Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Summary

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Abstract

Crescita vascolare controllata è fondamentale per la rigenerazione tissutale successo e la guarigione delle ferite, così come per il trattamento di malattie ischemiche come ictus, infarto o arteriopatie periferiche. Consegna diretta di fattori di crescita angiogenici ha il potenziale per stimolare la crescita di nuovi vasi sanguigni, ma è spesso associata a limitazioni come la mancanza di un orientamento e di breve emivita in vivo. La terapia genica offre un approccio alternativo, fornendo geni codificanti fattori angiogenici, ma spesso richiede l'utilizzo virus, ed è limitata da problemi di sicurezza. Qui si descrive una strategia recentemente sviluppato per stimolare la crescita vascolare dalle cellule staminali di programmazione per iperespressione di fattori angiogenici in situ utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. In particolare la nostra strategia utilizzato cellule staminali come vettori sfruttando la loro capacità di migrare verso i tessuti ischemici in vivo. Utilizzando i vettori polimerici ottimizzate, derivate da tessuto adiposoLe cellule staminali sono state modificate per iperespressione di un gene che codifica angiogenico fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Abbiamo descritto i processi per la sintesi del polimero, la formazione di nanoparticelle, trasfezione delle cellule staminali in vitro, come pure metodi per convalidare l'efficacia delle cellule staminali-VEGF esprimendo per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Introduction

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di promuovere l'angiogenesi terapeutica con cellule staminali non-virale programmati sovraespressione fattori terapeutici presso il sito di ischemia. Le cellule staminali sono state modificate ex vivo prima con nanoparticelle biodegradabili sintetizzate in laboratorio e poi trapiantate in un modello murino di ischemia degli arti posteriori per convalidare il loro potenziale per migliorare l'angiogenesi e recupero del tessuto.

Crescita vascolare controllato è un componente importante di rigenerazione tissutale successo, così come per il trattamento di varie malattie ischemiche come ictus, ischemia e infarto del miocardio. Diverse strategie sono state sviluppate per promuovere la crescita vascolare, inclusa la consegna fattore di crescita e terapia cellulare. ¹ Nonostante l'efficacia osservata nei modelli animali di malattia, questi metodi ancora affrontare limitazioni, quali la necessità di dosi sovrafisiologici per la consegna fattore di crescita, o insufficiente paracrinorilasciare dalle cellule soli. Una strategia potenziale per superare le limitazioni di cui sopra è di combinare terapia con cellule staminali e terapia genica, per cui le cellule staminali sono geneticamente programmati ex vivo prima del trapianto di iperespressione fattori terapeutici desiderabili. Questo approccio è stata dimostrata in vari modelli di malattie, tra cui l'ischemia degli arti posteriori ^2, malattie cardiache ^3, guarigione ossea ⁴ e ⁵ danno neuronale, ecc. Tuttavia, la maggior parte delle tecniche di terapia genica si basano su vettori virali, che sono associati con problemi di sicurezza quali il potenziale immunogenicità e mutagenesi inserzionale. Biomateriali mediate trasferimento genico non virale possono superare questi limiti, ma spesso soffrono di bassa efficienza di trasfezione. Per accelerare la scoperta di nuovi biomateriali per un efficiente trasferimento genico non virale, studi recenti hanno impiegato chimica combinatoria e ad alta produttività approccio di screening. Biblioteche polimero biodegradabile come il poli (es β-amminotri) (PBAE) sono stati sviluppati e schermato, che ha portato alla scoperta di polimeri leader con marcatamente maggiore efficienza di trasfezione rispetto alle tradizionali controparti vettori polimerici. ^6-7

Qui, si descrive la sintesi di PBAE e verifica della loro capacità di trasfezione le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) in vitro, seguita da successiva trapianto di ADSCs geneticamente modificati iperesprimenti fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) in un modello murino di ischemia hindlimb . I risultati sono stati valutati tenendo traccia destino cellulare utilizzando l'imaging bioluminescenza, valutando riperfusione mediante perfusione tissutale laser Doppler Imaging (LDPI), e determinando l'angiogenesi e tessuti di salvataggio da istologia.

Protocol

1. Polymer Synthesis

1. In una cappa aspirante, pesare 3.523 mg di butandiolo diacrylate (C) e trasferire in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta.
2. Preriscaldamento 5-ammino-1-pentanolo (32) a 90 ° C per solubilizzare il sale, poi in una cappa aspirante, pesare 1,533 mg 32 e aggiungere alla fiala di scintillazione contenente C. Questo metodo si tradurrà in un rapporto molare C: 32 = 1:1,2.
3. Porre immediatamente il flaconcino contenente entrambe le soluzioni su un piatto mescolare. Impostare la velocità scalpore a 600 rpm.
4. Trasferire la fiala di scintillazione di un forno a 90 ° C. Impostare la velocità di agitazione a 1.000 rpm per 4 ore. Se l'ancoretta si blocca, ridurre la velocità. Dopo 4 ore, velocità inferiore a 300 rpm e mantenere a 90 ° C per un altro 12-16 ore.
5. Aggiungere 5 g di C32 a 10 ml di tetraidrofurano anidro (THF) in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta. Avvolgere nella pellicola e vortice in alto fino a completo scioglimento.
6. In un scintillazione fiala di vetro Conta separatoining un bar mescolare, aggiungere 10 mm di Tetraethyleneglycoldiamine (122). Aggiungere 40 ml di THF.
7. Posizionare entrambi i flaconi (C32 e 122) su un piatto mescolare per 5 minuti poi si combinano insieme. Copertina in pellicola e lasciare a temperatura ambiente agitazione a 400 rpm per 24 ore. Il prodotto finale è definito C32-122.
8. Pesare 5 x 50 ml provette Falcon per ogni 5 g lotto di C32-122. Nota la massa di ciascun tubo in un notebook.
9. Trasferimento 30 ml di etere etilico anidro per ogni 50 ml tubo Falcon.
10. Trasferimento 10 ml di C32-122 per ogni 50 ml provetta Falcon.
11. Tubi Vortex Falcon energicamente poi centrifugare a 2.500 rpm per 2 min. Nota: Il polimero estratto raccoglierà alla base del tubo.
12. Scartare la soluzione superiore e ripetere i passi 1.9 e 1.11 altre due volte.
13. Posizionare i tubi aperti contenenti l'estratto C32-122 in un essiccatore vuoto e durante la notte. Assicurarsi che tutti i tubi sono protetti dalla luce.
14. Pesare tutte le provette contenenti C32-122 per determinare la massa finale delpolimero estratto.
15. Sciogliere il polimero estratto in DMSO anidro ad una concentrazione di 100 mg / ml.
16. Conservare il polimero sciolto a -20 ° C al riparo dalla luce e dall'umidità.

2. Semina cellulare

1. Pre-coat base di un pallone di coltura tissutale T-150 con 0,1% (peso / volume) gelatina. La gelatina deve rimanere nel pallone per 30-45 min. Il rivestimento gelatina aiuta adesione di ADSCs.
2. Aspirare gelatina dal pallone T-150 pre-rivestite.
3. Aggiungere 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ passaggio 3) al pallone in 20 ml di DMEM contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e 10 ng / ml bFGF.
4. Porre il pallone T-150 in incubatore a 37 ° C, 5% CO ₂ durante la notte.
5. Iniziare procedura di trasfezione il giorno seguente.

3. Nanoparticelle Preparazione e Transfezione

1. La seguente procedura è per la preparazione di nanoparticelle contenenti 16,1 mg di DNA plasmidico per1,0 x 10 ⁶ cellule in un polimero di plasmide rapporto in peso di 30:1.
2. Diluire DNA plasmidico (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) ad una concentrazione finale di 120 mg / ml in acetato di sodio (25 mM) in un tubo Falcon da 15 ml.
3. Diluire C32-122 (100 mg / ml) ad una concentrazione finale di 3,6 mg / ml in acetato di sodio (25 mM) in un secondo tubo 15 ml Falcon.
4. Unire il contenuto di ogni provette Falcon in un unico tubo da 15 ml falco e vortex immediatamente in alto per 10 sec.
5. Lasciare la provetta riposare a temperatura ambiente per 10 min per la formazione di nanoparticelle a verificarsi.
6. Durante l'incubazione, sostituire il mezzo nel tessuto pallone di coltura con DMEM 7.8 ml completamente integrato per 1,0 x 10 ⁶ cellule trasfettate.
7. Trasferire la soluzione di nanoparticelle al pallone di coltura di tessuti e ribaltare in avanti e indietro per distribuire uniformemente.
8. Porre il pallone di coltura tissutale in incubatore a 37 ° C, 5% CO ₂ per 4 ore.
9. Dopo 2 ore, sostituire il nanoparticolo contenente multimediale con DMEM.
10. A seguito di una ulteriore incubazione 2 ore a 37 ° C, 5% CO _2, le cellule sono pronte per l'iniezione in vivo.

4. Ischemia degli arti posteriori Procedura

1. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la cura degli animali e del Comitato Usa Linee guida della Stanford University e protocolli APLAC approvati. Generare il modello murino di ischemia degli arti posteriori viene eseguita come descritto in precedenza. ⁸ prega di fare riferimento al riferimento per le istruzioni dettagliate. Una breve descrizione è fornita di seguito.
2. Posizionare il mouse in anestesia con il 1-3% isoflurano dosaggio per inalazione e velocità di flusso di ossigeno di 1 L / min. Garantire la profondità dell'anestesia dal pizzico punta, la riduzione della frequenza respiratoria, e letargia.
3. Rimuovere i capelli dalla regione addominale e due aree arti posteriori del mouse con crema da barba.
4. Fai incisione al centro mediale della coscia verso la linea mediana e poi tagliare il cuscinetto adiposo sovrastante a exporre l'arteria femorale.
5. Legare l'arteria a due siti: sito distale (vicino al ginocchio) e il sito prossimale (appena distalmente al legamento inguinale).
6. Per creare le legature, separare l'arteria dalla vena e infilare una sutura di seta 5-0 intorno all'arteria. Legare l'arteria con due nodi per fare la legatura.
7. Rimuovere l'arteria tra i due punti di legatura.
8. Lavare l'area chirurgica con PBS e poi suturare l'incisione chiuso.
9. L'anestesia può ora essere rimosso. Tenere il caldo mouse fino al risveglio. Per le cure post-operatorie, 2-4 mg / kg di lidocaina può essere iniettato per via sottocutanea al sito di incisione prima del risveglio. Ulteriore gestione del dolore può includere la consegna sottocutanea di 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfina a 12 e 24 ore. Monitorare lo stato di salute dei topi una volta al giorno per sette giorni osservando i cambiamenti nel pattern respiratorio, dolore palese o angoscia, e il colore della pelle.
10. Confermare hindlimb ischemia laser Doppler imaging di perfusione.

5. Iniezioni di cellule

1. Quando le cellule trasfettate e topi sono pronti, lavare le cellule trasfettate con PBS, trypsinize, centrifuga, e poi contare.
2. Risospendere le cellule ad una densità di 10 x 10 ⁶ cellule per ml in PBS.
3. Sospensioni cellulari devono essere separate in provette Eppendorf separate in un volume di 110 microlitri. Questo farà sì che ciascun topo riceve una quantità uguale di cellule.
4. Collocare ogni topo sotto anestesia (2,5% isoflurano, portata 1 L / min di ossigeno).
5. Pulire il sito di iniezione con il cotone imbevuto di alcol.
6. Utilizzando una siringa da tubercolina 27 G, trarre le cellule su e giù nella siringa per garantire una sospensione omogenea è raggiunto. Elaborare 100 ml di volume di sospensione cellulare nella siringa.
7. Iniettare metà della sospensione cellulare nella regione muscolo adduttore e poi iniettare l'altra metà nella regione polpaccio. Dopo l'iniezione, lasciare la siringa in posizione per almeno 15-30 secondi perprevenire perdite di sospensione cellulare.
8. Controlli adeguati per lo studio animale includono: 1) cellule transfettate con un plasmide non codificante (es. plasmide senza attività biologica), 2) le sole cellule, e 3) PBS.
9. Quando i conferimenti sono complete, togliere il mouse da anestesia e tenere in caldo fino a quando il mouse si ri-Awakes.

6. Bioluminescenza

1. Per iniziare bioluminescenza (BLI), anestetizzare i topi come descritto sopra.
2. Pulire il sito di iniezione con il cotone imbevuto di alcol.
3. Utilizzando siringa da insulina, carico di 100 ml di 15 mg / ml D-luciferina (il substrato per la luciferasi di lucciola). Tenere substrato al riparo dalla luce.
4. Per eseguire iniezioni intraperitoneali, tenere i topi dalla pelle della schiena per tirare la pelle tesa anteriore. Inserire l'ago per via intraperitoneale nella regione addominale e iniettare 100 ml di substrato.
5. Posizionare il mouse nella camera di imaging luciferasi IVIS sotto anestesia.
6. Immagine topi con un tempo di esposizione di 1,0 min. Quando i parametri sono impostati, iniziare ad acquisire le immagini.
7. Quando l'immagine viene acquisita, segnare la regione di interesse per misurare il segnale luciferasi. In questo caso, contrassegnare ischemico nel sito di cella-iniezione.
8. Continuare a misurare il segnale luciferasi ogni 3-5 minuti fino a quando il segnale raggiunge un picco e comincia a diminuire. Questo è il valore utilizzato per il confronto tra i topi e su diversi punti di tempo.
9. Al termine, togliere i topi dalla camera e l'anestesia. Mantenere topi caldo fino risveglio.

7. Laser Doppler Perfusion Imaging

1. Laser Doppler perfusione viene eseguita come descritto in precedenza. ⁸ La procedura viene brevemente descritto qui.
2. Prima Doppler il mouse deve essere pulito rasato presso le aree sovrastanti entrambe le zampe posteriori e la regione addominale per evitare artefatti dovuti ai capelli.
3. Quando pronti a immagine Doppler, il mouse va anestetizzato come descritto sopra.
4. Riscaldare il mouse a 36 ° C su una piastra calda mentre controllo della temperatura corporea da termometro rettale.
5. Posizionare il mouse su una superficie nera non riflettente e mantenere anestetizzato dal cono di naso. Il mouse deve essere collocato sulla sua superficie dorsale con gli arti esposti in modo uniforme.
6. Posizionare il sensore laser Doppler circa 15 cm sopra il mouse e dirigere il puntatore laser dal sensore verso la regione inguinale del mouse.
7. Quando il mouse e il sensore Doppler sono in posizione, le immagini possono essere scattate utilizzando il software LDPIwin premendo il pulsante Start.
8. Misure di perfusione relativi potrebbero essere prese indicando due zampe posteriori (ischemica e non-ischemica), come la regione di interesse (ROI). Il rapporto di perfusione medio del ischemico alla hindlimb non ischemica indicherà perfusione relativo.

8. Tissue Harvest Procedura

1. Quando pronti a topolino delle risaie tiscitare in giudizio per istologia e / o trasformazione biochimica, il mouse deve essere eutanasia. Qui, il mouse è eutanasia esponendo al 5% isoflurano per 3-5 minuti, poi eutanasia il mouse per dislocazione cervicale.
2. Tagliare la pelle sovrastante circonda l'arti posteriori circonferenzialmente in corrispondenza della zona addominale distale e prossimale al hindlimb. La pelle è tagliata dalla ventrale alle superfici dorsali, tale che la pelle può essere tirato indietro sul arti posteriori al piede.
3. Tirando indietro la pelle, l'arto potrebbe essere amputato utilizzando forbici smussa per tagliare alla giuntura del bacino e del femore.
4. Due principali tessuti sono presi per le analisi: i muscoli adduttori mediale e dei muscoli gastrocnemio.
5. Per istologia, incorporare uno o entrambi i tessuti in temperatura di taglio ottimale (OCT) per criosezionamento.
6. Per l'analisi biochimica, raccogliere uno o entrambi i tessuti in un Eppendorf da 1,5 ml e immergere in un bagno di azoto liquido per almeno 2 min. I campioni possono essereconservato a -80 ° C per una successiva elaborazione.

Results

Su mescolando, il polimero carico positivamente (C32-122) e caricati negativamente plasmide DNA auto-assembla in nanoparticelle. Formazione di nanoparticelle può essere confermata mediante analisi elettroforetica ossia la complessazione tra C32-122 e DNA plasmidico impedirà mobilitazione del DNA durante l'elettroforesi. Il polimero serve come reagente di trasfezione per facilitare un migliore assorbimento del DNA nelle cellule bersaglio e la successiva espressione di proteine ​​che codificano (Figura 2)...

Discussion

Qui riportiamo un metodo per programmare le cellule staminali adulte per iperespressione di fattori terapeutici utilizzando non-virali, nanoparticelle biodegradabili. Questa piattaforma è particolarmente utile per il trattamento di malattie in cui le cellule staminali possono naturalmente casa, come ischemia e cancro. ^9-10 Inoltre, la piattaforma di trasferimento genico non virale permette sovraespressione transiente di fattori terapeutici, che è più adatto per la rigenerazione dei tessuti e ferita processi d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Siero fetale bovino	Invitrogen	10082
Penicillina/Streptomicina	Invitrogen	15070
Fattore di crescita dei fibroblasti di base	Peprotech	100-18B
1,4-butandiolo diacrilato (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronimo: C
5- ammino-1-pentanolo (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronimo: 32
Tetraetilenglicoldiammina > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronimo: 122
Acetato di sodio	G-Biosciences	R010
Soluzione salina tamponata con fosfato	Invitrogen	14190-144
Tetraiofurano anidro (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	401757
Etere Dietilico Anidro (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO anidro (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatina	Sigma Aldrich	G9391
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferina	GoldBio
Temperatura di taglio ottimale (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-ratto	IgG Invitrogen	A11007