L'imaging cellulare dal vivo di infezioni da virus alphaherpes consente l'analisi degli eventi dinamici di trasporto diretto e la diffusione intercellulare. Qui vi presentiamo le metodologie che utilizzano ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine di fusione fluorescenti per facilitare la visualizzazione delle assemblee virale durante l'infezione di neuroni primari.
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Articolo metodologico
Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Progressi nelle tecniche di microscopia di fluorescenza di cellule vive, così come la costruzione di ceppi virali ricombinanti che esprimono proteine di fusione fluorescenti hanno permesso visualizzazione in tempo reale di trasporto e diffusione del virus alphaherpes infezione di neuroni. L'utilità di nuove proteine di fusione fluorescenti a membrana virale, in involucri, e capsidi, in collaborazione con l'imaging cellulare dal vivo, identificato assemblee di particelle virali in fase di trasporto all'interno di assoni. Utensili simili sono stati impiegati con successo per analisi di cellula-cellula diffusione di particelle virali per quantificare il numero e la diversità di virioni trasmessi tra le cellule. È importante sottolineare che le tecniche di imaging cellulare dal vivo di trasporto anterogrado e la diffusione producono una ricchezza di informazioni tra le velocità delle particelle di trasporto, distribuzioni di particelle, e le analisi temporali della localizzazione delle proteine. Accanto a classici tecniche genetiche virali, queste metodologie hanno fornito spunti criticiin importanti questioni meccanicistici. In questo articolo descriviamo in dettaglio i metodi di imaging che sono stati sviluppati per rispondere alle domande fondamentali della alphaherpes trasporto e diffusione del virus.
Introduzione
L'infezione del sistema nervoso periferico (SNP) di alphaherpes virus come il virus herpes simplex (HSV) -1, -2, e virus pseudorabies (PRV) prevede diversi passaggi intricati e altamente regolamentato in tutto il ciclo vitale del virus. Trasporto all'interno neuroni del sistema nervoso periferico è fondamentale durante gli eventi di entrambi infezione virale primaria e la successiva diffusione inter-host. I meccanismi molecolari che modulano due componenti del ciclo di vita virale; trasporto diretto delle assemblee virali di distanza dal corpo cellulare all'interno di assoni (trasporto anterogrado) e la successiva trasmissione dei virioni di cellule sensi....
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Protocollo
Sezione 1 - Condizioni di controllo ambientale per la microscopia a fluorescenza live-cell
- 30 min prima di ogni esperimento di imaging collegare e iniziare il riscaldamento del microscopio stadio top incubatore.
- Accendere il microscopio, fonti di luce trasmessa e epifluorescente e controlli hardware automatizzati. Aprire il software di controllo del microscopio, NIS Elements, per la connessione al microscopio ed iniziare il raffreddamento della macchina EM-CCD.
- Fissare Lens più caldo per obiettivo appropriato (60X o 100X immersione in olio). Nota: Selezionare lente dell'obiettivo in base a tipo di esperimento. Il con....
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Risultati
Anterograda Trasporti
L'applicazione di questo protocollo per le infezioni delle dissociate culture SCG con PRV 348, un ceppo ricombinante PRV esprimono GFP-US9 e proteine di fusione della membrana GM-mCherry, ha facilitato la visualizzazione del trasporto anterogrado di virioni (Figura 3 e Movie supplementare 4). L'incorporazione di queste proteine di fusione in particelle virali risultati nella loro rilevazione sul trasporto puncta, e le condizion.......
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Discussione
L'obiettivo di imaging cellulare dal vivo sta osservando processi biologici che si verificano senza significative alterazioni con l'atto di osservazione. Questo obiettivo è raggiunto attraverso l'ottimizzazione tre variabili: il controllo ambientale, la velocità di formazione immagine, e l'illuminazione a fluorescenza. Queste variabili interdipendenti devono essere bilanciati per ottenere condizioni di imaging vitali. I protocolli presentati utilizzano specifiche condizioni per produrre i risultati rappr.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
LWE e RK sono supportati dal National Institutes of Health sovvenzioni R37 NS033506-16 e R01 NS060699-03. MPT è stato sostenuto da un Cancer Society Postdoctoral Fellowship americana Research (PF-10-057-01-MPC). La consulenza e la conoscenza del dottor Matteo Lyman e Dr. Oren Kobiler hanno contribuito a progettare la configurazione microscopio e metodi di imaging cellulare dal vivo. Abbiamo anche estendere grazie a Neal Barlow e Brian T. Kain di Nikon Instruments per la loro assistenza tecnica per l'acquisto, l'installazione e la performance del microscopio.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piatto di coltura con fondo in vetro da 35 mm | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Corpo del microscopio | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Microscopio motorizzato X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Ruote portafiltri motorizzate | Prior Scientific | HF110 a 10 posizioni | |
| Sorgente di illuminazione fluorescente | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Canada, | X-Cite 120Q | |
| Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - Telecamera ET | ||
| EM-CCD | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top incubatore ambientale | Live Cell Instruments; Seoul, Corea del Sud | TC-L-10 | |
| Riscaldatore per lenti dell'obiettivo | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Software di analisi del riscaldatore | |
| Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | Elementi |
Riferimenti
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology.
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Ristampe e permessi
