Registrazione elettrofisiologica simultanea e imaging del calcio dei neuroni del nucleo soprachiasmatico

Sommario

Vengono descritte le procedure per eseguire registrazioni simultanee del potenziale o della corrente di membrana e delle variazioni della concentrazione intracellulare di calcio. I neuroni del nucleo soprachiasmatico vengono riempiti con l'indicatore di calcio bis-fura-2 utilizzando un elettrodo patch clamp nella configurazione patch clamp dell'intera cellula.

Abstract

Sono stati utilizzati metodi di registrazione simultanea elettrofisiologica e fluorescente per studiare il ruolo dei cambiamenti del potenziale o della corrente di membrana nella regolazione della concentrazione intracellulare di calcio. Il cambiamento delle condizioni ambientali, come il ciclo luce-buio, può modificare l'attività della rete neuronale e neurale e l'espressione di una famiglia di geni dell'orologio circadiano all'interno del nucleo soprachiasmatico (SCN), la posizione dell'orologio circadiano principale nel cervello dei mammiferi. La trasmissione sinaptica eccitatoria porta ad un aumento della concentrazione postsinaptica di Ca²⁺ che si ritiene attivi le vie di segnalazione che spostano l'espressione ritmica dei geni dell'orologio circadiano. Le fette ipotalamiche contenenti l'SCN sono state bloccate con microelettrodi riempiti con una soluzione interna contenente l'indicatore di calcio bis-fura-2. Dopo che si è formato un sigillo tra il microelettrodo e la membrana neuronale SCN, la membrana è stata rotta utilizzando una leggera aspirazione e la sonda di calcio si è diffusa nel neurone riempiendo sia il soma che i dendriti. Le misurazioni raziometriche quantitative della concentrazione intracellulare di calcio sono state registrate simultaneamente al potenziale o alla corrente di membrana. Utilizzando questi metodi è possibile studiare il ruolo delle variazioni della concentrazione intracellulare di calcio prodotte dall'attività sinaptica e dall'attivazione del potenziale d'azione dei singoli neuroni. In questa presentazione dimostriamo i metodi per registrare simultaneamente l'attività elettrofisiologica insieme al calcio intracellulare da singoli neuroni SCN mantenuti in fette di cervello.

Introduzione

È noto che i cambiamenti nell'espressione genica si verificano nei neuroni come conseguenza della segnalazione sinaptica. La segnalazione da parte del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato può depolarizzare il potenziale della membrana neuronale portando infine alla trascrizione e traduzione genica^1,2. L'attivazione dei recettori ionotropici da parte del glutammato consente agli ioni calcio extracellulari di entrare nella cellula, che si ritiene svolga un ruolo critico come secondo messaggero nell'attivazione della trascrizione genica. La valutazione della relazione tra l'attività elettrica della membrana, come la frequenza di attivazione del potenziale d'azione, e le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio richiede la combinazione di due metodi: il clampaggio del patch dell'intera cellula e l'imaging quantitativo di sonde fluorescenti di calcio^3-5, che consentono di studiare la relazione nei singoli neuroni. La tecnica di registrazione a singola cellula consente la registrazione dell'attività dei singoli neuroni in porzioni identificabili del cervello. La tecnica di registrazione dell'intera cellula consente di controllare la tensione o la corrente della membrana, consentendo la manipolazione sperimentale di specifiche correnti dei canali ionici. L'uso di micropipette riempite con sonde di calcio fluorescenti garantisce inoltre che il neurone sia ben riempito con sonda di calcio. Questa tecnica ha un chiaro vantaggio quando si lavora con preparazioni di fette di cervello da preparazioni di fette adulte, poiché questi neuroni sono particolarmente difficili da caricare utilizzando le più comuni sonde cellulari e riduce i potenziali problemi di fluorescenza di fondo^6-8.

La luce è il modo principale in cui i mammiferi regolano il loro orologio circadiano, che si trova nel nucleo soprachiasmatico ipotalamico (SCN). L'informazione luminosa trasdotta nella retina viene trasmessa ^9-11 attraverso il tratto retinoipotalamico (RHT) dove il glutammato viene rilasciato nel SCN^12,13. Il glutammato apre i recettori ionotropici NMDA e AMPA situati sui neuroni SCN producendo un afflusso di calcio e sodio e avviando una cascata di segnalazione intracellulare che alla fine porta ad alterare l'espressione di una famiglia di geni dell'orologio^14-17 e a spostarsi nella fase dell'orologio circadiano^18-20. Tuttavia, il calcio può entrare nei neuroni direttamente attraverso i recettori ionotropici del glutammato o attraverso la depolarizzazione della membrana e l'attivazione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti (VDCC)²¹. Abbiamo quindi sviluppato un protocollo sperimentale per studiare la relazione tra la concentrazione intracellulare di calcio e l'attività elettrica di membrana nei neuroni SCN, come avviene con l'attivazione del potenziale d'azione e dall'input sinaptico²².

Protocollo

1. Preparazione di Fette di Cervello Ipotalamico

1. Ottieni, in anticipo, l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) per qualsiasi procedura che coinvolga gli animali. Le procedure per gli animali qui descritte sono coerenti con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali del 2013 e sono state approvate in anticipo dall'Oregon Health & Science University IACUC.
2. Preparare 500 ml di tampone per affettare senza MgCl₂ e CaCl₂ (Tabella 1). Far bollire la soluzione con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂ a temperatura ambiente, quindi aggiungere il MgCl₂ e il CaCl₂ continuando ad aerare. Regolare l'osmolarità a 300 mOsm con saccarosio. L'osmolarità viene misurata con un osmometro a pressione di vapore.
3. Preparare 1 L di supporto di registrazione senza MgCl₂ e CaCl₂ (Tabella 2). Far bollire la soluzione con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂, quindi aggiungere MgCl₂ e CaCl₂ continuando ad aerare. Regolare il pH a 7,2-7,4 con NaOH (10 N) e l'osmolarità a 300 mOsm con saccarosio. L'aggiunta del tampone HEPES è facoltativa ed è stata utilizzata per stabilizzare ulteriormente il pH.
4. Le soluzioni per affettare e registrare possono essere conservate in frigorifero per diversi giorni prima dell'uso.
5. Preparare l'agarosio al 3% e versarlo in una capsula di Petri sterile (6 mm di profondità) e conservare in frigorifero.
6. Tagliate tre cubetti di agarosio di circa 6 mm x 6 mm x 6 mm.
7. Anestetizzare profondamente un ratto Sprague-Dawley di quattro-otto settimane con isoflurano. Test per la profondità dell'anestesia. La profondità dell'anestesia è ritenuta appropriata quando non vi è alcun riflesso di ritiro dell'arto posteriore dopo aver pizzicato il poggiapiedi. Una volta opportunamente anestetizzato, il ratto viene soppresso mediante decapitazione rapida.
8. Rimuovere rapidamente il cervello facendo attenzione a tagliare prima i nervi ottici, e metterlo in una soluzione di affettatura ghiacciata satura con il 5% di CO₂ e il 95% di O₂ e lasciare raffreddare per 2-3 minuti.
9. Taglia il cervello. Posizionare il cervello con una pinza su una carta da filtro circolare inumidita (con soluzione per affettare) posta su una capsula di Petri di vetro appoggiata sul ghiaccio.
10. Tagliare il cervello coronalmente per rimuovere il cervelletto rimanente e il tronco encefalico, quindi la corteccia rostrale e i lati, per lasciare un blocco di cervello contenente l'ipotalamo preservando accuratamente il lato contenente SCN, nervi ottici e chiasma ottico.
11. Stendere un sottile strato di colla cianoacrilica abbastanza grande da attaccare il cervello e i blocchi di agarosio in una camera di taglio del microtomo ghiacciata ma asciutta.
12. Trasferisci il blocco cerebrale ghiacciato con il lato caudale rivolto verso il basso sulla colla con il lato contenente l'SCN posizionato per il taglio per primo con i nervi ottici che formano una "V" rivolta verso l'alto.
13. Posizionare i blocchi di agarosio sugli altri 3 lati. Riempire la camera con un tampone per affettare ghiacciato a bolle continue con il 5% di CO₂ e il 95% di O₂. La colla cianoacrilica si solidificherà con l'umidità mantenendo in posizione il cervello e i blocchi di agarosio.
14. Tagliare fette ipotalamiche coronali (220-250 μm di spessore) contenenti l'SCN con il microtomo a lama vibrante. Tipicamente viene scelta una fetta in cui il chiasma ottico è di circa 2-4 mm di diametro, che appare come una banda bianca con SCN appena dorsale che appare come due piccole "rientranze" nel chiasma ottico su entrambi i lati del terzo ventricolo (Figura 1A).
15. Posizionare le fette nella camera di registrazione (36 °C) montata sul tavolino di un microscopio Leica DMLFS. La camera è riempita con una soluzione di registrazione a flusso continuo (2 ml/min) aerata con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂ e preriscaldata con un riscaldatore in linea.
16. Eseguire registrazioni di patch clamp e imaging del calcio su cellule intere nei neuroni SCN 0,5-8 ore dopo la preparazione della fetta.

2. Registrazione con Patch Clamp

1. Preparare la soluzione dell'elettrodo (intracellulare) in metà del volume finale totale di acqua.
2. Regolare la soluzione a pH 7,3 con KOH (1 N).
3. Aggiungere l'acqua rimanente. L'osmolarità finale della soluzione dovrebbe essere nell'intervallo 280-290 mOsm.
4. Passare la soluzione dell'elettrodo attraverso un filtro da 0,2 μm, aliquotare (0,5 ml) in provette per microfusibili e conservare a -20 °C.
5. Preparare la soluzione madre di sale esapotassico bis-fura-2 della sonda di calcio (10 mM) mescolando 1 mg di sale bis-fura-2 esapotassio con 99,29 μl di 0,2 μm di acqua filtrata.
6. Aliquotare in provette separate (2-5 μl ciascuna) e congelare (-20 °C).
7. Scongelare un'aliquota di soluzione interna e la sonda Ca²⁺ poco prima dell'uso. Aggiungere 2 μl della soluzione madre di bis-fura-2 a 400 μl della soluzione interna per una concentrazione finale di 50 μM nella sonda di calcio. Triturare brevemente per mescolare le soluzioni. La concentrazione della sonda di calcio (10-250 μM) varia a seconda del disegno sperimentale e del sistema di imaging. Si noti che la bis-fura-2 è composta da due molecole di fura-2 collegate.
8. Estrarre gli elettrodi patch a cella intera, in due stadi, fino a un diametro esterno della punta di circa 1 μm e resistenze di 7-10 MΩ quando riempiti con la soluzione intracellulare.
9. Riempire l'elettrodo con alcuni μl della soluzione interna contenente la sonda di calcio filtrata con un filtro a siringa da 4 mm (0,2 μm) per campioni a basso volume tramite una provetta Microfil.
10. Applicare una piccola quantità di pressione positiva all'elettrodo mentre viene guidato nella camera di registrazione sotto l'illuminazione a luce rossa mentre viene visualizzato su un monitor video.
11. Posizionare il microelettrodo sull'SCN utilizzando un obiettivo a bassa potenza (4X). L'SCN è identificato come le due aree traslucide su entrambi i lati del terzo ventricolo e dorsale al chiasma ottico (Figura 1A).
12. Impostare il microscopio su un ingrandimento ad alta potenza (40X o 63X). Le sottoregioni del SCN e i singoli neuroni SCN possono essere presi di mira per la registrazione all'ingrandimento più elevato.
13. Applicare una leggera pressione positiva al microelettrodo mentre avanza sulla superficie di un neurone.
14. Applicare una leggera pressione negativa al microelettrodo per formare una tenuta con resistenze di 3-10 GΩ.
15. Regolare la tensione della membrana a -60 mV con l'amplificatore controllato con il software di acquisizione.
16. Applicare un'ulteriore pressione negativa all'elettrodo per rompere la membrana cellulare in modalità cella intera.
17. Quando entrano in modalità cellula intera, il neurone SCN, il soma e i dendriti si riempiono con una sonda fluorescente.
18. La tensione di membrana viene misurata in modalità pinza di corrente o corrente in modalità pinza di tensione mentre i dati dell'immagine della sonda di calcio vengono monitorati e memorizzati (descritti di seguito). Visualizza le immagini acquisite insieme a un grafico dei dati di fluorescenza del rapporto 340 nm/380 nm durante l'esperimento.

3. Misurazione del Ca²⁺ intracellulare

1. Le misure quantitative di Ca²⁺ sono ottenute registrando una coppia di immagini eccitando rapidamente il tessuto con luce UV a 340 nm e 380 nm tramite un monocronometro con una larghezza di banda di 10 nm e fatte passare attraverso un filtro ottico UG11 per limitare le lunghezze d'onda armoniche superiori a 400 nm, un dicroico DCLP a 400 nm e la luce emessa attraverso un filtro di emissione da 510±40 nm.
2. Le immagini vengono acquisite utilizzando una telecamera CCD raffreddata con tempo di acquisizione e binning regolati per ridurre al minimo il photobleaching e massimizzare la velocità di registrazione.
3. Il software di imaging quantitativo viene utilizzato per acquisire e visualizzare le immagini.
4. Selezionare le regioni di interesse dall'immagine iniziale da convertire in dati unitari di intensità di fluorescenza relativa (ad es. soma, dendrite, ecc.). Selezionare anche una regione per la misurazione della fluorescenza di fondo (Figura 1B).
5. Le immagini grezze e i dati ottici quantificati vengono salvati continuamente durante l'esperimento. Dopo l'esperimento, le immagini salvate vengono generalmente rianalizzate quando è possibile dedicare più tempo a selezionare con maggiore precisione le regioni di interesse da quantificare.
6. I dati possono essere presentati come la concentrazione intracellulare stimata di calcio (Est[Ca²⁺]i). Per calcolare la concentrazione di calcio 4 viene utilizzato il rapporto (R) della luce emessa a seguito di eccitazione e sottrazione di fondo a 340 nm diviso per 380 nm insieme alla fluorescenza massima e minima a 340 nm e³⁸⁰ nm. La sottrazione dello sfondo e altri calcoli vengono eseguiti utilizzando un software di analisi dei dati.
7. Una determinazione in vitro della fluorescenza massima e minima della bis-fura-2 può essere eseguita utilizzando 10 mM di CaCl₂ per le condizioni legate al Ca²⁺ e 10 mM di EGTA per le condizioni libere di Ca²⁺. La costante di dissociazione Ca²⁺, Kd della sonda è considerata 370 nM per bis-fura-2 (Invitrogen).

Risultati

Utilizzando fette di cervello ipotalamico, abbiamo registrato simultaneamente i cambiamenti nel calcio intracellulare in modalità cellula intera sia in condizioni di tensione che di pinza di corrente. Il microelettrodo mostrato nella Figura 1A viene abbassato in posizione ad alto ingrandimento (obiettivi UV 40X o 63X) con una piccola quantità di pressione positiva applicata. Dopo aver toccato il neurone, si forma una tenuta gigaohm con una leggera aspirazione. In modalità voltage-clamp dopo aver impostat...

Discussione

I metodi sopra descritti forniscono un potente strumento per registrare simultaneamente il legame tra l'attività elettrica della membrana neuronale e la concentrazione intracellulare di calcio. Il metodo ha una serie di punti di forza in quanto combina due metodi molto ben caratterizzati: la registrazione del patch clamp di cellule intere e la misurazione del calcio intracellulare utilizzando coloranti fluorescenti. Il nostro approccio è simile a quelli descritti da altri ricercatori^_6,23.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl	Fisher Scientific Co.	S271-3
KCl	Fisher Scientific Co.	P217-500
NaH2PO4• H2O	Sigma Chemical Co.	S-9638
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific Co.	M33-500
CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific Co.	C79-500
D-glucosio	Fisher Scientific Co.	D16-500
NaHCO3	Fisher Scientific Co.	S233-500
Saccarosio	Fisher Scientific Co.	S5-500
D-gluconato di potassio	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Adenosina 5′-trifosfato sale dipotassico diidrato	Sigma-Aldrich	A8937
Guanosina 5′-trifosfato tris sale	Sigma-Aldrich	G9002
Agarosio (ultrapuro)	Life Tecnologie	15510-027	Gel inserito in una piastra di Petri sterile Strato di 6 mm di spessore
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2, sale esapotassico	Invitrogen	B6810	Cellula impoverita
Nome dell'apparecchiatura	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microtomo	Leica	VT1000S	Affettatura di tessuti
Colla cianoacrilica (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Estrattore per microelettrodi	Narshige International USA	PP-83
Tubi capillari per microelettrodi	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
Filtro per siringa	Corning	#431212
Microscopio	Leica	DM LFS	Con obiettivi UV 4X, 40X e 63X e telecamera CCD per epifluorescenza
	Hamamatsu	ORCA ER	CCD a 12 bit
Fura-2 Filter Cube	Chroma	71500A	Set con filtro UG11
Polychrome IV	Till Photonics GmBH		Monochronometer
Occhiali di sicurezza che bloccano i raggi ultravioletti	Prodotti
Amplificatore EPC-9	HEKA Eletronik
Metafluor	Molecular Devices		Software di imaging
Patchmaster	HEKA Eletronik		Software di acquisizione dati
Igor versione 6	Wavemetrics		Elettrofisiologia e Ca2+ Analisi dei dati
VAPRO 5520	Westcor		Osmometro a pressione di vapore