Erratum: Protocolli di preparazione dei campioni, imaging e analisi per la microscopia a scansione a lama (Knife-edge Scanning Microscopy)

Sommario

È stata apportata una correzione a Protocolli di preparazione, acquisizione e analisi dei campioni per la microscopia a scansione con lama. Sono state effettuate modifiche importanti al protocollo di colorazione di Nissl.

Abstract

È stata apportata una correzione a Protocolli di preparazione del campione, acquisizione delle immagini e analisi per la microscopia a scansione con lama. Sono state effettuate modifiche importanti al protocollo di colorazione di Nissl.

Protocollo

È stata apportata una correzione a Protocolli di preparazione, acquisizione e analisi dei campioni per la microscopia a scansione con lama. Il protocollo di colorazione di Nissl è stato modificato da:

2. Preparazione del campione: Nissl

1. Il topo viene profondamente anestetizzato utilizzando chetamina e xilazina iniettate per via intraperitoneale e quindi perfuso transcardialmente con 50 mL di soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente (pH 7,4), seguiti da 250 mL di formalina neutra tamponata al 10% a temperatura ambiente (pH 7,4) e infine con 3,0 cc di inchiostro di china non diluito.
2. La perfusione dell'intero organismo con soluzione salina e fissativo è necessaria per rimuovere il sangue dal sistema cardiovascolare e fissare i tessuti. La perfusione con inchiostro di china è necessaria per riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare.
3. Il cervello ottenuto viene quindi disidratato mediante una serie di alcoli etilici a concentrazione crescente (25%{}-100%) e successivamente incluso in plastica araldite seguendo il protocollo descritto nei punti 1.8-1.9 sopra. Se il mezzo di inclusione è LR white, si segue il protocollo descritto nel punto 1.10 sopra.
4. Il topo viene profondamente anestetizzato utilizzando chetamina e xilazina iniettate per via intraperitoneale e quindi perfuso transcardialmente con 50 mL di soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente (pH 7,4), seguiti da 250 mL di formalina neutra tamponata al 10% a temperatura ambiente (pH 7,4) e infine con 3,0 cc di inchiostro di china non diluito.
5. La perfusione dell'intero organismo con soluzione salina e fissativo è necessaria per rimuovere il sangue dal sistema cardiovascolare e fissare i tessuti. La perfusione con inchiostro di china è necessaria per riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare.
6. Il cervello ottenuto viene quindi disidratato mediante una serie di alcoli etilici a concentrazione crescente (25%{}-100%) e successivamente incluso in plastica araldite seguendo il protocollo descritto nei punti 1.8-1.9 sopra. Se il mezzo di inclusione è LR white, si segue il protocollo descritto nel punto 1.10 sopra.
7. Il topo viene profondamente anestetizzato utilizzando chetamina e xilazina iniettate per via intraperitoneale e quindi perfuso transcardialmente con 50 mL di soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente (pH 7,4), seguiti da 250 mL di formalina neutra tamponata al 10% a temperatura ambiente (pH 7,4) e infine con 3,0 cc di inchiostro di china non diluito.
8. La perfusione dell'intero organismo con soluzione salina e fissativo è necessaria per rimuovere il sangue dal sistema cardiovascolare e fissare i tessuti. La perfusione con inchiostro di china è necessaria per riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare.
9. Il cervello ottenuto viene quindi disidratato mediante una serie di alcoli etilici a concentrazione crescente (25%{}-100%) e successivamente incluso in plastica araldite seguendo il protocollo descritto nei punti 1.8-1.9 sopra. Se il mezzo di inclusione è LR white, si segue il protocollo descritto nel punto 1.10 sopra.

a:

2. Preparazione del campione: Nissl

1. Questo protocollo segue da vicino il protocollo di Mayerich et al.⁷
2. Il topo viene fortemente anestetizzato utilizzando chetamina e xilazina iniettate per via intraperitoneale, quindi viene effettuata una perfusione transcardiaca con 50 mL di soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente (pH 7,4), seguita da 250 mL di paraformaldeide al 4% tamponata al fosfato e fredda (pH 7,4).
3. Successivamente, il topo viene perfuso con 100 mL di una soluzione di colorante di tionina allo 0,1% in acqua deionizzata e il corpo viene collocato in frigorifero (4 °C) per 24 ore.
4. Dopo 24 ore, il cervello viene asportato dalla calotta cranica e immerso in una soluzione fresca di tionina allo 0,1%, lasciandolo a 4 °C per 7 giorni. La lunga durata di questa procedura mira a garantire una completa infiltrazione della tionina nel preparato en bloc.
5. Il cervello viene quindi decolorato e disidratato mediante una serie progressiva di etanoli, partendo da etanolo al 50% in acqua fino ad arrivare all'etanolo al 100% in un periodo di 6 settimane. Le soluzioni di etanolo dal 50% al 70% vengono conservate in frigorifero (4 °C), mentre tutte le soluzioni con concentrazioni superiori al 70% vengono mantenute a temperatura ambiente.
6. Dopo tre cambi di acetone (2-4 giorni in ciascuna soluzione a temperatura ambiente), il cervello viene quindi incluso in resina araldite seguendo il protocollo descritto nei punti 1.8-1.9 sopra riportati. Se il mezzo di inclusione è LR white, si segue il protocollo indicato nel punto 1.10 sopra.