Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

Sommario

La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Abstract

Guts della maggior parte degli insetti sono abitate da comunità complesse di batteri non patogeni simbiotici. All'interno di queste comunità microbiche è possibile identificare commensali o batteri mutualistiche specie. Questi ultimi, sono stati osservati per servire molteplici funzioni per l'insetto, ossia ad assistere nella riproduzione insetto ^1, stimolare la risposta immunitaria ^2, produzione feromone ^3, così come la nutrizione, tra cui la sintesi di amminoacidi essenziali ^4, tra gli altri.

Data l'importanza di queste associazioni, sono stati fatti molti sforzi per caratterizzare le comunità fino ai singoli membri. Tuttavia, la maggior parte di questi sforzi sono stati entrambi basati su metodi di coltivazione o invocato la generazione di frammenti del gene 16S rRNA che sono stati sequenziati per l'identificazione finale. Purtroppo, questi approcci solo individuate le specie batteriche presenti nell'intestino e non hanno fornito alcuna informatione sull'attività metabolica dei microrganismi.

Per caratterizzare le specie batteriche metabolicamente attive nell'intestino di un insetto, abbiamo usato isotopo stabile tastatura (SIP) in vivo impiegando ¹³ C-glucosio come substrato universale. Questa è una tecnica priva di cultura promettente che permette il collegamento di filogenesi microbica per la loro particolare attività metabolica. Ciò è possibile inseguimento stabili, isotopi etichettato atomi di substrati in biomarker microbici, come DNA e RNA ^5. L'incorporazione di ¹³ C isotopi nel DNA aumenta la densità del DNA marcato rispetto al non marcato ⁽¹² C) uno. Alla fine, il DNA ¹³ C-marcato o RNA è separato mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità del ¹² C-marcato una simile ^6. La successiva analisi molecolare dei isotopomeri separati acidi nucleici fornisce il collegamento tra l'attività metabolica e l'identità delle specie.

Qui vi presentiamo il protocollo utilizzato per caratterizzare i batteri metabolicamente attivi nell'intestino di un insetto generalista (il nostro modello di sistema), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). L'analisi filogenetica del DNA è stata effettuata usando pyrosequencing, che ha permesso alta risoluzione e precisione nell'identificazione del budello insetto comunità batterica. Come substrato principale, ¹³ C-glucosio marcato è stato usato negli esperimenti. Il substrato è stato alimentato agli insetti con una dieta artificiale.

Introduzione

Associazioni simbiotiche Insect-batteriche sono conosciute per un gran numero di specie di insetti ^7. In queste associazioni simbiotiche, i microrganismi svolgono un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo di insetti. I microbi hanno dimostrato di contribuire alla riproduzione insetto ^1, feromone biosintesi ^3, alimentazione, compresa la sintesi di amminoacidi essenziali ^4, e la digestione del cibo inaccessibili all'host. Nonostante la grande varietà di associazioni gut-batterica, tanto meno si sa circa il ruolo funzionale che svolgono a favore degli insetti. Solo in caso di termiti, la digestione simbiotico di ....

Protocollo

1. Insetto allevamento

1. Acquistare o avere uova grinfie di Spodoptera littoralis dal proprio allevamento. Mantenerle in piastre sterili a temperatura ambiente (RT) fino alla schiusa.
2. Preparare la dieta artificiale per gli insetti che allevano come segue:
   1. Mettere a bagno i fagioli bianchi 500 g di terra durante la notte in 100 ml di acqua.
   2. Aggiungere 9,0 g di acido ascorbico e 75 g di agar a 1000 ml di acqua distillata H ₂ O e poi bollire.
   3. Lasciare la miscela a raffreddare e quando solidifica (a una miscela solido ceroso bianco) conservarla a 4 ° C fino all'utilizzo.
3. Trasferir....

Risultati

Per ottenere un'etichettatura adeguata dei batteri metabolicamente attive presenti nell'intestino dell'insetto, l'insetto deve essere esposto alla ricca-C substrato ¹³ per un periodo già ottimizzata sufficiente per consentire la separazione della frazione più pesante etichettata facilmente dal marcato leggero. Nel nostro caso, ¹³ C-glucosio è stata integrata nella dieta artificiale ad una concentrazione finale di 10 mM per 1 giorno (Figura 1A). La stessa quantità di.......

Discussione

L'intestino della maggior parte degli insetti ospita una comunità microbica ricco e complesso, in genere 10 ⁷ -10 ⁹ cellule procariote alloggiano lì, superando in numero le cellule dell'ospite nella maggior parte dei casi. Così, l'intestino insetto è un "hot spot" per diverse attività microbiche, che rappresenta molteplici aspetti delle relazioni microbici, da patogenesi di obbligare mutualismo ^27. Anche se molti studi hanno descritto una straordinaria varietà di co.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dumont #5 Pinze con finitura a specchio	Strumenti per la scienza fine	11251-23
Vannas Forbici a molla	Strumenti per la scienza fine	15000-00
Concentratore sottovuoto Speed 5301	Eppendorf Germany	5305 000.304
Pestello in plastica	Carl Roth GmbH Co. Germany	P986.1
Spettrofotometro NanoVue	GE HealthCare, Regno Unito	28-9569-58
Mastercycler pro/termociclatore	Eppendorf Germania	6321 000.515
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber	Biometra	Fuori produzione
Ultracentrifuga (Optima L-90K)	Beckman	A20684
Rotore per ultracentrifuga (NVT 90)	Beckman	362752
pompa per HPLC	Agilent	1100
Tubo in poliallomero Beckman		342412
Transilluminatore UVstar 15	Biometra