Identificazione di specifiche popolazioni di neuroni sensoriali per lo studio dei canali ionici espressi

Sommario

I neuroni sensoriali afferenti segnalano informazioni sensoriali dalla periferia al sistema nervoso centrale. L'identificazione di specifici neuroni afferenti aiuterà a comprendere la loro fisiologia. Descriviamo un metodo di marcatura retrograda per identificare i neuroni afferenti e studiamo i canali ionici voltaggio-dipendenti in questi neuroni utilizzando l'elettrofisiologia del patch clamp e l'immunocitochimica.

Abstract

I neuroni sensoriali trasmettono segnali da varie parti del corpo al sistema nervoso centrale. Il soma per questi neuroni si trova nei gangli della radice dorsale che rivestono la colonna vertebrale. Comprendere i recettori e i canali espressi da questi neuroni afferenti sensoriali potrebbe portare a nuove terapie per la malattia. Il passo iniziale è identificare il sottoinsieme specifico di neuroni sensoriali di interesse. Qui descriviamo un metodo per identificare i neuroni afferenti che innervano i muscoli mediante marcatura retrograda utilizzando un colorante fluorescente DiI (1,1'-diottadil-3,3,3',3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato). Comprendere il contributo dei canali ionici all'eccitazione delle afferenze muscolari potrebbe aiutare a controllare meglio l'eccessiva eccitabilità indotta da alcuni stati patologici come la malattia vascolare periferica o l'insufficienza cardiaca. Abbiamo utilizzato due approcci per identificare i canali ionici voltaggio-dipendenti espressi da questi neuroni, l'elettrofisiologia del patch clamp e l'immunocitochimica. Mentre l'elettrofisiologia e i bloccanti farmacologici possono identificare i tipi di canali ionici funzionali, abbiamo utilizzato l'immunocitochimica per identificare i canali per i quali non erano disponibili bloccanti specifici e per comprendere meglio il modello di distribuzione dei canali ionici nella popolazione cellulare. Queste tecniche possono essere applicate ad altre aree del sistema nervoso per studiare specifici gruppi neuronali.

Introduzione

I gangli della radice dorsale (DRG) sono costituiti da soma provenienti da neuroni afferenti che innervano varie parti del corpo e importanti intuizioni possono essere ottenute dallo studio dei neuroni sensoriali con diversi bersagli di innervazione¹. Vari metodi indiretti o invasivi vengono utilizzati per isolare e identificare i neuroni afferenti, ad esempio iniettando nel nervo marcatori come il fluorogold¹, iniettando colorante nei muscoli con il metodo chirurgico². Tra i diversi coloranti che sono stati utilizzati con successo per marcare i neuroni e i tratti neuronali, i coloranti fluorescenti come DiI sono ampiamente utilizzati nei tracciati neuroanatomici a causa del loro rapido assorbimento da parte dei terminali dei neuroni, della ritenzione a lungo termine nei neuroni e della mancanza di trasferimento tra i neuroni³. I neuroni afferenti marcati con DiI possono essere facilmente visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza per uno studio dettagliato. Tuttavia, una limitazione è che marcatori come DiI possono essere persi dalle cellule durante la permeabilizzazione cellulare necessaria per l'immunocitochimica con epitopi intracellulari⁴. Qui descriviamo un metodo che utilizza DiI iniettato nel muscolo scheletrico per identificare i neuroni afferenti muscolari nel DRG. Descriviamo anche un metodo di permeabilizzazione cellulare che trattiene DiI nel neurone consentendo l'accesso degli anticorpi agli epitopi intracellulari. Dimostriamo l'uso sia dell'elettrofisiologia del patch clamp che dell'immunocitochimica per studiare questi neuroni identificati, oltre a descrivere i vantaggi distinti di ciascuna tecnica nello studio dei canali ionici che controllano l'eccitabilità neuronale. Infine, descriviamo i potenziali problemi che possono ostacolare l'interpretazione dei dati elettrofisiologici. Abbiamo utilizzato questi metodi per identificare i neuroni afferenti muscolari e cutanei e determinare i canali del sodio voltaggio-dipendenti (NaV) espressi in questi neuroni identificati⁸. Tuttavia, questi metodi possono essere adattati a una varietà di preparati per lo studio di sottogruppi identificati di neuroni che innervano un particolare tessuto bersaglio o nucleo cerebrale.

Protocollo

Nota: Tutti i lavori sugli animali devono essere eseguiti secondo le linee guida istituzionali e per la cura degli animali.

1. Preparazione dell'animale ed etichettatura

1. Anestetizzare i ratti: anestetizzare un ratto (in genere 150-400 g) utilizzando un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (50 mg/kg di peso corporeo), xilazina (5 mg/kg) e acepromazina (1 mg/kg). Controlla i riflessi pizzicando il piede, attendi che non ci sia risposta. Poiché la risposta all'anestesia varia tra gli animali, è meglio determinare l'effetto degli anestetici testando i riflessi del dolore.
2. Soluzione DiI: Pesare la polvere DiI e scioglierla in DMSO sterile al 100% per ottenere una soluzione all'1,5% (15 mg/ml). Conservare la soluzione a temperatura ambiente in atmosfera asciutta fino al momento dell'uso.
3. Iniezioni DiI: radere i peli sulla zona del polpaccio su entrambe le gambe del ratto anestetizzato usando un rasoio elettrico.
   1. Riempire una siringa sterile da 1 ml (11/4 in ago da 27 G) con 200 μl di soluzione DiI all'1,5%. Inserire lentamente l'ago parallelamente all'asse lungo di ciascun muscolo gastrocnemio e iniettare 100 μl di DiI nel muscolo mentre si allontana lentamente l'ago dal muscolo (~10 sec) senza ritirarsi dal muscolo.
   2. Prima di estrarre l'ago dal muscolo, tirare indietro lo stantuffo della siringa per assicurarsi che il colorante non fuoriesca più dalla punta, attendere 10 secondi, quindi estrarre l'ago dal muscolo. Questo passaggio impedisce la fuoriuscita di DiI dall'ago sulla pelle, che potrebbe etichettare le afferenze cutanee.
   3. Ripetere per l'altra gamba.
   4. Attendere 4-5 giorni affinché il DiI venga trasportato dal muscolo al DRG.

2. Dissezione e isolamento neuronale

1. soluzioni:
   1. Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e la soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) secondo le istruzioni del produttore, filtrare, sterilizzare e conservare a 4 °C.
   2. Terreni di coltura (MEM Plus): Miscelare 89 ml di terreni essenziali minimi (MEM), 10 ml di siero fetale bovino (FBS), 1 ml di soluzione di penicillina-streptomicina, filtrare sterilizzare e conservare a 4 °C.
   3. Soluzione di polilisina: sciogliere la polvere di bromuro di poli-L-lisina (10 mg/100 ml) in una soluzione di borato di sodio 0,1 M, pH 8,4, filtrare, sterilizzare e conservare le aliquote a -20 °C.
2. Vetrini coprioggetti di rivestimento
   1. Pulire i vetrini coprioggetti (12 mm rotondi) in etanolo al 70% per 3-4 ore e asciugarli all'aria in una cappa di coltura sterile.
   2. Mettere i vetrini coprioggetti secchi nella soluzione di polilisina O/N.
   3. Togliere dalla soluzione di polilisina e lavare in acqua distillata sterile 2 volte per 5 minuti ciascuna per rimuovere l'eccesso di polilisina.
   4. Separare i vetrini, asciugare nella cappa di coltura e conservare a 4 ^oC.
3. Preparazione per la dissezione
   1. Mettere sul ghiaccio un becher con 10 ml di HBSS, una piastra di Petri da 35 mm e una piastra di Petri da 100 mm.
   2. Pesare gli enzimi: 7 mg di collagenasi, 1 mg di DNAsi e 10 mg di tripsina.
   3. Preriscaldare un bagnomaria agitato a 37 ^oC e immergere nella vasca una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 10 ml di EBSS per riscaldare.
4. dissezione:
   1. Sacrificare il ratto secondo un protocollo approvato dall'IACUC. Il biossido di arbon è stato utilizzato per l'eutanasia del ratto.
   2. Rimuovere rapidamente la schiena tagliando la pelle sulla schiena, rimuovere il tessuto connettivo e muscolare lungo la colonna vertebrale per una migliore esposizione e rimuovere la sezione lombare della colonna vertebrale (estremità della regione toracica all'osso iliaco; Figura 1).
   3. Posizionare la colonna vertebrale isolata nella capsula di Petri da 100 mm e, utilizzando una pipetta sterile Pasteur, applicare la soluzione HBSS refrigerata per mantenere la preparazione umida e fredda.
   4. Taglia i muscoli dai lati della colonna vertebrale. Eseguire una laminectomia dorsale, utilizzando rongeurs o forbici, e rimuovere delicatamente l'osso che racchiude le recesse contenenti il DRG.
   5. Applicare ripetutamente HBSS ghiacciato (~1 ml) durante questa procedura.
   6. Isolare il DRG tagliando i nervi periferici e centrali (lasciando 1-2 mm di nervo per facilitare la manipolazione dei gangli)
   7. Posizionare il DRG isolato nella piastra di Petri da 35 mm contenente il tampone HBSS ghiacciato.
   8. Ripetere fino a quando tutti i DRG L-4 e L-5 sono stati isolati. Il DRG toracico può essere isolato ed elaborato separatamente come controllo negativo per la marcatura DiI.
   9. Posizionare la piastra con DRG isolato sotto un microscopio da dissezione e rimuovere i nervi e i vasi sanguigni in eccesso utilizzando micro forbici e pinze.
   10. Aprire il DRG per una migliore esposizione agli enzimi, ma non rivestire il DRG.
5. Dissociazione dei neuroni DRG:
   1. Aggiungere gli enzimi nel terreno caldo EBSS (tenuto a bagnomaria). Agitare brevemente per sciogliere e filtrare sterilizzare.
   2. Utilizzando una pipetta sterile Pasteur, inserire tutto il DRG nella soluzione enzimatica. Ridurre al minimo il volume di HBSS aggiunto con DRG poiché l'HBSS diluirà la miscela enzimatica. Gasare il pallone con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂ per 60 secondi prima di tappare ermeticamente il pallone.
   3. Incubare il matraccio nel bagnomaria agitato a 37 °C per 60 minuti a 240 giri/min.
   4. Al termine dell'incubazione, agitare energicamente il pallone 50x per dissociare il DRG⁵.
   5. In condizioni sterili, aggiungere 5 ml di MEM Plus al pallone per fermare gli enzimi.
   6. Trasferire il contenuto del pallone in una provetta da centrifuga sterile da 15 ml e centrifugare a 16 x g per 6 minuti.
   7. Rimuovere ed eliminare il surnatante, aggiungere 5 ml di MEM Plus al campione. Triturare delicatamente con la pipetta per rompere il pellet.
   8. Ripetere la fase di centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante e aggiungere 500 μl di MEM Plus. Triturare delicatamente con un puntale da 1 ml su una pipetta per ottenere una sospensione cellulare.
   9. Posizionare un vetrino coprioggetti in vetro rivestito di polilisina in una capsula sterile vuota da 35 mm. Aggiungere una goccia (~50 μl) della sospensione cellulare al centro del vetrino coprioggetti.
   10. Ripetere fino all'esaurimento della soluzione cellulare.
   11. Posizionare le piastre da 35 mm in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂ per 1 ora per consentire ai neuroni di aderire ai vetrini.
   12. Aggiungere altri 2 ml di terreno in ogni piatto e rimettere nell'incubatrice.

3. Registrazione Patch Clamp

1. Soluzioni per la registrazione: queste soluzioni servono per la registrazione delle correnti NaV. Esempi di soluzioni con composizione diversa possono essere trovati in questi riferimenti^5-7.
   1. Soluzione esterna: (in mM) 45 NaCl, 100 N-metil-d-glucamina (NMG)•Cl, 4 MnCl₂, 10 Na•HEPES e 10 glucosio, con pH = 7,4 e osmolarità = 320 mOsm.
   2. Soluzione interna: (in mM) 104 NMG•Cl, 14 Creatina•PO₄, 6 MgCl₂, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG₂•EGTA e 0,3 Tris₂•GTP con pH 7,4 e osmolarità = 300 mOsm.
2. Misura delle correnti ioniche:
   1. Estrarre gli elettrodi di registrazione dai capillari di vetro su un estrattore di elettrodi e lucidare a caldo le punte utilizzando una microforgia. La resistenza degli elettrodi è tipicamente di 2-3 MΩ
   2. Identificare i neuroni DRG marcati con DiI utilizzando un microscopio con epifluorescenza e un cubo TRITC. DiI ha una lunghezza d'onda di eccitazione di 550 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 570 nm.
   3. Riempire l'elettrodo di vetro con la soluzione interna (limare solo ~ 1 cm della punta dell'elettrodo) e picchiettare delicatamente per rimuovere eventuali bolle intrappolate. Posizionare nel portaelettrodo e passare alla cella utilizzando un micromanipolatore.
   4. Una volta che l'elettrodo tocca la cella, applicare un'aspirazione delicata attraverso il tubo di aspirazione, fino a formare una tenuta ermetica (determinata dall'aumento della resistenza dell'elettrodo).
   5. Clamp la tensione della membrana al potenziale di mantenimento desiderato (tipicamente da -60 a -120 mV).
   6. Ottenere la configurazione del patch clamp a cella intera applicando un'aspirazione più forte per rimuovere il patch della membrana sulla punta dell'elettrodo. La transizione verso la configurazione a cella intera si osserva elettricamente come un aumento della corrente capacitiva^8-10.
   7. Compensare la resistenza in serie utilizzando il circuito di compensazione dell'amplificatore patch clamp (utilizzare almeno l'80% di compensazione)^8,10.

4. Immunocitochimica

1. Fissare i neuroni sui vetrini coprioggetti con paraformaldeide al 4% per 1 ora e poi permeabilizzare con Tween 20 al 2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 10 minuti.
2. Incubare le cellule fissate O/N in una soluzione bloccante (siero normale o albumina sierica bovina) più l'anticorpo primario, che è un anticorpo sviluppato per legarsi a un antigene specifico di interesse.
3. Incubare un set di controllo di neuroni O/N in una soluzione bloccante priva degli anticorpi primari.
4. Lavare i vetrini coprioggetti con tampone PBS 3 volte per 5 minuti, seguiti da 2 lavaggi di 5 minuti ciascuno con l'1% di Tween 20 per rimuovere l'anticorpo primario non legato.
5. Incubare i vetrini coprioggetti con l'anticorpo secondario con marcatura fluorescente appropriata, che si lega all'anticorpo primario per consentire la visualizzazione.
6. Lavare i vetrini coprioggetti con PBS 3 volte per 5 minuti per rimuovere l'eccesso di anticorpi secondari.
7. Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino pulito utilizzando un supporto di montaggio.
8. Applicare lo smalto trasparente sul bordo del vetrino coprioggetti per fissarlo in posizione. Una volta asciutti, visualizzare i neuroni e acquisire immagini utilizzando il software che accompagna il microscopio a fluorescenza.
   Nota: In questo lavoro, è stato utilizzato un microscopio Nikon con il software NIS-elements BR 3.2. Il tempo di esposizione è stato ottimizzato e mantenuto lo stesso per i vetrini di controllo e di prova.
9. Misura l'intensità della fluorescenza e le dimensioni delle cellule dei singoli neuroni utilizzando un software di imaging come ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Risultati

Utilizzando il metodo qui descritto, abbiamo identificato i neuroni afferenti muscolari in DRG e siamo passati a determinare i canali del sodio voltaggio-dipendenti (NaV) espressi da questi neuroni. I neuroni afferenti muscolari marcati con DiI (Figura 1C) comprendevano una piccola frazione della popolazione totale di neuroni nel DRG con una media del 16% di neuroni (167/1047) etichettati. La quantificazione è stata effettuata misurando prima la fluorescenza utilizzando ImageJ e tracciando istogrammi dei...

Discussione

Le afferenze muscolari originate dai muscoli tricipiti surali (ad es. gastrocnemio) sono state utilizzate in diversi studi per studiare il riflesso pressorio da sforzo (EPR)¹³. Dato l'interesse per lo studio dei neuroni sensoriali che mediano l'EPR, i muscoli gastrocnemio sono stati selezionati per l'iniezione di colorante. DiI è stato scelto per la sua natura lipofila e perché non viene perso dal neurone per diffusione attraverso la membrana plasmatica intatta^3,14. Usando questo metodo com...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6 / 1.7 e 1.9	Alamone Labs, Gerusalemme, Israele	ASC- 001 / 009 /008 /017
Alexa Fluor anticorpi secondari	Invitrogen
Siero
Fluoro-Gel	Microscopia elettronica Scienze	17985