Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

I neuroni stabiliscono il complesso essenziale circuiteria per la funzione del sistema nervoso centrale e periferico elaborando dendriti ricevere informazioni e assoni, spesso molto lunghe, per comunicare con i neuroni a valle. Crescita dei neuriti gioca un ruolo fondamentale durante lo sviluppo embrionale e la differenziazione e la manutenzione di neuriti neuronale supporta criticamente la funzione del sistema nervoso. Processi neuritic dispongono inoltre criticamente in danno neuronale e rigenerazione, così come disturbi del sistema nervoso. Lo studio di architettura neuronale è fondamentale per capire sia il cervello normale e malato. Fortunatamente, fisiologicamente rilevanti sistemi di coltura di cellule neuronali esistono che possono ricapitolare strutture cellulari complesse ed eterogenee. Sulla base della spiegazione di piattaforme sperimentali solide strategie di visualizzazione efficaci che consentano analisi qualitative e quantitative di morfologia neuronale sono necessari. Particolarmente utile sarebbeuna metodologia dettagliata che fornisce una piattaforma coerente per la visualizzazione neuriti, sia assoni e dendriti in scala nanometrica.

Microscopia elettronica tradizionale richiede l'uso di solventi organici durante la disidratazione e l'incorporamento resina, che può indurre distorsioni nei campioni dal loro vero stato. Ad oggi, la maggior parte delle caratterizzazioni strutturali a scala nanometrica sono basati su cellule o tessuti più grandi che sono sottoposti a tali sostanze chimiche aggressive - limitando così l'interpretazione dei risultati ^4,9,25. Inoltre, per la penetrazione fascio di elettroni, sezionamento è necessaria per gli organismi o sporgenze cellulari che presentano uno spessore maggiore di 1 micron ^12. Infine, sezionato o lavorato risultati tessuto in collezione di insiemi di dati discreti specifico slice, rendendo ingombrante la definizione della funzione allungata di neuriti. Anche per crio-EM, in cui sezionando un campione congelato-idratato è possibile, il metodo introduce artif compressioneatti ^1.

Negli ultimi anni, i ricercatori hanno imparato a coltivare i neuroni dell'ippocampo direttamente su griglie EM e-flash congelamento loro in etano liquido per visualizzare successivamente neuriti con crio-ET ^8,10,18,23. Tuttavia, tali studi né usano un dispositivo su misura ^10,23, oppure dettagli mancanza sul gradino assorbente per la generazione di ghiaccio vitreo abbastanza sottile per la visualizzazione di routine ^8,18. Per esempio, uno studio raccomanda l'uso di 30-40 sec per blotting griglia EM ^10, tuttavia, questo valore non è ottimizzata per uso generale, ma è specifico per il dispositivo-tuffo congelamento misura. Utilizzando un dispositivo su misura, piuttosto che un disponibile in commercio un ¹⁷ per mantenere l'umidità prima di immergersi congelamento del campione potrebbe rappresentare un ostacolo per la diffusa riproducibilità.

Anche se questi studi sono stati Innovativo nel visualizzare neuriti da crio-ET, abbiamo compiuto un ulteriore passo avanti per esplorare l'applicability di crio-ET ad una varietà di esemplari neuronali (ippocampo e gangli delle radici dorsali neuroni). Inoltre, si discute sia i risultati ottimali e non ottimali, così come i potenziali artefatti che si potrebbe riscontrare utilizzando crio-ET per tali esemplari.

Definizione di una tecnica dettagliata per la conservazione e la visualizzazione di neuriti interi su scala nanometrica in uno stato quasi native aumenterebbe la possibilità per i più ricercatori di effettuare studi ultrastrutturali. A tal fine, si descrive un protocollo efficace e dettagliato utilizzando apparecchiature disponibili in commercio per la preparazione non fissati, i neuroni non colorati per visualizzare neuriti. Questo è un primo importante passo verso dettagliare l'ultrastruttura dei neuriti sani e di gettare le basi per capire quali sono presenti in modelli di malattia del sistema nervoso differenze strutturali. Poiché crio-ET in grado di risolvere non fissate, le caratteristiche dei neuriti non colorati in 3-D su scala nanometrica, il metodo renderà possibile, come mai esserepertanto definire architettura neuritic ^12.

1. Preparazione di piatti con EM griglie per la placcatura neuroni primari

1. Esaminare l'integrità di carbonio bucata sulle griglie oro EM utilizzando un microscopio ottico a ingrandimento di almeno 25X. Assicurarsi che i fori di carbonio sono> 98% intatto.
2. Per placcatura neuroni primari, utilizzare un becco Bunsen a fiamma sterilizzare le griglie EM e contemporaneamente renderli idrofilo. Utilizzare le pinzette per raccogliere la griglia di EM per il bordo, non è la zona reticolata centrale. ATTENZIONE: Non lasciare mai un becco Bunsen acceso incustodito, e non utilizzare guanti o pinze con componenti in plastica durante l'esecuzione di questi passaggi:
   1. Prima di accendere il bruciatore Bunsen, impostare le regolazioni aria e gas in una posizione minimamente aperta.
   2. Accendere il becco Bunsen con una selce attaccante o butano.
   3. Modificare le regolazioni aria e gas per ottenere un piccolo, fiamma interiore blu all'interno di un più alto, più leggera fiamma blu / violetto. La punta della fiamma interiore è la parte più calda della fiamma. La manopola sottoneath il bruciatore regola la quantità di gas di penetrare nel tubo del bruciatore, mentre la canna del bruciatore può essere ruotata per regolare la quantità di aria che entra nel bruciatore. Ruotando la regolazione dell'aria in senso orario diminuisce l'aria (risultante in una fiamma viola) e in senso antiorario, l'aria (risultante in una fiamma gialla).
   4. Con una pinzetta in metallo (senza parti in plastica) per tenere la griglia di EM, passare rapidamente attraverso la fiamma per due volte, di fronte carbonio-side up. Il lato carbonio apparirà più opaco (meno lucida) e con più di una tinta grigio rispetto al lato opposto.
   5. Trasferire immediatamente la griglia (carbonio-lato alto) nel centro del piatto fondo di vetro collocato entro 10 cm dal becco Bunsen. Utilizzare una griglia di EM per ogni piatto (Figura 1). Utilizzare solo piatti con fondo di vetro che sono presterilized, vale a dire tramite raggi gamma.
3. Utilizzare un microscopio ottico per controllare l'integrità della rete (buchi di carbonio intatto) pur mantenendo la griglia EM all'interno del vetro-bottpiatto om (per evitare contaminazioni). Quando si applica qualsiasi sostanza sulla griglia o qualsiasi cosa che verrà in contatto con i neuroni, utilizzare procedura sterile e puntali sterili.
4. In una cappa di coltura utilizzando la procedura sterile, applicare 250 microlitri della sostanza di rivestimento appropriato lentamente e accuratamente la superficie vetrata centrale della piastra di Petri. Assicurarsi che l'appropriato sostanza di rivestimento copre l'intera griglia EM.
   1. Per neuroni ippocampali, utilizzare poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) come sostanza di rivestimento, preparato come descritto in precedenza ^19. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza. Per i gangli spinali (DRG) neuroni, utilizzare una miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma del mouse (vedi Tabella dei Materiali e reagenti) come sostanza di rivestimento, preparare quanto segue. Si noti che 250 microlitri sono necessari per griglia EM, per ogni piatto, in modo da scalare il lotto di conseguenza.
      1. Scongelare una bottiglia stockdella miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del mouse sarcoma notte a 4 ° C.
      2. Mantenere freddo miscela proteica gelatinosa secreta dal Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del sarcoma topo, e tutti i componenti utilizzati per rendere la soluzione, ossia del loro mantenimento sul ghiaccio.
      3. Mentre su ghiaccio, diluire questa miscela proteica gelatinosa Neurobasal mezzo per ottenere una diluizione 1:20 (cioè attenuare 500 microlitri della miscela proteica gelatinosa in 10 ml di Neurobasal).
      4. Dividere diluito miscela proteica gelatinosa in aliquote da 1 ml, e memorizzare immediatamente eventuali aliquote supplementari a -20 ° C.
      5. Applicare 250 microlitri per griglia EM, per ogni piatto, come descritto nella Sezione 1.4.
5. Coprire il piatto Petri con la sua parte superiore e incubare (sia con PLL per campioni ippocampali, OR con miscela proteica gelatinosa per campioni DRG) per 1 ora a temperatura ambiente nella cappa coltura tissutale.
6. Aspiclassificare tutti PLL (per campioni di ippocampo) o miscela proteica gelatinosa (per campioni DRG) dai piatti. Per effettuare questa operazione, utilizzare il sistema di aspirazione della cappa coltura tissutale. Utilizzare un puntale sterile attaccato al tubo a vuoto. Evitare il contatto diretto con la rete EM.
7. Utilizzare una pipetta a spostamento d'aria regolabile attentamente applicare 250 microlitri di PBS sterile (PBS) alla griglia EM nella zona centrale in vetro di ogni piatto Petri, tale che la griglia EM è completamente coperto da PBS. Poi, aspirare il PBS da ogni piatto. Ripetere 3x.
8. Lasciare i piatti con griglie EM ad asciugare sotto il cofano coltura di tessuti per 15 min. Assicurarsi che siano completamente asciutti controllando al microscopio luce nella stanza coltura di tessuti. Assicurarsi che non vi siano bolle di umidità nella griglia. Se è così, attenzione aspirare accanto alla griglia EM per eliminare questa umidità supplementare. La griglia rivestita deve essere usato immediatamente per la placcatura di neuroni.

2. Preparazione e Plrativo Primaria neuroni su EM griglie

1. Per piastra neuroni primari, prima sezionare, trypsinize (con 2,5% tripsina) e triturare dissociare il dell'ippocampo (o dorsale radice gangli di 18 giorni di età embrioni di ratto) nelle singole celle, come descritto in precedenza ^19.
   1. Triturare è un termine comunemente usato dai neurobiologi per descrivere dissociazione grumi di cellule in singole celle, in particolare mediante l'utilizzo di una pipetta di vetro con una punta sterilizzata. Il risultato si ottiene con attenzione e lentamente disegno e rilasciando le cellule, su e giù, più volte (~ 30) tramite la pipetta.
2. Seguire le procedure descritte in precedenza per DRG dissezione e isolamento delle cellule ^24, prendendo atto di usare 0,25% tripsina (in HBSS) per isolare i neuroni DRG di ratto, invece di utilizzare gli enzimi suggeriti (papaina, collagenasi / dispasi) che sono più adatti per il mouse neuroni DRG.
3. Calcolare il numero di neuroni isolati (ad esempio con un emocitometro)e utilizzare questo valore per calcolare il volume appropriato di cellule da applicare a ogni piatto per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / ml al piatto. Il volume massimo da applicare è di 250 microlitri. Si noti che questo riempie solo la zona centrale in vetro, non l'intera piastra.
4. Incubare i piatti per 30 minuti in un incubatore CO ₂ a 37 ° C. Consentono alle cellule di recuperare e di aderire.
5. Aggiungere lentamente 1,5 ml di mezzi riscaldati ad ogni piatto, facendo attenzione a non disturbare la griglia EM. Il tipo di supporto dipende dal tipo di cellula (dell'ippocampo o DRG).
   1. Preparare il supporto appropriato per entrambi neuroni ippocampali ¹⁹ o dorsali radice gangliari neuroni ^24, che viene riscaldato in un bagno d'acqua a 37 ° C prima dell'uso. Incubare i piatti pernottamento in CO ₂ incubatore.
   2. Per i neuroni dell'ippocampo, cambiare i media il giorno successivo. Cambiare la metà dei media ogni due giorni in poi per 14 giorni. Riscaldare il supporto in un bagno d'acqua a 37 ° prima dell'uso. Per neuroni DRG, il giorno dopo dissezione / placcatura, preparare un nuovo ceppo di media con un agente anti-mitotico (Uridine e 5'-Fluoro-2'-deossiuridina) ottenere una soluzione stock 10 mM di ciascuno, separatamente, utilizzare una finale concentrazione di 10 mM per ciascuno. Rimuovere la metà dei mezzi di DRG (875 ml) e aggiungere 875 ml di mezzi freschi con l'agente anti-mitotico.
      1. Per neuroni DRG, ogni due giorni per la prima settimana, si alternano a cambiare i media tra i media anti-mitotico e media DRG standard. Per la seconda settimana, cambiare i media DRG standard, ogni due giorni.

3. Vitrifying Neuroni su EM griglie

1. Preparare attrezzature e tutto il materiale per il congelamento e la conservazione delle reti oro EM a temperatura criogenica: un dispositivo di vetrificazione con una camera di umidità ^17, fine-point pinzette specializzati per la macchina vetrificazione, pinzette point lungo piatta, Dewar (s) di azoto liquido (LN _2), cContenitore oolant, contenitore griglia EM, carta da filtro priva di calcio.
2. Avviare il dispositivo di vetrificazione. Impostare l'umidità al 100% e temperatura di 32 ° C. Nella sezione "Console", impostare il tempo macchia di zero secondi. Questo permette manuale assorbente attraverso il lato-finestra della camera umida della macchina vetrificazione.
3. Maneggiare la carta da filtro priva di calcio con i guanti, stratificazione loro tale che tre carte sono impilate. Tagliare la pila a 0,5 centimetri strisce larghe che sono ~ 2 cm di lunghezza. Piegarle a 90 ° in modo tale che un lato della carta ha di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia (Figura 2). Usando le pinzette, rimuovere la carta centrale e metterlo su un altro filtro di carta senza calcio fino al momento dell'uso.
4. Mettere il pulsante di memorizzazione griglia nel supporto bottone all'interno della camera di vetrificazione. Riempire la camera interna del contenitore refrigerante con azoto liquido e attendere fino a completa evaporazione. Riempire la camera esterna del secoloe contenitore refrigerante con azoto liquido finché non raggiunge una temperatura stabile per procedere al passo successivo. Riempire la camera interna con elevata purezza etano gassoso che condensano allo stato liquido all'interno della camera raffreddata.
5. Spostare il piatto (es) dal termostato a un grande piatto polistirolo 100 mm per il trasporto alla camera vetrificazione, se non nelle immediate vicinanze. Utilizzare le pinzette vetrificazione specializzati per scegliere con cura la griglia EM dal piatto. Si noti che parte i neuroni crescono sulla griglia EM; posizione avrà importanza per il passaggio successivo. Utilizzare il blocco scorrimento nera sulle pinzette per bloccare saldamente le pinzette sulla griglia EM.
6. Inserire le pinzette nella macchina vetrificazione tale lato della griglia EM in cui i neuroni sono rispettati volti a fianco, lontano dal foro della macchina vetrificazione apertura laterale. Ritrarre le pinzette specializzati nella macchina vetrificazione.
7. Posizionare il contenitore refrigerante nel supporto appropriatodella macchina vetrificazione. Deve essere riempita con un adeguato LN ₂ ed etano liquido. Utilizzo del comando schermata appropriata della macchina vetrificazione, sollevare la camera refrigerante verso l'alto fino a quando è lavata con il fondo della camera umida.
8. Con le pinzette punta piatta, afferrare un bordo della carta da filtro in modo tale che il lato minore (di 0,5 cm x 0,5 centimetri faccia) è perpendicolare alle pinzette. Questa faccia entrerà in contatto diretto con la griglia EM per blotting (Figura 2B). Inserire delicatamente la carta da filtro nel lato foro della camera di umidità della macchina vetrificazione (Figura 2A). Stabilmente tenere la carta contro la griglia EM (il lato opposto a campione) per 10 sec. Eliminare la carta dopo e subito sprofondare-congelare i campioni in etano liquido utilizzando l'automazione della macchina vetrificazione.
9. Trasferire accuratamente la griglia EM frozen-idrato ad uno degli slot in uno deipulsanti di storage di rete. Ripetere la procedura per ulteriori griglie EM nei piatti. I pulsanti di storage di rete EM utilizzati in questi esperimenti possono memorizzare più griglie EM congelati-idratata.

4. Immagine raccolta, elaborazione, e annotazione

1. Procedere per raccogliere microscopio elettronico 2-D e / o 3-D serie tilt ⁵ dei neuriti utilizzando un microscopio crio-elettroni in condizioni di basse dosi. Le immagini 2-D sono stati destinati a valutare la qualità della rete in termini di spessore del ghiaccio e le possibili aree utili per serie tilt 3-D.
   1. In questo caso, tutte le immagini sono stati raccolti usando una camera CCD 4k x 4k attaccato ad un microscopio elettronico a 200 kV equipaggiata con un solo conduttore inclinazione azoto liquido trasferimento criogenico, a 20k microscopio ingrandimento ad un bersaglio underfocus di 7 micron e campionamento di 4,4 Å / pixel.
   2. Per ottenere una tomografia 3D del campione, prendere una serie di immagini di proiezione, mentre incrementale inclinando il campione along un asse del microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Date le inclinazioni e le altre impostazioni sperimentali, ci sono diversi software differenti disponibili per raccogliere automaticamente le serie tilt ^5. La serie tilt 3-D mostrato qui sono stati raccolti sulla stessa microscopio usando semiautomatico software di acquisizione serie inclinazione 26 in un intervallo di -60 ° a 60 ° a 5 ° incrementi con una dose cumulativa di ~ 60 e / a ^2.
2. Ricostruire la serie inclinazione dei neuriti utilizzando un software di elaborazione delle immagini ²¹ come precedentemente descritto per altri campioni ^5,29.
3. Colore-annotare le caratteristiche 3-D del neuriti dal primo segmentando il tomogramma e creando un modello di superficie utilizzando una 3-D software di elaborazione di immagini come descritto in precedenza ^5.

Prima di congelamento e di imaging via crio-ET, immagini al microscopio di luce dovrebbero essere prese della rete EM in cui i neuroni sono in crescita. Neuriti dovrebbero essere chiaramente visibile senza sovrapposizione significativa tra loro. Una casella colorata in Figura 3A rappresenta una zona che è ingrandita per mostrare un ingrandimento maggiore nella Figura 3B, in cui neuriti estendono attraverso la struttura a reticolo della griglia. Ciascuna griglia quadrati è composto da una pellicola di carbonio bucata che supporta i neuroni e le loro neuriti. Questi fori sono evidenti in una bassa dose crio-EM immagine presa durante 4k ingrandimento, che mostra il corpo neurone come relativamente grande,, oggetto scuro elettrone-denso (Figura 3C), da cui neuriti progetto verso l'esterno.

Una parte del riposo neurite sopra un foro al carbonio è selezionato in una casella colorata in Figura 3C, ed ingrandita con un ingrandimento maggiore (20k) in Figura 3D. A questo ingrandimento, chiare strutture cellulari interne comprese microtubuli, vescicole e mitocondri dovrebbero essere chiaramente evidente (Figura 3D), in particolare nel ghiaccio ottimale sottile come generato mediante questo protocollo. Le strutture nere scure nel centro dell'immagine (Figura 3D) sono particelle di ghiaccio esagonali che sono considerati come contaminazione e devono tipicamente essere evitati, tuttavia, dato che essi sono molto scarse e al di fuori dei neuriti stessi, non interferiscono con la ricostruzione e colore annotazione delle strutture interne di analisi e di interpretazione (Figura 4). Un'altra basso dosaggio, immagine basso ingrandimento è mostrato in Figura 5, da cui un neurite puo essere, dopo che diverse immagini 2-D possono essere presi e digitalmente cuciti insieme utilizzando un software di elaborazione di immagini per generare una sequenza (Figura 6).

L'inizialeconcentrazione di placcatura bassa (50.000 cellule / ml per piastra) di neuroni sulle griglie EM permette di neuroni che sono distanziate abbastanza distanti per garantire una chiara visualizzazione dei neuriti (Figura 3C); concentrazioni superiori negativa (> 50.000 cellule / ml per piastra ) può risultare in immagini non ottimali di neuriti affollati che sono difficili da rintracciare o attributo componenti cellulari (Figure 7B e 7C).

Figura 1. Schema per la coltivazione di neuroni sulle reti EM all'interno piatti con fondo di vetro. (A) piatti con fondo di vetro sono mostrati, parzialmente riempito con supporti cellulare (rosa). (B) Ogni piatto contiene una griglia d'oro EM, come una visione più ravvicinata rivela. (C) Rivestimento del EGriglia M con poli-lisina è mostrato come un cartone laterale sezionata. Il piatto fondo di vetro è composto da un vetrino di vetro quadrato che è collegato al fondo di una capsula di Petri in plastica, che copre una apertura circolare che originariamente tagliato fuori dal fondo. Questi piatti sono peggiori di vetro sterilizzati ai raggi Gamma e commercialmente acquistato come premade. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2. Schema per blotting manuale di EM griglie con i neuroni aderito. (A) Close-up di slot di ingresso scorrevole della macchina vetrificazione (freccia nera) per l'umidità / camera assorbente, in cui saranno inserite le pinzette per cancellare il campione manualmente. (B)Schema del fumetto che mostra come la carta da filtro priva di calcio (0,5 centimetri x 0,5 centimetri viso) dovrebbe essere gestito con le pinze flat-point e inserito attraverso la fessura ingresso nella camera umida della macchina vetrificazione per asciugare la griglia EM su cui i neuroni siano rispettati (gocciolina di supporti cellulari rosa mostrato). La griglia EM è detenuto da fine-point pinzette specializzati all'interno della camera di umidità. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3. Visualizzazione congelati, neuroni idrate su oro microscopia elettronica (EM) griglie. (A) microscopio luminoso ingrandimento 10X della zona centrale di una griglia EM su cui neuroni primari di ratto sono stati groala per 2 settimane. (B) vista ingrandita della scatola aqua in (A), in cui i neuroni e le proiezioni dei neuriti sono visibili (frecce rosa). (C) al microscopio elettronico a 4K ingrandimento di un neurite sporgente verso l'esterno dal corpo del neurone (freccia rossa). Schematicamente corrisponde ad un'area (cioè la scatola rossa) all'interno di uno dei quadrati della griglia mostrati in (B). Blue box è visto close-up (D), dove le caratteristiche interne della neuriti sono chiaramente visibili a 20k ingrandimento (freccia mitocondri verde, arancione freccia microtubuli; vescicola freccia blu). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 4. 3-D ricostruzione e l'annotazione di un ratto DRG assone tomogram. (A) fetta tomografica da una pila ricostruito di immagini scattate a diversi angoli di inclinazione di un assone DRG. (B) corrispondente 3-D annotazioni dello stesso assone. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 5. 2-D immagine Cryo-EM di un neurone ratto DRG (centro-sinistra) con proiezioni assonale (box rosso) a 4k di ingrandimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 6. Montaggio di quattro immagini Cryo-EM 2-D di un singolo assone ratto DRG. Ogni immagine è stata scattata a 20k di ingrandimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 7. Immagini 2-D crio-EM di neuriti. (A) Un assone ratto DRG ripreso più stretta in prossimità della soma cella. (B, C) ​​Esempi di sovraffollamento dei neuriti a causa di un'elevata concentrazione di placcatura dei neuroni sulle reti EM. Tutte le neuriti erano in flash-congelato due settimane dopo la placcatura in oro griglie EM. Tutte le immagini sono state prese a 20k;. Ingrandimento Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 8. 3-D ricostruzione e l'annotazione di un ratto dell'ippocampo neurite tomogram. (A) fetta tomografica da una pila ricostruito di immagini scattate a diversi angoli di inclinazione di uno dei neuriti ippocampale. (B) corrispondente 3-D di annotazione dello stesso neurite. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.