Identificazione di specifiche popolazioni di neuroni sensoriali per lo studio dei canali ionici espressi

Sommario

I neuroni sensoriali afferenti segnalano informazioni sensoriali dalla periferia al sistema nervoso centrale. L'identificazione di specifici neuroni afferenti aiuterà a comprendere la loro fisiologia. Descriviamo un metodo di marcatura retrograda per identificare i neuroni afferenti e studiamo i canali ionici voltaggio-dipendenti in questi neuroni utilizzando l'elettrofisiologia del patch clamp e l'immunocitochimica.

Abstract

I neuroni sensoriali trasmettono segnali da varie parti del corpo al sistema nervoso centrale. Il soma per questi neuroni si trova nei gangli della radice dorsale che rivestono la colonna vertebrale. Comprendere i recettori e i canali espressi da questi neuroni afferenti sensoriali potrebbe portare a nuove terapie per la malattia. Il passo iniziale è identificare il sottoinsieme specifico di neuroni sensoriali di interesse. Qui descriviamo un metodo per identificare i neuroni afferenti che innervano i muscoli mediante marcatura retrograda utilizzando un colorante fluorescente DiI (1,1'-diottadil-3,3,3',3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato). Comprendere il contributo dei canali ionici all'eccitazione delle afferenze muscolari potrebbe aiutare a controllare meglio l'eccessiva eccitabilità indotta da alcuni stati patologici come la malattia vascolare periferica o l'insufficienza cardiaca. Abbiamo utilizzato due approcci per identificare i canali ionici voltaggio-dipendenti espressi da questi neuroni, l'elettrofisiologia del patch clamp e l'immunocitochimica. Mentre l'elettrofisiologia e i bloccanti farmacologici possono identificare i tipi di canali ionici funzionali, abbiamo utilizzato l'immunocitochimica per identificare i canali per i quali non erano disponibili bloccanti specifici e per comprendere meglio il modello di distribuzione dei canali ionici nella popolazione cellulare. Queste tecniche possono essere applicate ad altre aree del sistema nervoso per studiare specifici gruppi neuronali.

Introduzione

I gangli della radice dorsale (DRG) sono costituiti da soma provenienti da neuroni afferenti che innervano varie parti del corpo e importanti intuizioni possono essere ottenute dallo studio dei neuroni sensoriali con diversi bersagli di innervazione¹. Vari metodi indiretti o invasivi vengono utilizzati per isolare e identificare i neuroni afferenti, ad esempio iniettando nel nervo marcatori come il fluorogold¹, iniettando colorante nei muscoli con il metodo chirurgico². Tra i diversi coloranti che sono stati utilizzati con successo per marcare i neuroni e i tratti neuronali, i coloranti fluorescenti come DiI sono ampiamente ut....

Protocollo

Nota: Tutti i lavori sugli animali devono essere eseguiti secondo le linee guida istituzionali e per la cura degli animali.

1. Preparazione dell'animale ed etichettatura

1. Anestetizzare i ratti: anestetizzare un ratto (in genere 150-400 g) utilizzando un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (50 mg/kg di peso corporeo), xilazina (5 mg/kg) e acepromazina (1 mg/kg). Controlla i riflessi pizzicando il piede, attendi che non ci sia risposta. Poiché la risposta all'anestesia varia tra gli animali, è meglio determinare l'effetto degli anestetici testando i riflessi del dolore.
2. Soluzione DiI: Pesare la polvere D....

Risultati

Utilizzando il metodo qui descritto, abbiamo identificato i neuroni afferenti muscolari nei gangli della radice dorsale (DRG) e abbiamo proseguito determinando i canali del sodio attivati dal voltaggio (NaV) espressi da questi neuroni. I neuroni afferenti muscolari marcati con DiI (Figura 1C) costituivano una piccola frazione dell'intera popolazione neuronale nei DRG, con una media del 16% dei neuroni (167 su 1047) marcati. La quantificazione è stata effettuata misurando inizialmente la fluorescenza medi.......

Discussione

Le afferenze muscolari originate dai muscoli tricipiti surali (ad es. gastrocnemio) sono state utilizzate in diversi studi per studiare il riflesso pressorio da sforzo (EPR)¹³. Dato l'interesse per lo studio dei neuroni sensoriali che mediano l'EPR, i muscoli gastrocnemio sono stati selezionati per l'iniezione di colorante. DiI è stato scelto per la sua natura lipofila e perché non viene perso dal neurone per diffusione attraverso la membrana plasmatica intatta^3,14. Usando questo metodo com.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6 / 1.7 e 1.9	Alamone Labs, Gerusalemme, Israele	ASC- 001 / 009 /008 /017
Alexa Fluor anticorpi secondari	Invitrogen
Siero
Fluoro-Gel	Microscopia elettronica Scienze	17985

di capra normale