Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Summary

Una piattaforma microcanali-on-a-chip è stato sviluppato dalla combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica. La piattaforma microcanali endothelialized imita il tridimensionale (3D) geometria in vivo microvasi, corre sotto flusso perfusione continua controllato, permette l'imaging di alta qualità e in tempo reale e può essere applicato per la ricerca microvascolare.

Abstract

Gli sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di test in vitro per lo studio dei microvasi, perché in vivo sugli animali sono più in termini di tempo, costosa, e l'osservazione e quantificazione sono molto impegnativo. Tuttavia, convenzionale in microvasi saggi in vitro hanno dei limiti quando rappresentano in vivo microvasi rispetto alla geometria tridimensionale (3D) e di fornire il flusso del fluido continuo. Usando una combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica, abbiamo sviluppato un multi-profondità endothelialized trasversali circolari microcanali-on-a-chip, che imita la geometria 3D in vivo microvasi e gira sotto perfusione continua controllata flusso. Un fotoresist positivo reflowable stato usato per fabbricare uno stampo matrice con una rete di microcanali sezione trasversale semicircolare. Dall'allineamento e incollaggio dei due polidimetilsilossano (PDMS) microcanali replicated dallo stampo maestro, è stata creata una rete di microcanali cilindrica. I diametri dei microcanali possono essere ben controllate. Inoltre, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC primarie) seminate all'interno del chip hanno mostrato che le cellule allineate la superficie interna dei microcanali sotto perfusione controllata duraturo per un periodo di tempo compreso tra 4 giorni a 2 settimane.

Introduction

Microvasi, come parte del sistema di circolazione, mediare le interazioni tra sangue e tessuti, sostenere attività metaboliche, definire microambiente tissutale, e gioca un ruolo critico in molte condizioni patologiche e salute. Ricapitolazione dei microvasi funzionali in vitro potrebbe fornire una piattaforma per lo studio dei fenomeni vascolari complesse. Tuttavia, convenzionale in vitro microvasi saggi, come il test di migrazione delle cellule endoteliali, saggi di formazione endoteliali tubo, e di ratto e topo saggi anello aortico, sono in grado di ricreare in vivo microvasi rispetto a tre dimensioni (3D) geometria e il controllo di flusso continuo ^1-8. Studi di microvasi utilizzando modelli animali e in vivo, come il saggio di angiogenesi corneale, pulcino corioallantoidea membrana saggio angiogenesi, e il dosaggio spina Matrigel, sono di più in termini di tempo, ad alto costo, sfidando rispetto alla osservazione e quantificazioni, esollevare questioni etiche ^{1, 9-13.}

I progressi nella micromanufacturing e tecnologie nell'ambito dei chip microfluidici hanno permesso una serie di intuizioni in scienze biomediche, mentre limitare gli alti costi sperimentali e le complessità associati con gli animali e in vivo studi ^14, come le condizioni biologiche controllate facilmente e saldamente e ambienti fluidi dinamici, che non avrebbero stato possibile con tecniche convenzionali macroscala.

Qui vi presentiamo un metodo per costruire un endothelialized microcanali-on-a-chip che imita la geometria 3D in vivo microvasi e gira sotto flusso di perfusione continua controllato utilizzando la combinazione di tecnica fotolitografica reflowable photoresist, litografia soft, e microfluidica.

Protocol

1. Fotolitografia Fabbricazione di Photoresist Maestro Mold

Il seguente protocollo mostra il processo per fabbricare i microcanali con diametri tra 30-60 micron. Per ottenere un microcanali con un diametro più piccolo (meno di 30 um), un singolo spin-coating di photoresist è necessario.

1. Trasferire il photoresist reflow dal frigorifero a 4 ° C per la camera sterile 24 ore prima dell'uso e lasciarla a temperatura ambiente.
2. Pulire un wafer di silicio e cuocere per un ora a 150 ° C per lasciarlo disidratare. La disidratazione assisterà il photoresist adesione al substrato di silicio.
3. Spin-coat il primo strato di fotoresist usando la seguente ricetta:

Passo	Tempo (secondi)	Velocità (rpm)	Accelerazione
1	2	300	più alto
2	10	0
3	3	300	più alto
4	60	600	più alto
5	10	500	più alto
6	10	600	più alto

4. Poi, cuocere il wafer su una piastra con una temperatura di 110 ° C per 90 sec. Dopo la cottura morbida lo spessore del fotoresist sarà 20-30 micron.
5. Spin cappotto un secondo strato di fotoresist con la stessa formulazione utilizzata per il primo strato.
6. Morbido cuocere nuovamente il wafer ponendolo su una piastra con una temperatura di 110 ° C per 90 sec. Dopo questa cuocere morbido lo spessore del fotoresist sarà 40-60 micron.
7. Generare i modelli maestri positivi esponendo il PhotoRESIST a luce UV con una dose di esposizione di 14.500 mJ / cm ² attraverso una maschera pellicola.
8. Diluire la sviluppatore con deionizzata (DI) (1:2 (v / v)). Risciacquare il wafer ripetutamente nella soluzione fino a quando il modello è completamente sviluppato. Quindi lavare il wafer con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.
9. Reflow: Posizionare il wafer su una piastra con una temperatura di 120 ° C per 4 min e coprire con un piatto di vetro Petri per evitare l'evaporazione del solvente. Togliere la cialda dalla piastra e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente. Lo spessore fotoresist dopo la rifusione sarà 50-60 micron.

2. Morbido litografia Fabbricazione di PDMS Microchannel Network

1. Preparare polydimethylsiloxane soluzione (PDMS) al rapporto di peso di 10:1 (base: catalizzatore) e mescolare accuratamente con un mescolatore planetario centrifuga.
2. Gettate la soluzione PDMS sullo stampo maestro photoresist ridisposto. Posizionare il PDMS colato in un essiccatore per 15 minuti a Degas. Usare il gas azoto per eliminare eventuali bolle rimanenti se necessario.
3. Cuocere la PDMS in forno ad una temperatura di 60 ° C per 3 ore per permettere a polimerizzare. Quindi rimuovere lo strato di PDMS curata dallo stampo master.
4. Usare un perforatore affilato per creare fori di ingresso / uscita da buchi nella rete di canali di punzonatura. Pulire la superficie del PDMS con gas azoto.
5. Trattare due strati PDMS con plasma di ossigeno per 30 secondi all'interno di un pulitore plasma ad una pressione di 4,5 x 10 ^-2 Torr e un flusso di ossigeno di 3,5 m ³ / min. Poi, allineare le superfici del PDMS manualmente al microscopio ottico. Utilizzare una goccia d'acqua, se necessario per un migliore controllo dell'allineamento.
6. Cuocere il dispositivo in un forno a 60 ° C per 30 minuti per ottenere l'unione permanente.

3. Cultura HUVEC e semina nel chip

1. Cultura delle HUVEC con terreno di coltura con la L-glutamina supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS). Per Thsono stati utilizzati posta esperimento passaggi tra 2 e 5.
2. Una volta che le HUVEC sono confluenti, contare le cellule e raccoglierle dalle prime risciacquo le cellule con soluzione salina tamponata con HEPES (HEPES-BSS), e poi trattare le cellule con tripsina / EDTA e incubare per 2-6 minuti a 37 ° C. Dopo la tripsinizzazione è completa, neutralizzare la tripsina / EDTA soluzione neutralizzante con tripsina. Centrifugare e sospendere le cellule nel terreno di coltura con l'8% di destrano per raccoglierli. Destrano è stato usato per aumentare la media viscosità per facilitare una migliore semina cellulare e attaccamento.
3. Trattare il dispositivo con plasma di ossigeno per 5 minuti con una pressione di 4,5 x 10 ^-2 Torr e un flusso di ossigeno di 3,5 m ³ / min. Quindi caricare il dispositivo con acqua deionizzata e trattare con la luce UV per 8 ore in un biosicurezza cappa laminare per la sterilizzazione.
4. Un giorno prima che le cellule sono pronte, lavare l'apparecchio con 1x tampone fosfato (PBS 1x) poi cappotto con fibronectina (100 mg / ml, dilbuite con 1x PBS) e incubare in frigorifero a 4 ° C durante la notte.
5. Dopo il rivestimento fibronectina, lavare il dispositivo con PBS 1x quindi caricare con mezzo di coltura. Incubare il dispositivo a una temperatura di 37 ° C per 15 min.
6. Caricare le cellule HUVEC in 8% destrano mezzo di coltura con una concentrazione cellulare di 3-4 x 10 ⁶ cellule / ml. Posizionare una gocciolina 20 microlitri di cellule ad un ingresso del dispositivo e inclinarlo introdurre le cellule nel canale microfluidica. Dopo 15-20 minuti le cellule cominceranno ad attribuire alle pareti laterali dei canali. Ruotare il dispositivo ogni 15 min per creare una distribuzione più uniforme delle cellule. Se necessario, un carico addizionale può essere eseguita.

4. Setup perfusione a lungo termine

Dopo 5-6 ore di cultura statica, i HUVECs allegate inizieranno a diffondersi completamente fuori. Impostare perfusione utilizzando un sistema di pompa a siringa con telecomando e un flusso costante di 10 ml / h. Perfusione può essere regolato fo una portata maggiore, e può durare per un periodo di tempo compreso tra 4 giorni a 2 settimane.

5. Cella di colorazione e del microscopio Caratterizzazione

1. Quando le cellule raggiungono confluenza all'interno del dispositivo, in primo luogo, lavare il dispositivo con 1x PBS per rimuovere completamente il mezzo. Quindi caricare il dispositivo con colorante rosso diluito con diluente (4 microlitri-1 ml). Caricare il colorante simile alla procedura di caricamento delle cellule. Incubare il dispositivo al buio per 5 minuti a temperatura ambiente, e poi lavare il dispositivo con terreno di coltura per fermare la colorazione. Lunga incubazione del colorante può causare tossicità cellulare e disadhesion.
2. Caricare il dispositivo con il colorante blu diluito con PBS 1x (2 gocce per ml). Incubare al buio per 5 minuti a temperatura ambiente, poi lavare accuratamente il dispositivo con PBS 1x.
3. Esaminare la colorazione delle cellule al microscopio ottico invertito. Se la colorazione è stata buona, caricare i microcanali con il mezzo di fissaggio (3,5% paraformaldeide diluito con PBS 1x), quindi immergereil dispositivo di fissaggio a medio e coprire completamente con foglio di alluminio. Conservare il dispositivo in frigorifero a una temperatura di 4 ° C per evitare che il dispositivo si secchi e photobleaching. Il dispositivo fisso è ora pronto per l'imaging confocale, che può essere fatto da un microscopio confocale a scansione laser.

Results

Il nostro approccio per fabbricare la rete di microcanali multi-profondità imita le complesse geometrie 3D di microvasi in vivo, in cui i microcanali sono arrotondate sezioni trasversali ^15. Inoltre, i diametri dei canali di ramificazione madri ei canali figlia circa obbediscono legge di Murray per mantenere il flusso di fluido ad un livello desiderato in modo che la resistenza complessiva del canale è bassa e velocità di flusso sono più uniforme in tutta la rete ^16-18. I processi e risult...

Discussion

1. Muffa fabbricazione Maestro

Uno dei principi di progettazione e di guida per morfometria vascolare è nota come legge di Murray ^16, in cui si afferma che la distribuzione dei diametri dei vasi in tutta la rete è governata da corrispettivo minimo di energia. Si precisa inoltre che il cubo dei diametri di un vaso parente ad una biforcazione uguale alla somma dei cubi dei diametri dei vasi figlia (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente/Materiale
Developer	AZ Electronic Materials AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Terreno di coltura	Invitrogen	10372-019
NacBlue Nuclei Colorazione	Invitrogen	H1399
PKH Red Stain	Sigma	MINI26 e PKH26GL
Fibronectina	Gibco	PHE0023
L-Glutammina	Sigma	G7513
Soluzione salina tamponata con fosfato	Invitrogen	14040-133
Soluzione salina tamponata HEPES	Lonza	CC-5024
Tripsina/EDTA	Invitrogen	25300-062
Soluzione neutralizzante della tripsina	Lonza	CC-5002
PDMS Agente indurente	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana	Lonza	CC-2517
Siero fetale bovino	Lonza	14-501F
Diluente C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, Sonde molecolari	R37605
Destrano	Sigma	95771
3,5% Paraformaldeide	Microscopia elettronica	Scienza 15710-S
Equipment
Spinner	Laurell Technologies Corporation	WS-400BZ-6NPP/ Essiccatore LITE
	BelArt Prodotti	999320237
Microscopio invertito	Sistema	Eclipse Ti
	Apparecchio Harvard PHD	Cappa di
laminare	Thermo Scientific	Serie 1300 A2
Miscelatore centrifugo planetario	Thinky	ARE-310
Isotemp Forno	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscopio ottico	Zeiss	Invertoskop 40C
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Piastra riscaldante	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscopio confocale a scansione laser	Zeiss	LSM 510