione potenziale NCC in presenza di GDNF. Tale quantificazione precisa è notevolmente semplificata ricorrendo a 200 micron di spessore sezioni vibratome budello invece di grandi pezzi di dimensioni approssimative, come descritto in precedenza 11,12,15. In effetti, questo ci permette di lavorare con un numero ragionevole di cellule in un ambiente altamente riproducibile. Da not.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Denis Flipo per consigli elaborazione delle immagini e analisi, e David W. Silversides nel cui laboratorio è stata generata la linea di topi Gata4p [5kb]-GFP. La ricerca in laboratorio Pilon è finanziato dal CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Polvere DMEMWisent219-010-XK 
NaHCO3BioshopSOB999
Sistema di filtrazione sottovuoto Steriflip di grado biotecnologico (0,22 micron)EMD MilliporeSCGP00525 
Soluzione di penicilina-streptomicina, 100xWisent450-201-EL 
Siero fetale bovinoWisent095-150Collagene di alta qualità
IBD biosciences354236 
NaOHBioshopSHY700Diluito da stock 10 N poi filtrato sterile,
GDNFCedarlaneCLCYT305 
Falcon 24-well PlateBD biosciences353047 
Forbici da dissezioneFisher Scientific089515 
piastra Petri in vetroVWR89000-306 
PBSSigmaP5493Microscopio
da dissezioneLeicaM125 
Dumont #5 PinzeStrumenti per la scienza11251-20 
AgarosioBioshopAGA001Lama chirurgica di grado biotecnologico
Feather21 
Penna per colla Krazy istantanea per tutti gli usiColla KrazyKG824
HM 650V Microtomo a lama vibranteThermo Scientific920110 
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148 
DAPISigma-AldrichD9564 

Tabella dei reagenti e delle attrezzature specifiche.

per colture cellulari

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
  2. Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung's disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
  3. Oberma....

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Tag

Cellule della cresta neurale fluorescentimicrotomo vibranteincubazione in gel di collagenemicroscopia a fluorescenzasegnalazione GDNFdissezione dell intestino embrionaleinclusione in agarosiostimolazione con fattori di crescita

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