Recupero dell'antigene indotto dal calore: un metodo efficace per rilevare e identificare i tipi di cellule progenitrici durante la neurogenesi ippocampale adulta

Sommario

Durante la neurogenesi dell'ippocampo adulto, un insieme distinto di marcatori genetici viene espresso quando una cellula staminale neurale quiescente progredisce in sequenza e si sviluppa in un neurone funzionalmente integrato nel circuito. Utilizzando il recupero dell'antigene indotto dal calore, i tipi di cellule progenitrici che altrimenti sarebbero difficili da rilevare vengono identificati con maggiore efficacia.

Abstract

I metodi tradizionali di immunoistochimica (IHC) dopo la fissazione dei tessuti consentono la visualizzazione di vari tipi di cellule. Questi tipicamente procedono con l'applicazione di anticorpi per legare gli antigeni e identificare le cellule con caratteristiche che sono una funzione della biologia e dello sviluppo intrinseci. La neurogenesi ippocampale adulta è un processo sequenziale in cui una cellula staminale neurale quiescente può attivarsi e procedere attraverso fasi di proliferazione, differenziazione, maturazione e integrazione funzionale. Ogni fase è distinta con una morfologia caratteristica e una sovraregolazione dei geni. L'identificazione di queste fasi è importante per comprendere i meccanismi regolatori in gioco e le eventuali alterazioni di questo processo che sono alla base della fisiopatologia dei disturbi debilitanti. Il nostro approccio di recupero dell'antigene indotto dal calore migliora l'intensità del segnale che viene rilevato e consente la corretta identificazione del tipo di cellula progenitrice. Come discusso in questo articolo, ci permette in particolare di aggirare gli attuali problemi nel rilevamento di alcuni tipi di cellule progenitrici.

Introduzione

La neurogenesi, la generazione di nuovi neuroni da cellule staminali neurali, è ora nota per verificarsi costantemente nell'età adulta in due regioni specializzate del cervello. Questi includono la zona subventricolare (SVZ) del bulbo olfattivo e la zona subgranulare (SGZ) del giro dentato nell'ippocampo. Nell'ultimo decennio, il campo della neurogenesi ippocampale adulta ha visto un lavoro significativo. La regione ha suscitato molto interesse poiché i neuroni neonati nella SGZ contribuiscono a una maggiore plasticità neurale che può sostenere specifiche funzioni cerebrali^1-5. La neurogenesi dell'ippocampo adulto è stata implicata per svolgere un ruolo importante nella regolazione dell'umore, nella rigenerazione, nell'apprendimento e nella memoria. Pertanto, c'è stato uno sforzo concertato per comprendere lo sviluppo e la regolazione dei neuroni in questa ricca nicchia neurogena.

Un aspetto inevitabile e importante dello studio della neurogenesi dell'ippocampo adulto è l'identificazione di stadi separati che una cellula staminale neurale attivata attraversa nel suo percorso per diventare un neurone completamente funzionale. In questo processo, la cellula staminale neurale quiescente viene attivata e procede attraverso una serie di tipi di cellule progenitrici attive precoci e attive tardive (Figura 1). Queste distinte popolazioni di progenitori neurali possono essere identificate dalla morfologia e dalla loro espressione di marcatori molecolari come MCM2, nestina, Tbr2 e Doublecortin (DCX) e NeuN che guidano la conversione degli RGL nei rispettivi tipi di cellule progenitrici. La nestina è una proteina del filamento intermedio che viene espressa attraverso le cellule simili alla glia radiale e alcuni tipi di cellule progenitrici precoci. Un altro marcatore è Tbr2 che è specificamente espresso nelle cellule progenitrici amplificatrici. L'espressione del transgene Tbr2 è inizialmente disattivata nelle cellule di tipo 1 (simile alla glia radiale), attivata attraverso i progenitori di tipo 2a, tipo 2ab e tipo 2b e disattivata tra i neuroni di tipo 3 più differenziati e immaturi (Figura 1). La DCX è un marcatore di migrazione neuronale che è espresso nei progenitori neurali di tipo 2ab, tipo 2b e tipo 3. Utilizzando questa combinazione di tre marcatori, possiamo etichettare sottotipi distinti di progenitori neurali. Questi includono il Tipo-1 (MCM2+nestina+Tbr2-), il Tipo-2a (MCM2+nestina+Tbr2+), il Tipo-2ab (MCM2+nestina-Tbr2+ parziale e MCM2+Tbr2+DCX-), il Tipo-2b (MCM2+Tbr2+DCX+) e il Tipo-3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Le cellule post-mitotiche come i neuroni immaturi e funzionalmente integrati possono essere identificate utilizzando DCX e il marcatore neuronale maturo, NeuN.

I metodi tradizionali di IHC utilizzano anticorpi per identificare antigeni per specifici tipi di cellule in base alla loro espressione genica. Per la loro identificazione può essere utilizzata la successiva visualizzazione attraverso tecniche di imaging ad alta risoluzione come la microscopia confocale. Tuttavia, attualmente esistono problemi con questi metodi che non consentono un'identificazione efficiente delle cellule simili alla glia radiale e dei primi tipi di cellule progenitrici. È difficile identificare questi particolari tipi di cellule perché l'anticorpo applicato non è in grado di penetrare e legare efficacemente la proteina nestina. La nestina è la proteina del filamento intermedio che comprende i processi radiali prodotti dalla cellula simile alla glia radiale. Il legame inefficiente di un anticorpo all'antigene può essere il risultato di molti fattori, tra cui il tempo di fissazione, la temperatura e la tecnica utilizzata^6-7. Per aiutare a risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo di recupero dell'antigene o "bollitura". Oltre alla nestina, questo metodo di recupero dell'antigene migliora anche la colorazione di altri marcatori come Ki67, BrdU, proteina acida fibrillare gliale (GFAP), Tbr2 e MCM2. Il nostro metodo combina approcci chimici e fisici. Comporta la fissazione chimica del tessuto in paraformaldeide e la successiva ebollizione ad alta temperatura di sottili sezioni coronali dell'ippocampo in un tampone di un trattamento denaturante e caotropico. Ciò migliora l'accessibilità dell'antigene all'anticorpo, migliora la specificità degli anticorpi e consente una migliore identificazione dei tipi di cellule progenitrici. Il nostro approccio è semplice da usare e richiede per lo più strumenti e reagenti già disponibili in laboratorio. Lo abbiamo ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo delle cellule staminali neurali e la loro regolazione attraverso fattori ambientali genetici intrinseci o estrinseci⁸.

Protocollo

1. Pre-immunoistochimica: perfusione e istologia

1. Perfondere i topi secondo un protocollo transcardico generale adattato per i topi ed estrarre il cervello in paraformaldeide al 4% (PFA)⁹.
2. Lasciare il cervello in PFA per una notte a 4 °C (ad es. una provetta conica da 10 ml riempita con PFA). Conservare in PFA per almeno 12-24 ore, non più di 36 ore per un fissaggio completo. Dopo il fissaggio notturno, svuotare il PFA dal tubo conico ma lasciare il cervello all'interno. Versare il 30% di saccarosio nel tubo e lavare il cervello per 5 secondi per rimuovere eventuali residui di PFA. Infine, riempire nuovamente il tubo contenente il cervello con il 30% di saccarosio. Conservare il cervello nel saccarosio a 4 °C fino a quando il cervello non affonda sul fondo del tubo.
3. Tagliare sezioni cerebrali di 40 μm su un microtomo. Consulta un atlante cerebrale di topo per iniziare a raccogliere sezioni dall'inizio del giro dentato fino alla sua fine. Conservare le sezioni in soluzione antigelo (una ricetta semplice è 300 g di saccarosio in 500 ml di 0,1 M PBS e 300 ml di glicole etilenico) fino al momento dell'immunoistochimica.
4. Montare il tessuto tagliato su vetrini da microscopio appositamente progettati per aderire fortemente al tessuto. Questi vetrini forniscono una forte tenuta ai tessuti durante la fase di ebollizione. Dopo aver montato il fazzoletto, lasciare asciugare il vetrino per 10 minuti o fino a quando non è completamente asciutto. L'asciugatura può essere accelerata se il vetrino è appoggiato su una superficie verticale con il bordo inferiore del vetrino su un tovagliolo di carta. Se viene montata più di una guida, le altre guide possono essere lasciate asciutte durante quel periodo (1-2 ore va bene) fino al momento di procedere alla fase successiva.
5. Una volta che il vetrino è asciutto, lavare con PBS tre volte per 5 minuti ciascuna e asciugare nuovamente (tampone PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na₂PO₄). Ciò garantisce che qualsiasi sostanza chimica precedente (come il glicerolo dalla soluzione di conservazione antigelo) venga rimossa a sufficienza e non possa compromettere l'aderenza del tessuto al vetrino.

2. Preparazione dei reagenti e delle attrezzature minori

1. Preparare la soluzione A (0,1 M o 19,21 g/l di acido citrico) e la soluzione B (0,1 M o 24,9 g/l di citrato trisodico) in cui verranno bollite le sezioni di tessuto.
2. In un cilindro graduato, unire 9 ml di Soluzione A e 41 ml di Soluzione B. Aggiungere 450 ml di ddH₂O a questa miscela.
3. Versare questa miscela in un contenitore vuoto (ad es. una scatola vuota di puntali per pipette) adatto al microonde.

3. Recupero dell'antigene indotto dal calore

1. Far bollire la soluzione preparata al punto 2 per 5 minuti a temperatura standard in un forno a microonde standard. La soluzione inizierà a bollire a una temperatura pari o superiore a 100 °C.
2. Una volta completata l'ebollizione, rimuovere con cautela il contenitore dal microonde e posizionare i vetrini secchi al suo interno, assicurandosi che la faccia del vetrino con sezioni ippocampali sia rivolta verso il basso e completamente esposta al liquido. Se possibile, posiziona i vetrini ad angolo contro le pareti della scatola e impila altri vetrini attorno ad essi. Assicurati che la loro "adattamento" all'interno della scatola sia ben salda in modo che le guide non abbiano spazio per muoversi l'una sull'altra.
3. Far bollire questa miscela con i vetrini per 7 minuti a impostazioni standard nel microonde. Durante questo periodo la soluzione bollirà a una temperatura pari o superiore a 100 °C.
4. Durante questa fase di ebollizione, riempire due secchielli di ghiaccio a metà con ghiaccio.
5. Una volta completata l'ebollizione nel passaggio 3.3, rimuovere il contenitore dal microonde e posizionarlo all'interno di uno dei secchielli per il ghiaccio. Versa il resto del ghiaccio dall'altro secchio tutto intorno al contenitore e coprilo completamente. Lasciate riposare per 1 ora.

4. Colorazione degli anticorpi primari e secondari

1. Al termine del periodo di attesa di 1 ora, rimuovere i vetrini dal contenitore e lavare con il tampone TBS-T 3 volte per 5 minuti ciascuno. Per eseguire questi lavaggi di base può essere utilizzato qualsiasi apparecchio. (Tampone TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% tampone Triton X-100 TBS, TBS-TT = 4% tampone TBS-T siero d'asina).
2. Dopo il lavaggio, lasciare asciugare le guide in un luogo buio (ad es. all'interno di un cassetto del banco, posizionare un tovagliolo di carta all'interno del cassetto e inclinare la guida contro di esso) per 5-10 minuti o fino a quando la guida non è completamente asciutta. Durante questo periodo, preparare una camera per la colorazione notturna degli anticorpi primari. Una camera di colorazione semplice può comprendere un contenitore con un'ampia superficie riempita con ddH₂O e un tavolino all'interno del contenitore, sopra il quale il vetrino può essere appoggiato sopra il ddH₂O.
3. Una volta che il vetrino si è asciugato, disegna un contorno attorno alle sezioni di tessuto usando una penna idrorepellente. Durante la fase 4.5, questo contorno funge da barriera impedendo alla miscela di anticorpi di fluire.
4. Preparare la miscela di anticorpi primari in TBS-TT. Ad esempio, sono necessari almeno 500 μl per coprire un intero vetrino, ad esempio, se lo stock di anticorpi è a una concentrazione di 1:500, aggiungere 1 μl di un particolare anticorpo a 500 μl di TBS-TT). Utilizzare gli anticorpi primari come indicato nella tabella dei reagenti.
5. Posizionare il vetrino essiccato sopra il tavolino nella camera di colorazione. Aggiungere lentamente 500 μl degli anticorpi primari e coprire l'intera superficie. Coprire l'intero apparato e avvolgerlo in un foglio di alluminio per bloccare la luce esterna. Lasciate riposare per una notte a temperatura ambiente.
6. Il giorno successivo, lavare il vetrino tre volte per 5 minuti ciascuna con tampone TBS-T. Lasciarlo asciugare in una zona buia come descritto al punto 4.2.
7. Preparare una miscela di anticorpi secondari simile al passaggio 4.4. Fare riferimento alla tabella dei reagenti per gli anticorpi secondari.
8. Posizionare il vetrino asciutto nella camera di colorazione come descritto nei passaggi 4.2 e 4.5. Aggiungere lentamente 500 μl di anticorpi secondari e coprire l'intera superficie. Avvolgere la camera di colorazione in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce esterna. Lasciarlo riposare coperto e al riparo dalla luce esterna per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
9. Dopo aver completato la colorazione secondaria, lavare il vetrino tre volte per 5 minuti ciascuna con tampone TBS-T. Lasciare asciugare il vetrino in una zona buia. Dopo l'asciugatura, mettere la soluzione di montaggio e coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti evitando accuratamente l'introduzione di bolle. Lasciare riposare il vetrino in un'area buia per almeno 2 ore prima della successiva analisi.
10. Eseguire analisi time-lapse o confocali sul tessuto colorato.

Risultati

La neurogenesi ippocampale adulta è un processo sequenziale in cui il tipo di cellula progenitrice rappresentativa in ogni stadio può essere identificato con una combinazione di marcatori. Un'attenta fissazione chimica e il recupero dell'antigene migliorano l'efficacia e l'accessibilità di marcatori altrimenti difficili da rilevare. Una di queste è la nestina, che è espressa tra le cellule staminali neurali radiali simili alla glia e alcuni tipi di cellule progenitrici attive precoci. La nestina può essere una proteina c...

Discussione

I passaggi più critici per il successo del recupero dell'antigene e della colorazione dei tipi di cellule progenitrici sono: 1) l'utilizzo di tessuto ben perfuso e fissato dello spessore coronale ottimale; 2) lasciando un tempo sufficiente per l'ebollizione e il successivo raffreddamento durante il recupero dell'antigene; 3) destrezza manuale nel montare sezioni coronali fisse e prevenire il loro danneggiamento quando lo si fa.

È fondamentale nell'IHC utilizzare tessuto perfuso che abbia subit...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino SuperFrost Plus	Fisherbrand	12-550-15	Fornisce una forte aderenza al tessuto ippocampale durante l'ebollizione
PVA/DABCO Terreno di montaggio	Sigma Aldrich	10981-100 ml
Nestina (pollo)	Aves Lab	NES	Marcatore di cellule staminali neurali
GFAP (coniglio)	Dako North America	Z033401-2	Marcatore di astrociti e cellule staminali neurali
MCM2 (topo)	Laboratorio di trasduzione BD	610701	Marcatore di proliferazione
DCX (capra)	Santa Cruz Biotechnology	SC8066	Marcatore di neuroni immaturi
Tbr2 (coniglio)	Abcam	Ab23345	Marcatore progenitore di amplificazione
NeuN (topo)	Millipore	MAB377	Marcatore di neuroni maturi
Cy2 (anti-coniglio)	Jackson Immunoresearch	111-226-047
Cy2 (anti-pollo)	Jackson Immunoresearch	303-165-006
Cy5 (anti-topo)	Jackson Immunoresearch	315-175-047
Cy5 (anti-capra)	Jackson Immunoresearch	305-165-047
DAPI	Life Technologies Corporation	D1306
Dako	Pen S2002	Dako	Penna idrorepellente