Articolo metodologico

Biofilm microbici elettroattivi derivati dalle acque reflue: crescita, mantenimento e caratterizzazione di base

16.5K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

29 dicembre 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

In questo articolo

Sommario

Viene dimostrata la crescita cronoamperometrica di biofilm microbici elettroattivi anodici in un reattore a batch alimentato utilizzando una configurazione a tre elettrodi, controllata da un potenziostato. Il trasferimento extracellulare di elettroni è caratterizzato mediante voltammetria ciclica in presenza del donatore di elettroni e in assenza del donatore di elettroni. Viene dimostrata l'analisi fondamentale dei dati.

Abstract

La crescita di biofilm microbici elettroattivi anodici da inoculi di acque reflue in un reattore a batch alimentato è dimostrata utilizzando una configurazione a tre elettrodi controllata da un potenziostato. In questo modo, l'uso di potenziostati consente una regolazione esatta del potenziale dell'elettrodo e garantisce condizioni di coltura microbica riproducibili. Durante la crescita, la produzione attuale viene monitorata mediante cronoamperometria (CA). Sulla base di questi dati, la massima densità di corrente (jmax) e l'efficienza coulombica (CE) sono discusse come misure per la caratterizzazione delle prestazioni bioelettrocatalitiche. La voltammetria ciclica (CV), un metodo non distruttivo, cioè metodo non invasivo, viene utilizzato per studiare il trasferimento di elettroni extracellulare (EET) di batteri elettroattivi. Le misure CV vengono eseguite su elettrodi di biofilm anodico in presenza del substrato microbico, es. condizioni di rotazione, e in assenza del substrato, cioè condizioni di non rotazione, utilizzando diverse velocità di scansione. Successivamente, viene esemplificata l'analisi dei dati e vengono derivati e spiegati i parametri termodinamici fondamentali dell'EET microbico: potenziale di picco (Ep), densità di corrente di picco (jp), potenziale formale (Ef) e separazione di picco (ΔEp). Inoltre, vengono affrontati i limiti del metodo e lo stato dell'arte dell'analisi dei dati. In questo modo questo video-articolo fornirà una guida per le fasi sperimentali di base e l'analisi fondamentale dei dati.

Introduzione

La delucidazione dei fondamenti del trasferimento di elettroni extracellulari microbici (EET) e del suo sfruttamento nei sistemi ingegnerizzati è un campo vitale e in rapida crescita di ricerca e sviluppo1-3. Lo studio di questi microrganismi elettroattivi (o bioelettrocatalitici o elettrochimicamente attivi), compresi i ceppi puri così come le co-colture definite e i consorzi complessi, richiede un complesso arsenale di tecniche, metodi e protocolli4. Questi metodi derivano da diverse discipline scientifiche, ad esempio l'elettrochimica, la scienza dei materiali, la microbiologia, e forniscono informazioni su diversi livelli gerarchici, ad es. dall'intero biofilm microbico alle singole molecole. In questo modo, l'elettrochimica e i metodi elettrochimici rappresentano il fondamento di tutte le attività.

Tradizionalmente, le configurazioni del tipo a celle a combustibile venivano spesso utilizzate per la crescita e il mantenimento di colture microbiche elettroattive nell'archetipo di questi sistemi ingegnerizzati: celle a combustibile microbiche (MFC)5. Sfortunatamente, questi tipi di MFC spesso non consentivano il monitoraggio o il controllo del potenziale di un singolo elettrodo e quindi erano possibili solo informazioni limitate sui processi degli elettrodi: veniva riportata solo la tensione della cella. Ora è sempre più riconosciuto che il monitoraggio e il controllo individuale dei potenziali dei singoli elettrodi negli MFC rappresentano un chiaro vantaggio, non solo per la ricerca di base ma anche per l'ingegneria. Inoltre, con la diversificazione delle applicazioni delle tecnologie elettrochimiche microbiche che ora includono, ad esempio, la bonifica, la desalinizzazione, le sintesi e persino il biocomputing, nei cosiddetti sistemi bioelettrochimici microbici (BES)2,6,7, un controllo esterno dei singoli potenziali elettrodici è spesso sostanziale. Questo controllo si ottiene solitamente utilizzando fonti di alimentazione esterne o potenziostati. In questo modo, l'uso di potenziostati consente, a differenza di altri tipi di configurazioni, una regolazione esatta del potenziale del singolo elettrodo. Questo è di grande importanza in quanto l'elettrodo rappresenta l'accettore di elettroni microbico terminale (per gli anodi) o il donatore di elettroni (per i catodi) del trasferimento di elettroni extracellulare. La Figura 1 illustra lo stato attuale delle conoscenze sull'EET microbico agli anodi, vedere per i dettagli, ad esempio 2,4,6,8,9 L'EET al catodo è ancora per lo più non sfruttato10.

Quindi il controllo del potenziale dell'elettrodo consente non solo l'uso di condizioni di coltura microbica riproducibili, ma anche la sua personalizzazione in termini di termodinamica EET11. All'interno di questo articolo viene dimostrato come i parametri caratteristici dei biofilm microbici elettroattivi possano essere estratti da esperimenti di reattori alimentati utilizzando la cronoamperometria (CA) e la voltammetria ciclica (CV). Ciò include i parametri di prestazione, la densità di corrente massima (jmax) e l'efficienza coulombica (CE), nonché le caratteristiche EET. Qui l'identificazione dei potenziali formali (Ef) dei possibili ed effettivi siti di trasferimento di elettroni sarà focalizzata. L'estrazione di questi parametri è mostrata sull'esempio dei biofilm di coltura mista derivati dalle acque reflue che sono dominati da Geobacter spec. 12 Questi biofilm derivati dalle acque reflue vengono ottenuti mediante una semplice procedura di selezione elettrochimica, come dimostrato da numerosi gruppi di ricerca in tutto il mondo13-16.

Tecniche elettrochimiche dinamiche per studiare il trasferimento di elettroni extracellulari microbici

Per una caratterizzazione termodinamica dell'EET di colture microbiche elettroattive sono necessarie tecniche elettrochimiche dinamiche. In generale queste tecniche includono il potenziale controllato, cioè voltammetrico, e il controllo della corrente, cioè Galvanodinamica, tecniche17. Pertanto, le tecniche potenzialmente controllate sono più diffuse e includono, ad esempio, la voltammetria a onda quadra e la voltammetria a scansione lineare18. La più popolare, tuttavia, è la voltammetria ciclica (CV)19,20. La CV è ben nota e diffusa in diversi campi dell'elettrochimica che vanno dalla ricerca sulle batterie alla scienza dei materiali fino alla bioelettrochimica enzimatica21. La sua applicazione alle cellule microbiche viventi può essere fatta risalire solo a più di un decennio22 e aumenta significativamente negli ultimi anni23,24. In particolare, la combinazione di CV e metodi spettroscopici ha fornito intuizioni senza precedenti sui meccanismi dell'EET e sulla sua natura molecolare, ad esempio.25,26 Parallelamente, il quadro teorico per l'estrazione delle caratteristiche termodinamiche e teoriche dell'EET microbico è stato ampliato e approfondito27-30. Al contrario, tuttavia, una cattiva gestione sperimentale o un'analisi inadeguata dei dati spesso ostacolano l'applicazione appropriata della CV nel campo della bioelettrochimica microbica. Pertanto, oltre ai workshop (ad esempio all'EU-ISMET 2012) e ai tutorial19, questo video-articolo fornirà una guida di base per la conduzione di esperimenti voltammetrici ciclici su batteri elettroattivi. In tal modo si sta concentrando sulle fasi sperimentali di base e sull'analisi fondamentale dei dati e non intende fornire i più recenti protocolli di analisi cinetica. I termini più importanti per la discussione che segue sono riassunti nel riquadro 1 (adattato da Harnisch e Freguia19 e modificato).

Protocollo

Poiché la procedura di selezione nel reattore bioelettrochimico alimentato è molto specifica a causa della scelta del substrato e delle condizioni anossiche, lavorare in condizioni sterili non è necessario per l'esempio dimostrato.

1. Preparazione del terreno di crescita

  1. Preparare una quantità adeguata di terreno di coltura utilizzando un tampone fosfato secondo Kim et al.13 (cfr. tabella 1). Qui, l'acetato di sodio (10 mM) funge da substrato. Il terreno di coltura utilizzato in questo articolo è solo un esempio e, a seconda dello scopo sperimentale, può variare nei suoi componenti.
  2. Aggiungere 1 ml di acque reflue primarie per 20 ml di terreno di coltura come inoculo. Il campione di acque reflue viene prelevato da un impianto di trattamento delle acque reflue municipali dopo la filtrazione meccanica (vedi ad esempio Figura 2) e può essere conservato fino a tre mesi fino all'uso in un contenitore chiuso a 4 °C.
    (Nota: a seconda dell'obiettivo dell'esperimento, l'esatto conteggio iniziale delle cellule può essere importante e quindi dovrebbe essere determinato. Nell'esempio dimostrato, la conta cellulare iniziale non è importante, poiché il biofilm raggiunge condizioni di stato stazionario.)
  3. Sciacquare il terreno, compreso l'inoculo, con azoto per almeno 30 minuti per disaerarlo, inserendo un ago nel terreno e accendere il flusso di azoto. Il flusso dovrebbe essere abbastanza forte da poter osservare una miscelazione completa del mezzo.
    (Nota: a seconda del volume del fluido, si dovrebbe anche considerare di prolungare il tempo di disaerazione. Durante l'impostazione della disaerazione del reattore a batch alimentato (passaggi 2.1-2.2))

2. Configurazione del reattore Fed-batch

  1. Prendi un recipiente del reattore adatto: qui viene utilizzato un pallone a fondo tondo modificato a 4 colli da 250 ml.
    (Nota: in generale la nave dovrebbe avere almeno quattro insenature. Questi sono necessari per i tre elettrodi e per il campionamento/scambio di fluidi. I volumi di gas prodotti possono essere trascurati quando il reattore viene aperto regolarmente a causa del campionamento o del cambio del fluido, in alternativa è necessario installare un contabolle. Al fine di evitare una crescita fototropica indesiderata, i reattori devono essere schermati dall'esposizione diretta alla luce.)
  2. Per la configurazione a tre elettrodi (vedere la Figura 3 e la sezione 3 per i dettagli), posizionare l'elettrodo di riferimento (RE) (qui Ag/AgCl, sat. KCl, 0,197 V vs. SHE), l'elettrodo di lavoro (WE) e il controelettrodo (CE) nel pallone attraverso ingressi individuali tramite tappi in silicone – sigillare ermeticamente.
    (Nota: come WE e CE vengono utilizzate barre di grafite. Il filo degli elettrodi viene tirato attraverso il tappo in silicone e fissato esternamente. L'elettrodo di riferimento viene fatto passare attraverso il tappo in silicone attraverso un foro praticato. Per evitare cortocircuiti, assicurarsi che non vi sia contatto fisico degli elettrodi, anche durante l'agitazione o il ricircolo del fluido. Posizionare gli elettrodi che sono completamente coperti con una soluzione media. Per la sigillatura, avvolgere il tappo in silicone di ogni ingresso con Parafilm.)
  3. Versare il terreno di coltura, compreso l'inoculo (qui 250 ml) attraverso la porta di campionamento nel reattore, mentre si risciacqua con l'azoto.
  4. Chiudere l'ultimo ingresso con un tappo in silicone e sigillarlo ermeticamente. Nota: le tracce di ossigeno non danneggiano i biofilm delle specie miste. Sono in grado di resistere e persino consumare bassi livelli di ossigeno, il che a sua volta può ridurre l'EC.

3. Crescita cronoamperometrica del biofilm

  1. Collegare gli elettrodi ai rispettivi cavi del potenziostato. Posizionare il recipiente in una camera a temperatura controllata, qui si utilizzano 35 °C31, in modo da garantire condizioni ambientali costanti.
  2. Apri il software per controllare il potenziostato e scegli la tecnica: Cronoamperometria. Impostare i parametri ad esempio come segue: Un potenziale costante EWE di 0,2 V (rispetto ad Ag/AgCl) per una durata t di 500 ore (≈ 20 giorni). La corrente viene registrata in passi di tempo dti ogni minuto.
    Nota: La scelta del potenziale applicato dipende dal sistema/microrganismo studiato. Generalmente i processi anodici sono studiati a potenziale positivo e i processi catodici a potenziali negativi. Si può anche dedurre un potenziale adatto dai potenziali standard del donatore/accettore di elettroni e dal potenziale formale del sito di trasferimento di elettroni microbico atteso, qui come punto di partenza, si prega di fare riferimento alla letteratura recente.
  3. Avviare la cronoamperometria. Il software traccia un grafico della corrente misurata nel tempo, la corrente massima osservata (imax) è un importante parametro online, come discusso nelle sezioni 4 e 5.

4. Manutenzione del biofilm

  1. A seconda delle condizioni ambientali, ad esempio della temperatura, una corrente ossidativa inizia a fluire e raggiunge un plateau (vedi Figura 4). Dopo aver raggiunto nuovamente la corrente zero, mettere in pausa la misurazione cronoamperometrica e reintegrare la soluzione del fluido. Per una crescita più rapida del biofilm, sostituire il fluido subito dopo aver raggiunto il plateau della corrente massima. Aprire la porta di campionamento e con cautela, senza distruggere il biofilm sottile, scaricare il fluido. Durante il riempimento del fluido, sciacquare nuovamente con azoto. Chiudere la porta di campionamento e sigillare ermeticamente.
  2. Ripetere la procedura del punto 4.1. fino a quando la corrente ossidativa massima raggiunge uno stato stazionario (vedi Figura 4).
    (Nota: si ritiene che una costante imax indichi una formazione stabile di biofilm allo stato stazionario.)
  3. Prelevare campioni da 1 ml della soluzione fresca e del terreno di scambio per l'analisi del substrato, ad esempio mediante HPLC. La concentrazione iniziale del substrato (acetato) (c 0) e la concentrazione della soluzione rimanente del substrato (c1) sono successivamente necessarie per i calcoli dell'efficienza (vedere la sezione Analisi dei dati).
    Nota: Per ottenere risultati inalterati, ad esempio a causa di un ulteriore consumo di substrato, analizzare immediatamente i campioni di substrato. Se ciò non è possibile, conservare i campioni in un congelatore a una temperatura minima di -18 °C per non più di un mese.)

5. Applicazione della voltammetria ciclica per studiare l'EET

  1. Eseguire la voltammetria ciclica ai massimi e ai minimi del flusso di corrente come indicato (Figura 4). A seconda della domanda di interesse, il CV di solito viene eseguito quando il sistema ha raggiunto lo stato stazionario per ottenere risultati comparabili. (Nota: la generazione di corrente è definita condizioni di turnover ed è correlata all'ossidazione microbica del substrato e al successivo trasferimento di elettroni: bioelettrocatalisi microbica; mentre i CV senza turnover vengono eseguiti a un flusso di corrente (quasi) nullo nel CA.)
  2. Scegliere nel software di controllo del potenziostato la tecnica: Voltammetria ciclica, e impostare i parametri appropriati, qui ad esempio: Un potenziale iniziale da EWE a Ei di -0,5 V vs. RE con una velocità di scansione v=dE/dt di 1 mV/sec a un potenziale di vertice E1 di 0,3 V vs. RE e di nuovo al potenziale di partenza E2 = Ei di -0,5 V.
    Nota: Quando si utilizza la voltammetria ciclica, la tensione applicata al WE viene modificata linearmente con il tempo dal potenziostato (vedi Figura 5) - La casella 2 fornisce le regole di principio per la scelta dei parametri dell'esperimento e la risoluzione dei problemi).
  3. Avviare la voltammetria ciclica e registrare tutti i cicli necessari per eseguire un CV riproducibile. Di solito, sono necessari almeno 3 cicli. Il grafico risultante è chiamato voltammografia ciclica (vedere anche la Figura 7). Nota: A seconda delle condizioni di misurazione, è possibile ottenere informazioni diverse, come dimostrato nella sezione successiva.

6. Tracciamento dei dati

Qui viene discusso solo il tracciamento dei dati. Un trattato più dettagliato segue nella sezione successiva.

  1. Utilizzare un software di analisi dei dati appropriato, qui tutti i dati vengono esportati come testo e importati come file ASCII.
  2. Calcola e usa preferenzialmente le densità di corrente (j) e non le correnti assolute (i).
    (Nota: Tuttavia, poiché esistono diversi protocolli per il calcolo di j, chiarire quale è stato utilizzato. Qui la densità di corrente per geometrico, cioè proiettata, viene utilizzata la superficie dell'elettrodo.)
  3. Cronoamperometria: Traccia la densità di corrente misurata in funzione del tempo.
  4. Voltammetria ciclica: Traccia la densità di corrente misurata in funzione del potenziale del WE Ewe.

Risultati

1. Cronoamperometria

Da misurazioni cronopotentiometriche è possibile calcolare due caratteristiche operative: la densità di corrente massima (jmax), ovvero il massimo flusso di elettroni al secondo, e l'efficienza coulombica (CE), ovvero il flusso di corrente totale in relazione al substrato consumato. Figura 4 mostra una curva tipica di crescita di un biofilm ottenuta mediante cronopotentiometria, relativa a diversi cicli di crescita in un reattore a carico intermittente. Dopo la fase iniziale di latenza, si osserva un primo massimo di densità di corrente. Successivamente, la corrente diminuisce nuovamente a causa dell'esaurimento del substrato. Quando il flusso di corrente raggiunge (quasi) zero, il mezzo viene sostituito, come indicato. Dopo questo ripristino del substrato, la densità di corrente aumenta nuovamente e il massimo successivo è superiore al precedente. Dopo diversi cicli di crescita, jmax diventa costante – segno di una formazione stabile del biofilm14. Poiché il valore di jmax allo stato stazionario dipende da diversi parametri, ad esempio materiale dell'elettrodo, temperatura del reattore e composizione del biofilm, esso è spesso considerato una caratteristica specifica di un determinato sistema costituito da biofilm microbico elettroattivo elettrodo. (Nel caso di reattori a flusso continuo, non si utilizza jmax, ma la densità di corrente costante allo stato stazionario.) La seconda caratteristica operativa è l'efficienza coulombica (CE) (Equazione 1). Essa rappresenta il numero di elettroni registrati come flusso di corrente elettrica, Qp, per ogni ciclo di alimentazione intermittente, rapportato al numero teorico massimo di elettroni Qth, calcolato a partire dal consumo di substrato durante tale ciclo.

Formula dell'equilibrio statico CE=QP/Qth×100; calcolo dell'efficienza in un diagramma di processo.

(Equazione 1)

La carica totale trasferita può essere ottenuta integrando la curva di CA (si veda anche Figura 6):

Calcolo della carica elettrica, equazione, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), metodo di integrazione.

(Equazione 2)

La carica elettrica teoricamente possibile viene calcolata mediante la legge di Faraday:

Equazione termodinamica Qth=ΔcVzF, analisi del potenziale chimico, uso didattico.

(Equazione 3)

Dove V è il volume del mezzo di crescita, F la costante di Faraday (F = 96.485,34 C/mol), z il numero di elettroni rilasciati dal substrato ossidato (nel caso dell'acetato vengono rilasciati 8 elettroni durante l'ossidazione a CO2) e Δc = c0-c1, che rappresenta il consumo del substrato (determinato mediante metodi di analisi chimica, ad es. tramite HPLC).

2. Voltammetria ciclica:

I voltammogrammi ciclici sono registrati in condizioni di non-attivazione e in condizioni di attivazione (come indicato in Figura 4). In entrambi i casi è possibile ottenere diversi tipi di informazioni. Nel seguito si discute come identificare i siti di trasferimento di elettroni possibili e effettivi.

2.1 Condizioni di non turnover – identificazione di siti EET possibili:

Figura 7 mostra tipici voltammogrammi ciclici in condizioni di non turnover, ovvero in assenza di substrato. Figura 7A mostra il voltammogramma ciclico di un biofilm a velocità di scansione elevate (qui 50 mV/sec), in cui può essere identificata una sola coppia di picchi e quindi un solo potenziale formale Ef. In generale, il potenziale formale di una coppia redox può essere calcolato a partire dal potenziale di picco dell'ossidazione EpA e dal potenziale di picco della riduzione della rispettiva specie EpC facendone la media aritmetica (vedi anche Figura 7C):

Equazione di elettrochimica: Ej = (EpA + Epc)/2, analisi del potenziale redox negli studi di voltammetria.

(Equazione 4)

Applicando una velocità di scansione sufficientemente bassa al medesimo biofilm (qui 1 mV/s), è possibile identificare fino a quattro coppie redox (i rispettivi potenziali formali sono indicati in Figura 7B). Il motivo è che la corrente capacitiva di fondo diminuisce quando si utilizzano velocità di scansione più basse, si veda anche Box 1 ed es.17,21 per maggiori dettagli. Tuttavia, la CV in condizioni di nonturnover mostra soltanto tutti i composti redox attivi all'elettrodo e quindi il valore di Ef dei siti EET possibili. Solo l'analisi della CV in condizioni di turnover fornisce il valore di Ef dei siti di trasferimento EET effettivi (si veda il passo 2.2.).

Quando si analizzano ulteriormente i CV in assenza di turnover, è possibile esaminare diversi altri parametri caratteristici come la separazione dei picchi ΔEp (Equazione 5) o la corrente massima del picco ipA e la corrente minima del picpo ipC (vedi Figura 7C).

Equazione di equilibrio statico ΔEP=EpA-EpC; diagramma della formula a scopo didattico.

(Equazione 5)

Questi parametri, specialmente quando registrati a diverse velocità di scansione, possono essere utilizzati per l'analisi meccanicistica e cinetica dei processi di trasferimento di elettroni agli elettrodi. Tuttavia, questa analisi cinetica, ben consolidata per i sistemi chimici, non è immediata per i biofilm microbici elettroattivi, si veda e.g.19,30

  1. Condizioni di turnover – identificazione dei siti EET effettivi:

Quando si esegue la misurazione della CV in presenza di substrato, si ottiene una CV di turnover (vedi Figura 8A). Dopo aver tracciato i dati, è possibile osservare la tipica curva a forma di S, detta bioelettrocatalitica17-19. Analizzando ulteriormente i dati, il massimo della derivata prima, cioè il punto di flesso della curva CV, fornisce il potenziale formale Ef del sito(i) EET effettivo (vedi Figura 8B). Nel caso di un biofilm giovane, ovvero sottile, dominato da Geobacteraceae, qui a 168 h dall'inizio della CA, possono essere osservati due punti di flesso. Di conseguenza, la derivata mostra due massimi corrispondenti ai potenziali formali dei siti EET attivi dal punto di vista bioelettrocatalitico: -0,376 V e -0,295 V rispetto ad Ag/AgCl (KCl sat., 0,197 V rispetto a SHE). Nella Figura 7B questi siti sono indicati rispettivamente come Ef,2 e Ef,3. Questo risultato mostra anche che i processi redox associati ai potenziali formali Ef,1 e Ef,4 (nella CV senza turnover) non sono correlati alla bioelettrocatalisi. Man mano che il biofilm cresce e diventa più spesso, la CV mostra un solo punto di flesso, cioè un solo massimo nella curva derivata. Questo potenziale formale Ef, qui pari a -0,32 V rispetto ad Ag/AgCl (KCl sat.), è (approssimativamente) uguale alla media aritmetica dei due potenziali formali attribuiti al trasferimento di elettroni extracellulari (EET) nel biofilm sottile (ad es. qui Ef,2 e Ef,3) – vedi Figura 9. Ciò dimostra che questa analisi fondamentale della CV fornisce informazioni sulla termodinamica dell’EET in modo rapido e non invasivo, ma è importante notare che non consente di trarre ulteriori conclusioni meccanistiche o cinetiche.

È degno di nota che i biofilm ottenuti nelle condizioni specifiche di questo protocollo siano fortemente dominati da specie del genere Geobacter (non dimostrato qui)12,15. La modifica di parametri selezionati, ad es. substrato, temperatura, ecc., influenzerà anche la composizione microbica e, di conseguenza, le proprietà elettrochimiche.

Tabella 1. Mezzo di crescita secondo Kim et al.32

Componente(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
acetato di sodio820.00
soluzione di metalli12.50
soluzione vitaminica12.50
Tabella 2. Componenti della soluzione di metalli e vitamine33.
Soluzione di elementi in tracce:Soluzione vitaminica:
Componentemg/L   Componentemg/L   
Acido nitrilodiacetico1,500.0Biotina2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Acido folico2.0
MnSO4•2H2O         500.0Cloridrato di piridossina10.0
NaCl  1,000.0Cloridrato di tiamina5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavina5.0
CoSO4 o CoCl2     100.0Acido nicotinico5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Pantotenato di calcio5.0
ZnSO4   130.0Vitamina B120.1
CuSO4•H2O10.0Acido p-aminobenzoico5.0
AlK(SO4)2               10.0Acido lipoico5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
Nota: Sciogliere l'acido nitrilodiacetico con KOH fino a pH 6,5, quindi procedere aggiungendo i minerali.


Diagramma di terminologie bioelettrochimiche; include equazioni e formule in elettrochimica.
Impostazioni dei parametri di voltammetria ciclica e guida alla risoluzione dei problemi, con particolare attenzione all'aggiustamento della finestra di potenziale e della velocità di scansione per esperimenti CV ottimali.

Diagramma del trasferimento extracellulare di elettroni nei microrganismi; vie MET, DET, MIET, DIET; analisi del trasporto di elettroni.
Figura 1. Schema dei possibili meccanismi di trasferimento extracellulare di elettroni nei microrganismi. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Processo di campionamento dell'acqua; campionatore a secchio che raccoglie campioni dal flusso del trattamento delle acque reflue.
Figura 2. Campionamento presso l'impianto di trattamento delle acque reflue dopo il collettore a griglia (impianto di trattamento delle acque reflue, Germania). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Schema della cella elettrochimica e foto con potenziostato, configurazione degli elettrodi; CE, RE, WE indicati.
Figura 3. Configurazione a tre elettrodi. (A) Schema, (B) reattore reale; CE = elettrodo contatore, RE = elettrodo di riferimento, WE = elettrodo di lavoro con biofilm microbico elettroattivo, SP = porta di campionamento. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Grafico elettrochimico; analisi CV; corrente rispetto al tempo; approccio allo stato stazionario; dati in microampere e ore.
Figura 4. Andamento della crescita di un biofilm su inoculo da acque reflue in regime fed-batch misurato mediante cronoamperometria. La corrente ossidativa raggiunge uno stato stazionario dopo tre cicli di rinnovo del mezzo. Sono indicati la fase di latenza e i tempi dei rinnovi del mezzo e delle acquisizioni di voltammetrie cicliche (CV) in condizioni di turnover e non di turnover per valutare lo stato stazionario del biofilm (dati grezzi da Liu14). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Analisi elettrochimica, diagramma E-t, voltammetria ciclica, potenziale rispetto al tempo, chimica analitica.
Figura 5. Andamento del potenziale nel tempo durante un ciclo di voltammetria ciclica. La voltammetria ciclica inizia dal potenziale iniziale Ei. La tensione applicata viene quindi variata linearmente nel tempo con una velocità di scansione v. A un potenziale di vertice scelto E1, la tensione ritorna a un potenziale finale E2, in questo caso E2 = Ei. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Grafico di analisi elettrochimica con densità di corrente j in funzione del tempo t, che illustra il picco jmax.
Figura 6. Chronoamperogramma tipico di un ciclo di crescita di un biofilm derivato da acque reflue; in questo grafico sono indicati la densità di corrente massima jmax, la carica elettrica (pratica) fluente Qp, il campionamento della concentrazione iniziale del substrato c0 e la concentrazione del substrato dopo un ciclo di crescita c1 . Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Grafico di analisi elettrochimica; diagrammi di voltammetria ciclica che mostrano i risultati di corrente rispetto alla tensione.
Figura 7. Voltammogrammi ciclici senza turnover di un biofilm di G. sulfurreducens. Velocità di scansione: (A) 50 mV/sec, (B) 1 mV/sec 23; (C) ingrandimento di B, che mostra la densità di corrente al picco (jpA) e il rispettivo potenziale al picco (EpA) dell'anodo ai massimi. Analogamente, ai minimi sono mostrate la densità di corrente al picco (jpC) e il rispettivo potenziale al picco (EpC) del catodo. Il potenziale formale Ef e la separazione dei picchi ΔEp derivano rispettivamente dalla Equazione 4 e dalla Equazione 5 (per dettagli vedere il testo riportato sotto). Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Analisi elettrochimica; grafico voltammetrico; corrente rispetto al potenziale; rilevamento dei picchi; analisi dati.
Figura 8. (A) Voltammogramma ciclico di turnover di un biofilm metabolizzante di G. sulfurreducens. La velocità di scansione era di 5 mV/sec. (B) Derivate prime della curva voltammetrica23. Sono indicati i potenziali formali dei veri siti di trasferimento extracellulare di elettroni (EET): Ef,2 e Ef,3. Cliccare qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
Figura 9. (A) Voltammogramma ciclico di turnover e (B) derivate prime di un metabolizzante più spesso G. sulfurreducens biofilm. La velocità di scansione era di 5 mV/sec (confronta Figura 8). Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Discussione

Il protocollo presentato mostra un modo semplice e diretto per far crescere biofilm microbici elettroattivi da acque reflue inoculate utilizzando una configurazione a tre elettrodi in un reattore a lotti alimentati. La cronoamperometria consente la crescita e la selezione di biofilm microbici elettroattivi da diversi inoculi, nonché la caratterizzazione fondamentale dei biofilm in termini di massima densità di corrente ed efficienza coulombica. La voltammetria ciclica, essendo una tecnica non invasiva, consente di eseguire studi fondamentali sulla termodinamica EET del biofilm microbico e quindi di identificare possibili ed effettivi siti di trasferimento EET. Insieme, questi parametri consentono i) di caratterizzare e confrontare diversi biofilm microbici per condizioni identiche e ii) di studiare l'impatto di diverse condizioni operative su biofilm microbici elettroattivi identici. Tuttavia, questi esperimenti possono essere solo un punto di partenza. Da un lato, il campo multiforme della bioelettrochimica microbica richiede un ulteriore e approfondito sfruttamento di metodi e protocolli elettrochimici. Ciò include, ad esempio, modelli per l'estrazione di dati cinetici e meccanicistici, nonché altri metodi come la spettroscopia di impedenza elettrochimica34,35. D'altra parte, i metodi elettrochimici non possono fornire informazioni sulla natura molecolare, la composizione microbica, l'organizzazione microbica spaziale, ecc. Qui sono necessarie ulteriori tecniche non invasive e accoppiate all'elettrochimica o invasive4. Il riquadro 2 fornisce una breve discussione sui passaggi critici durante l'esecuzione degli esperimenti e sulla risoluzione iniziale dei problemi.

Dal punto di vista ingegneristico si deve tenere in considerazione che l'anodo di biofilm elettroattivo è solo un componente degli attuali sistemi bioelettrochimici microbici e una moltitudine di altri fattori deve essere analizzata per i sistemi completi36. Tuttavia, speriamo che questo video-articolo aiuti a comprendere e adattare in futuro gli elementi fondamentali del BES, ovvero gli elettrodi microbici.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

F.H. riconosce il sostegno del BMBF (Premio di ricerca "Processi biotecnologici di nuova generazione - Biotecnologia 2020+") e dell'Associazione Helmholtz (Young Investigators Group).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acque reflue primariedi trattamento delle acque refluePrelevato dopo la filtrazione meccanica
250 ml Palloni a fondo tondo con tre ingressi aggiuntiviTh.Geyer Berlin GmbH, Germania9.011 845Ingressi aggiuntivi sono stati fissati dal nostro
elettrodo di riferimento Ag/AgCl per soffiatore di vetro interno (KCl sat., 0,195 V vs. SHE) con membrana in ceramicaSensortechnik Meinsberg, GermaniaSE 11
Barre di grafite (Ø=1 cm, l=3 e 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, GermaniaUtilizzato come materiale dell'elettrodo
Acciaio inossidabile, n. 1.4301, filo Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germania155-923-05
Tappi in siliconeTh.Geyer Berlin GmbH, Germania9.230 512 e
ParafilmneoLab, Heidelberg, Germania3-1011Per la sigillatura per mantenere le condizioni anaerobiche
Potenziostato/ Galvanostato Modello MPG2BioLogic Science Instruments, Francia
EC-LabBioLogic Science Instruments, FranciaSoftware per l'esecuzione di misure elettrochimiche
Origin 8.6Software di analisi dei datiOriginLab
Impianto

Riferimenti

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Inoculo di acque reflueVoltammetria ciclicaCronoamperometriaTrasferimento elettronico extracellulareReattore fed batchConfigurazione a tre elettrodiDensit di corrente massimaEfficienza coulombianaPotenziale formale

Articoli correlati