Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Sommario

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Abstract

Crescita vascolare controllata è fondamentale per la rigenerazione tissutale successo e la guarigione delle ferite, così come per il trattamento di malattie ischemiche come ictus, infarto o arteriopatie periferiche. Consegna diretta di fattori di crescita angiogenici ha il potenziale per stimolare la crescita di nuovi vasi sanguigni, ma è spesso associata a limitazioni come la mancanza di un orientamento e di breve emivita in vivo. La terapia genica offre un approccio alternativo, fornendo geni codificanti fattori angiogenici, ma spesso richiede l'utilizzo virus, ed è limitata da problemi di sicurezza. Qui si descrive una strategia recentemente sviluppato per stimolare la crescita vascolare dalle cellule staminali di programmazione per iperespressione di fattori angiogenici in situ utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. In particolare la nostra strategia utilizzato cellule staminali come vettori sfruttando la loro capacità di migrare verso i tessuti ischemici in vivo. Utilizzando i vettori polimerici ottimizzate, derivate da tessuto adiposoLe cellule staminali sono state modificate per iperespressione di un gene che codifica angiogenico fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Abbiamo descritto i processi per la sintesi del polimero, la formazione di nanoparticelle, trasfezione delle cellule staminali in vitro, come pure metodi per convalidare l'efficacia delle cellule staminali-VEGF esprimendo per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Introduzione

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di promuovere l'angiogenesi terapeutica con cellule staminali non-virale programmati sovraespressione fattori terapeutici presso il sito di ischemia. Le cellule staminali sono state modificate ex vivo prima con nanoparticelle biodegradabili sintetizzate in laboratorio e poi trapiantate in un modello murino di ischemia degli arti posteriori per convalidare il loro potenziale per migliorare l'angiogenesi e recupero del tessuto.

Crescita vascolare controllato è un componente importante di rigenerazione tissutale successo, così come per il trattamento di varie malattie ische....

Protocollo

1. Polymer Synthesis

1. In una cappa aspirante, pesare 3.523 mg di butandiolo diacrylate (C) e trasferire in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta.
2. Preriscaldamento 5-ammino-1-pentanolo (32) a 90 ° C per solubilizzare il sale, poi in una cappa aspirante, pesare 1,533 mg 32 e aggiungere alla fiala di scintillazione contenente C. Questo metodo si tradurrà in un rapporto molare C: 32 = 1:1,2.
3. Porre immediatamente il flaconcino contenente entrambe le soluzioni su un piatto mescolare. Impostare la velocità scalpore a 600 rpm.
4. Trasferire la fiala di scintillazione di un forno a 90 ° C. Impostare la velocità di a....

Risultati

Su mescolando, il polimero carico positivamente (C32-122) e caricati negativamente plasmide DNA auto-assembla in nanoparticelle. Formazione di nanoparticelle può essere confermata mediante analisi elettroforetica ossia la complessazione tra C32-122 e DNA plasmidico impedirà mobilitazione del DNA durante l'elettroforesi. Il polimero serve come reagente di trasfezione per facilitare un migliore assorbimento del DNA nelle cellule bersaglio e la successiva espressione di proteine ​​che codificano (Figur.......

Discussione

Qui riportiamo un metodo per programmare le cellule staminali adulte per iperespressione di fattori terapeutici utilizzando non-virali, nanoparticelle biodegradabili. Questa piattaforma è particolarmente utile per il trattamento di malattie in cui le cellule staminali possono naturalmente casa, come ischemia e cancro. ^9-10 Inoltre, la piattaforma di trasferimento genico non virale permette sovraespressione transiente di fattori terapeutici, che è più adatto per la rigenerazione dei tessuti e ferita processi d.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Invitrogen	11965
Siero fetale bovino	Invitrogen	10082
Penicillina/Streptomicina	Invitrogen	15070
Fattore di crescita dei fibroblasti di base	Peprotech	100-18B
1,4-butandiolo diacrilato (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronimo: C
5- ammino-1-pentanolo (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronimo: 32
Tetraetilenglicoldiammina > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronimo: 122
Acetato di sodio	G-Biosciences	R010
Soluzione salina tamponata con fosfato	Invitrogen	14190-144
Tetraiofurano anidro (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	401757
Etere Dietilico Anidro (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO anidro (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatina	Sigma Aldrich	G9391
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferina	GoldBio
Temperatura di taglio ottimale (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-ratto	IgG Invitrogen	A11007