Registrazione elettrofisiologica simultanea e imaging del calcio dei neuroni del nucleo soprachiasmatico

Robert P. Irwin; Charles N. Allen

doi:10.3791/50794

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Registrazione elettrofisiologica simultanea e imaging del calcio dei neuroni del nucleo soprachiasmatico

11K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/50794

⸱

8 dicembre 2013

Robert P. Irwin¹ , Charles N. Allen¹^,²

¹Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, ²Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

In questo articolo

Sommario

Vengono descritte le procedure per eseguire registrazioni simultanee del potenziale o della corrente di membrana e delle variazioni della concentrazione intracellulare di calcio. I neuroni del nucleo soprachiasmatico vengono riempiti con l'indicatore di calcio bis-fura-2 utilizzando un elettrodo patch clamp nella configurazione patch clamp dell'intera cellula.

Abstract

Sono stati utilizzati metodi di registrazione simultanea elettrofisiologica e fluorescente per studiare il ruolo dei cambiamenti del potenziale o della corrente di membrana nella regolazione della concentrazione intracellulare di calcio. Il cambiamento delle condizioni ambientali, come il ciclo luce-buio, può modificare l'attività della rete neuronale e neurale e l'espressione di una famiglia di geni dell'orologio circadiano all'interno del nucleo soprachiasmatico (SCN), la posizione dell'orologio circadiano principale nel cervello dei mammiferi. La trasmissione sinaptica eccitatoria porta ad un aumento della concentrazione postsinaptica di Ca²⁺ che si ritiene attivi le vie di segnalazione che spostano l'espressione ritmica dei geni dell'orologio circadiano. Le fette ipotalamiche contenenti l'SCN sono state bloccate con microelettrodi riempiti con una soluzione interna contenente l'indicatore di calcio bis-fura-2. Dopo che si è formato un sigillo tra il microelettrodo e la membrana neuronale SCN, la membrana è stata rotta utilizzando una leggera aspirazione e la sonda di calcio si è diffusa nel neurone riempiendo sia il soma che i dendriti. Le misurazioni raziometriche quantitative della concentrazione intracellulare di calcio sono state registrate simultaneamente al potenziale o alla corrente di membrana. Utilizzando questi metodi è possibile studiare il ruolo delle variazioni della concentrazione intracellulare di calcio prodotte dall'attività sinaptica e dall'attivazione del potenziale d'azione dei singoli neuroni. In questa presentazione dimostriamo i metodi per registrare simultaneamente l'attività elettrofisiologica insieme al calcio intracellulare da singoli neuroni SCN mantenuti in fette di cervello.

Introduzione

È noto che i cambiamenti nell'espressione genica si verificano nei neuroni come conseguenza della segnalazione sinaptica. La segnalazione da parte del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato può depolarizzare il potenziale della membrana neuronale portando infine alla trascrizione e traduzione genica^1,2. L'attivazione dei recettori ionotropici da parte del glutammato consente agli ioni calcio extracellulari di entrare nella cellula, che si ritiene svolga un ruolo critico come secondo messaggero nell'attivazione della trascrizione genica. La valutazione della relazione tra l'attività elettrica della membrana, come la frequenza di attivazione del potenziale....