Determinazione della struttura e della coordinazione di complessi peptide-metallo mediante NMR 1D e 2D 1H

Summary

È stata determinata la struttura in soluzione NMR di un peptide modello metallochaperone con Cu (I) e viene descritto un protocollo dettagliato dalla preparazione del campione e dalla raccolta di dati 1D e 2D a una struttura tridimensionale.

Abstract

Il legame del rame (I) da parte delle proteine di trasporto del metallochaperone impedisce l'ossidazione del rame e il rilascio degli ioni tossici che possono partecipare a reazioni redox dannose. Il complesso Cu (I) del modello peptidico di una proteina metallochaperone legante Cu (I), che include la sequenza MTCSGCSRPG (sottolineata è conservata), è stato determinato in soluzione in condizioni inerti mediante spettroscopia NMR.

NMR è una tecnica ampiamente accettata per la determinazione delle strutture in soluzione di proteine e peptidi. A causa della difficoltà di cristallizzazione di fornire singoli cristalli adatti alla cristallografia a raggi X, la tecnica NMR è estremamente preziosa, soprattutto in quanto fornisce informazioni sullo stato della soluzione piuttosto che sullo stato solido. Qui descriviamo tutti i passaggi necessari per la determinazione della struttura tridimensionale completa mediante NMR. Il protocollo include la preparazione del campione in una provetta NMR, la raccolta e l'elaborazione dei dati 1D e 2D, l'assegnazione e l'integrazione dei picchi, i calcoli di meccanica molecolare e l'analisi della struttura. È importante sottolineare che l'analisi è stata condotta prima senza alcun legame metallo-legante preimpostato, per garantire una determinazione affidabile della struttura in modo imparziale.

Introduction

I peptidi sono ampiamente utilizzati come modelli proteici, potenziali farmaci e agenti terapeutici a pieno titolo. Tuttavia, le loro dimensioni ridotte e l'alto grado di flessibilità spesso precludono la determinazione della struttura ai raggi X a causa delle difficoltà di cristallizzazione.

La risonanza magnetica nucleare (NMR) può essere utilizzata per determinare le strutture e le interazioni dei peptidi. Il metodo può fornire informazioni riguardanti la struttura locale e complessiva, il legame e le interazioni di affinità inferiore, ed è applicabile a campioni difficili poiché può essere fatto nello stato di soluzione.

Protocol

1. Preparazione del campione

1. Apo-campione: Sciogliere circa 1-2 mg del peptide in 450-500 μl di solvente deuterato di grado NMR (le soluzioni preferibili per i campioni biologici sono il 10% di D2O in acqua o d6-DMSO ^11-12 se il campione non si dissolve in acqua o reagisce con essa).
2. Campione reagito al rame: Sciogliere circa 1-2 mg di peptide con una quantità equimolare di sale metallico in 450-500 μl di solvente NMR.
3. Filtrare la soluzione utilizzando un vetro sinterizzato, carta da filtrazione o qualsiasi altra tecnica che si adatti ai composti in esame e non li adsorbisca. Questo è essenziale per rimuovere eventua....

Results

Nell'ambito di uno studio in corso su modelli di proteine leganti il rame, la struttura della sequenza conservata MT/HCXXC all'interno del peptide lineare MTCSGCSRPG è stata determinata mediante NMR allo stato di soluzione. Il peptide è stato fatto reagire con CuCl in ambiente inerte e il pH è stato misurato come ~3,0 da uno stick universale. La regione ammidica del peptide ha mostrato un'espansione dopo la reazione con il rame, da 6,7-8,5 a 6,6-9,0 ppm (Figura 2). L'allargamento della linea dovuto alla .......

Discussion

Il contributo dell'informazione strutturale per comprendere i meccanismi di legame è ben accettato. I peptidi sono utili come modelli per il legame e le interazioni proteiche; tuttavia non sono suscettibili al metodo principale per la determinazione della struttura, la cristallografia a raggi X. La risonanza magnetica mobile è particolarmente utile per questi sistemi, poiché le strutture possono essere facilmente risolte in soluzione. Ciò è particolarmente vero per i metallochaperone-mimetici che richiedono inoltre la de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spettrometro Avance DMX 600 MHz	Bruker
NMR provette per campioni	Wilmad	535-PP
Scatola a guanti	MBraun	LM05-019
Liofilizzatore	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	Custom made	>95% di purezza
Rame (1) cloruro	Aldrich	224332
Acido cloridrico	BioLab	231-595-7
Idrossido di sodio	Gadot	1310-73-2
d6-Dimetilsolfossido	Aldrich	236926
Ossido di deuterio	Aldrich	151882