Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Summary

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Abstract

Gli sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di test in vitro per lo studio dei microvasi, perché in vivo sugli animali sono più in termini di tempo, costosa, e l'osservazione e quantificazione sono molto impegnativo. Tuttavia, convenzionale in microvasi saggi in vitro hanno dei limiti quando rappresentano in vivo microvasi rispetto alla geometria tridimensionale (3D) e di fornire il flusso del fluido continuo. Usando una combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica, abbiamo sviluppato un multi-profondità endothelialized trasversali circolari microcanali-on-a-chip, che imita la geometria 3D in vivo microvasi e gira sotto perfusione continua controllata flusso. Un fotoresist positivo reflowable stato usato per fabbricare uno stampo matrice con una rete di microcanali sezione trasversale semicircolare. Dall'allineamento e incollaggio dei due polidimetilsilossano (PDMS) microcanali replicated dallo stampo maestro, è stata creata una rete di microcanali cilindrica. I diametri dei microcanali possono essere ben controllate. Inoltre, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC primarie) seminate all'interno del chip hanno mostrato che le cellule allineate la superficie interna dei microcanali sotto perfusione controllata duraturo per un periodo di tempo compreso tra 4 giorni a 2 settimane.

Introduction

Microvasi, come parte del sistema di circolazione, mediare le interazioni tra sangue e tessuti, sostenere attività metaboliche, definire microambiente tissutale, e gioca un ruolo critico in molte condizioni patologiche e salute. Ricapitolazione dei microvasi funzionali in vitro potrebbe fornire una piattaforma per lo studio dei fenomeni vascolari complesse. Tuttavia, convenzionale in vitro microvasi saggi, come il test di migrazione delle cellule endoteliali, saggi di formazione endoteliali tubo, e di ratto e topo saggi anello aortico, sono in grado di ricreare in vivo microvasi rispetto a tre dimensioni (3D) geometria e il controllo di flu....

Protocol

1. Fotolitografia Fabbricazione di Photoresist Maestro Mold

Il seguente protocollo mostra il processo per fabbricare i microcanali con diametri tra 30-60 micron. Per ottenere un microcanali con un diametro più piccolo (meno di 30 um), un singolo spin-coating di photoresist è necessario.

1. Trasferire il photoresist reflow dal frigorifero a 4 ° C per la camera sterile 24 ore prima dell'uso e lasciarla a temperatura ambiente.
2. Pulire un wafer di silicio e cuocere per un ora a 150 ° C per lasciarlo disidratare. La disidratazione assisterà il photoresist adesione al substrato di silicio.
3. Spin-coat il primo strat....

Results

Il nostro approccio per fabbricare la rete di microcanali multi-profondità imita le complesse geometrie 3D di microvasi in vivo, in cui i microcanali sono arrotondate sezioni trasversali ^15. Inoltre, i diametri dei canali di ramificazione madri ei canali figlia circa obbediscono legge di Murray per mantenere il flusso di fluido ad un livello desiderato in modo che la resistenza complessiva del canale è bassa e velocità di flusso sono più uniforme in tutta la rete ^16-18. I processi e risult.......

Discussion

1. Muffa fabbricazione Maestro

Uno dei principi di progettazione e di guida per morfometria vascolare è nota come legge di Murray ^16, in cui si afferma che la distribuzione dei diametri dei vasi in tutta la rete è governata da corrispettivo minimo di energia. Si precisa inoltre che il cubo dei diametri di un vaso parente ad una biforcazione uguale alla somma dei cubi dei diametri dei vasi figlia (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente/Materiale
Developer	AZ Electronic Materials AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Terreno di coltura	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Colorazione	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 e PKH26GL
Fibronectina	Gibco	PHE0023
L-Glutammina	Sigma	G7513
Soluzione salina tamponata con fosfato	Invitrogen	14040-133
Soluzione salina tamponata HEPES	Lonza	CC-5024
Tripsina/EDTA	Invitrogen	25300-062
Soluzione neutralizzante della tripsina	Lonza	CC-5002
PDMS Agente indurente	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana	Lonza	CC-2517
Siero fetale bovino	Lonza	14-501F
Diluente C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Sonde molecolari	R37605
Destrano	Sigma	95771
3,5% Paraformaldeide	Microscopia elettronica	Scienza 15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/ Essiccatore LITE
	BelArt Prodotti	999320237
Microscopio invertito	Sistema	Eclipse Ti
	Apparecchio Harvard PHD	Cappa di
laminare	Thermo Scientific	Serie 1300 A2
Miscelatore centrifugo planetario	Thinky	ARE-310
Isotemp Forno	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscopio ottico	Zeiss	Invertoskop 40C
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Piastra riscaldante	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscopio confocale a scansione laser	Zeiss	LSM 510