A Single-fly saggio per comportamento alimentare in Drosophila

Sommario

In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster.

Abstract

Per molti animali, la fame promuove cambiamenti nel sistema olfattivo in un modo che facilita la ricerca di fonti di cibo adeguate. In questo articolo video, descriviamo un test automatico per misurare l'effetto della fame o sazietà su olfattiva dipende comportamento di ricerca di cibo nel frutto adulto Drosophila melanogaster. In una scatola a tenuta di luce illuminato da luce rossa che è invisibile ai moscerini della frutta, una telecamera legata al software di acquisizione dati personalizzato controlla la posizione di sei mosche contemporaneamente. Ogni mosca si limita a camminare nelle singole arene contenenti un odore di cibo al centro. Le arene di test poggiano su un pavimento poroso che funziona per prevenire l'accumulo di cattivi odori. Latenza per localizzare la sorgente odore, un parametro che riflette la sensibilità olfattiva sotto diversi stati fisiologici, è determinata mediante analisi software. Qui, discutiamo i meccanismi critici di funzionamento di questo paradigma comportamentale e copriamo questioni specifiche riguardanti fly loading, contaminazione odore, la temperatura del test, qualità dei dati e l'analisi statistica.

Introduzione

Stati di fame promuovere due tipi di comportamenti appetitivi: ricerca di cibo e di consumo alimentare ^1. Questo semplice test comportamentale è utile per lo studio dei comportamenti chemiotattici associati foraggiamento ^2,3. In particolare, si rintraccia la posizione fly, velocità di piedi e la latenza per l'individuazione di un obiettivo odore di cibo. Latenza di trovare cibo serve come parametro per i cambiamenti nella sensibilità del sistema di rilevamento dell'odore della mosca valle delle variazioni del suo stato appetitivo interna di misura. Una versione manuale di questo test è stato precedentemente utilizzato per mostrare segnalazione dei recettori GABA-B è importante per il comportamento localizzazione odore adulto vola ^3. L'attuale versione automatizzata del test è stato determinante nello studio di come a breve neuropeptide-F (SNPF) Segnalazione rimodella la mappa olfattiva in Drosophila e le influenze appetitiva comportamenti ^2.

Test è fatto in una, temperatura e umidità ambiente controllata scuro. Digitaletelecamere fissate sopra le chiare piastre di prova acrilico tiene in linea retroilluminato da 660-nm illuminazione a LED. Informazioni della telecamera viene elaborato in tempo reale da un computer di stanza vicino alla zona test. Usiamo software di acquisizione dati per registrare e memorizzare le coordinate delle posizioni mosca durante il periodo di prova.

In questo paradigma, il soggetto viene rilasciato in un'arena che contiene un odore di cibo al centro, l'oggetto odore crea una sfumatura odore di cibo all'interno dell'arena che induce il cibo comportamento di ricerca in tempo reale. Un analogo protocollo di ricerca odore è stata applicata verso lo studio di chemosensation in single larve di Drosophila ^7. Mentre altri test comportamentali, come il quattro di campo olfattometro ^4,5 o la t-labirinto ⁶ valutano odore di avversione o attrazione comportamenti, questo paradigma è più adatto per valutare i comportamenti sensibilità e chemiotassi olfattive.

Diversi vantaggi chiave accompagnano questo assay. In primo luogo, permette una rapida acquisizione di grandi insiemi di dati, poiché la raccolta e l'analisi dei dati sono per lo più automatizzati. In secondo luogo, questo saggio isola e misura il comportamento dei singoli mosche, eliminando così stimoli olfattivi sociali che possono influenzare i loro comportamenti. Terzo, la semplicità del protocollo e semplice disegno sperimentale rendono il dosaggio efficiente e facile da insegnare agli altri.

Inoltre, questo test può essere utilizzato per sondare ulteriormente i circuiti neurali sottostanti cibo comportamento di ricerca combinandolo con l'ampia toolkit genetica a disposizione di Drosophila melanogaster ^8. Espressione mirata di transgeni che silenzio o eccitare i neuroni possono essere raggiunti con strumenti come il sistema GAL4-UAS, nonché la ^ts1 UAS-shibire, UAS-tetano-tossina, e UAS-TRPA1 (B) transgeni ^9-12.

Protocollo

1. Fly Raccolta e fame

1. Posteriore linea sperimentali in condizioni di temperatura e umidità controllate (ad esempio 21 ° C, 50-60% di umidità relativa) su una luce di 12 ore / ciclo scuro.
2. Raccogliere femminile vola il giorno della eclosion e luogo loro, insieme con 4-5 maschi, in nuove fiale alimentari (massimo 30 per fiala). Età vola 2-5 giorni.
3. Preparare le camere per volare fame.
   1. Spingere un singolo tessuto (4,8 x 8,4 pollici) fino al fondo di una fiala di plastica vuoto. Completamente bagnare il tessuto con acqua distillata. Utilizzare un oggetto da spingere verso il basso sul tessuto e delicatamente spremere l'acqua in eccesso.
   2. Capovolgere il flaconcino per eliminare l'acqua in eccesso. Ci dovrebbe essere abbastanza acqua per mantenere in linea idratata e la camera di fame umida, ma non abbastanza per annegare le mosche.
4. Trasferire le mosche dal flaconcino cibo in una camera di fame e collegare il flaconcino circa 18-24 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Conservare ilfiale in condizioni di temperatura e umidità controllate durante la notte fino a quando l'esperimento ha inizio il giorno successivo.

2. Preparazione del cibo odore

1. Preparare una soluzione di agarosio 1% aggiungendo 0,1 g di bassa temperatura di fusione agarosio a 10 ml di acqua distillata in un pallone di vetro. Riscaldare la soluzione di agarosio in un forno a microonde solo fino a quando non comincia a bollire, ma ben prima che trabocca.
   1. Arrestare il forno a microonde e agitare il pallone una volta. Ripetere questa operazione altre due volte fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Conservare la soluzione di agarosio allo stato liquido, mantenendo il caldo pallone su una piastra riscaldante a 50 ° C.
2. Aggiungere 990 ml di soluzione di agarosio 1% e 10 ml di aceto di mele in una provetta da 1,5 ml Eppendorf per ottenere una soluzione di aceto di sidro di mele 1%. Vortex la soluzione fino mista e posto in un incubatore bagno secco impostato a 50 ° C.

3. Test ambientale e l'impostazione della Camera comportamento

1. Impostare la sala prove alle condizioni desiderate (ad esempio temperatura e umidità).
2. Accendere il pannello LED (660 nm).
3. Sciacquare i setacci e le piastre di prova con acqua calda e riscaldare in forno fino a quando tutta l'umidità è evaporata. Raffreddare i setacci e piatti giù per la temperatura ambiente di test prima degli esperimenti di inizio.
4. Posizionare un piatto piano sulla parte superiore della piastra diffusore e riempire con acqua per aumentare l'umidità locale e per mascherare l'acqua nella goccia di agarosio.
5. Posizionare i setacci sopra il piatto d'acqua.

4. Vola Loading nelle piastre di prova

Diagrammi con le specifiche per le piastre di prova possono essere trovati nella sezione supplementare Files. La piastra di prova è fatta di acrilico e si compone di 6 arene di prova. Un semplice dispositivo di scorrimento contiene in possesso di camere che permettono fly carico, il contenimento temporaneo, e il rilascio simultaneo di 6 mosche nelle loro rispettive camere al'inizio dell'esperimento. Reticolo inciso al centro di ogni arena nella piastra indicano dove devono essere pipettati odoranti.

1. Inserire i cursori nella piastra test acrilico.
2. Fare scorrere delicatamente l'aspiratore nel flaconcino passato il tappo di cotone e attendere circa 6 mosche di camminare nella aspirator.it è fondamentale per essere i più dolci possibili nella loro movimentazione. Si può approfittare di comportamento mosca phototactic per indurre le mosche a strisciare verso l'aspiratore puntando l'apertura flaconcino verso una fonte di luce fioca. Se necessario, si può anche applicare delicata aspirazione per aspirare circa 6 mosche di sesso femminile.
3. Inserire la punta dell'aspiratore nel primo foro della piastra di prova. Lasciare una mosca per passare nella cella di detenzione e delicatamente avanzare il cursore in avanti per caricare una mosca nel foro successivo. Continuare fino a quando le mosche occupare tutti e 6 i titolari di cellule della piastra.
4. Pipettare 5 ml di sidro di mele soluzione all'1% di aceto agarosio direttamente sul centro della crOSS-peli sulla faccia interna della lastra di prova.

5. Posizionamento della piastra Testing

1. Per centrare la piastra di prova, aprire il file denominato "Posizionamento Tool.vi." "LabVIEW VI per il posizionamento Tool. vi si possono trovare nella sezione supplementare Files. Eseguire il file facendo clic sulla freccia bianca nell'angolo superiore sinistro dello schermo.
2. Posizionare la lastra di prova sopra il setaccio tale che l'apertura dell'arena affronta il pavimento setaccio e la porta odore è sul soffitto della piastra. Allineare il reticolo incisi nel retro della piastra di test con il mirino sullo schermo del monitor.
3. Quando l'allineamento è stato completato, interrompere l'esecuzione cliccando sul puntino rosso che si trova vicino all'angolo superiore sinistro del monitor.

6. Registrare il Fly posizione durante l'esperimento

1. Per monitorare e registrare le coordinate del volo durante ogni prova ricerca di cibo, aprire il file del software di acquisizione "Fly Tracking -. Six Zones.vi "LabVIEW per" Fly Tracking - Six Zones.vi "si possono trovare nella sezione Supplemental Files Eseguire il file facendo clic sulla freccia bianca nell'angolo in alto a sinistra del monitor. .
2. Assegnare un nome al file e fare clic su "OK".
3. Anticipo i cursori nelle camere di prova per rilasciare le mosche nelle arene di prova. Fare attenzione a non spostare le camere test come questo porterà ad allineamento improprio con le coordinate software di analisi.
4. Fare clic su "Start" (inizio registrazione) e garantire che l'unica fonte di luce nella camera di prova è il pannello LED 660 nm.
5. Quando la prova è terminato, rimuovere il setaccio e camera di comportamento. Sollevare la piastra di prova dal setaccio e rimuovere le mosche immergendo la lastra di ghiaccio. Pulire delicatamente la piastra con acqua calda e rimuovere eventuali detriti agarosio. Posizionare le piastre di prova in un forno di essiccazione per rimuovere l'umidità.
6. Ventilare l'area di prova girando su un smalventilatore l per circa 2 min. Accendere il ventilatore e caricare il successivo gruppo di mosche nel piatto test successivo.

7. Analisi dei dati Utilizzo di software personalizzato

"Analisi dei dati per Fly rilevamento a sei zone" può essere trovato nella sezione supplementare Files. Durante l'acquisizione dei dati, le coordinate della posizione mosca individuo record software di acquisizione per ogni punto temporale in un file di testo. Una fotocamera digitale singolo posizionato sopra le piastre di prova acquisisce immagini ad un frame rate di 0,5 Hz. Il programma software di analisi "Analisi dei dati per Fly Tracking-sei zone" estrae le informazioni dal file di testo per a) calcolare la velocità media, b) determinare il punto di tempo in cui una mosca che si trova con successo la fonte dell'odore, e c) costruire finestre grafiche che permetterà all'utente di visualizzazione: volare la posizione, la distanza della mosca dalla fonte odore nel tempo e la velocità media mosca nel corso del tempo. Formatta anche i dati per una facile esportazione in un SPREprogramma adsheet. In questa macro, il cibo ricerca di latenza è definito come il punto di tempo in cui vola spendere almeno 5 sec entro un raggio di 5 mm dal centro dell'arena.

1. Aprire il file del software di analisi "Analisi dei dati per Fly Tracking - sei zone". Nella scheda "Windows", fare clic su "Crea nuova tabella". Ripetere questa operazione fino a quando sono stati creati sei tavoli.
2. Nella scheda "macro", cliccare su "Foodfinding". Un pannello principale dovrebbe apparire con le seguenti opzioni: File Open Data Raw per il layout, Apri file Raw dati per il file di dati, Fly Posizione, Distanza, velocità, layout; FormatDataFile.
3. Per visualizzare i dati grezzi senza aggiungere valori a un file di testo, fare clic su "Apri file Raw dati per Layout." Individuare e selezionare il file di dati sperimentali nella finestra del browser che viene visualizzata. Fare clic su "Apri".
4. Clicca su "Fly Location" per visualizzare la posizione di ogni volo in ciascuna delle sei arene (sei piazzole XY raffiguranti ciascuna fly 'posizione s nel tempo dovrebbe apparire sullo schermo).
5. Clicca su "Distanza" per visualizzare la distanza di ogni mosca dalla fonte dell'odore (sei appezzamenti raffiguranti la distanza della mosca dalla fonte dell'odore nel tempo dovrebbe apparire sullo schermo). La linea orizzontale y = 5 MM, indica la soglia a cui la mosca si considera situato alla fonte di cibo.
6. Clicca su "Speed" per visualizzare la velocità media di ciascun volo durante il processo (sei appezzamenti raffiguranti la velocità della mosca nel tempo dovrebbe apparire sullo schermo).
7. Clicca su "layout" per visualizzare un layout con tutte le posizione mosca, distanza e velocità grafici oltre alla velocità media (durante i primi 50 sec) e la latenza di trovare la fonte odori per ciascun volo (Figura 1). Per visualizzare correttamente il layout, può essere necessario regolare i margini. Per fare questo, prima di fare clic sulla finestra di layout. Nella scheda "File", cliccare su "Imposta pagina per il layout." Azzera i margini per0,2 pollici e fare clic su "OK". Subito a sinistra di ogni appezzamento posizione è un piccolo tavolo con le rubriche "Speed" e "Latency". I valori inseriti in ciascuna voce indicano la velocità media in mm / sec e ricerca di cibo la latenza in secondi. Voci vuote sotto Latency indicano la mosca non è riuscito a individuare la fonte degli odori. Cucina latenza di ricerca è definito come il punto di tempo in cui le mosche trascorso almeno 5 secondi entro un raggio di 5 mm dal centro della camera.
8. Per stampare un layout, fare clic sull'area di layout (aggiornamenti layout file corrente). Fare clic su "File" e poi cliccate su "Layout di stampa".
9. Per visualizzare il file successivo, è sufficiente fare clic su "Apri file Raw dati per Layout." Fare clic sul seguente file di dati grezzi che si desidera visualizzare e fare clic su "OK". Fare clic sulla finestra di layout per aggiornare la finestra con il nuovo file di dati.
10. Le impostazioni possono essere salvate in un file di esperimento per un uso successivo.

8. Esportare i dati dail software di analisi dati in un programma di foglio di calcolo

1. Per esportare i dati di velocità e latenza per ogni file, fare clic su "Apri file Raw dati per file di dati." Selezionare un file di dati sperimentali e cliccare su "Apri". Apparirà una nuova finestra del browser.
2. Nella nuova finestra del browser, fate clic destro su "Nuovo" e quindi fare clic su "Documento di testo". Assegnare al nuovo documento di testo. Selezionare il file di testo nuovo nome e fare clic su "Apri". Questo memorizza i dati dal file di dati grezzi in file di testo.
3. Per esportare i dati da un altro file, clicca su "Apri file Raw dati per il file di dati." Fare clic su un altro file e fare clic su "Apri". Selezionare il file di testo dal punto 8.2). Continuare questo processo per i file di dati rimanenti che si desidera esportare.
4. Una volta che tutti i file di dati desiderati sono stati aggiunti al file di testo, fare clic su "File Formato dati". Selezionare il documento di testo utilizzato per memorizzare i dati provenienti dai passaggi precedenti e cliccare su "Apri" (una nuova window si aprirà automaticamente).
5. Creare un nuovo documento di testo nella finestra, assegnare un nome al file e fare clic su "Salva". Questo crea un file di testo che contiene il nome del file, la velocità media, e la latenza per ogni mosca e possono essere importati in un foglio di calcolo.
6. Piazzole cumulativi sono costruiti da dati sul numero totale di mosche raggiungimento dell'obiettivo odore cibo come funzione del tempo (Figura 3).
7. Dati sperimentali sono analizzati per la significatività statistica utilizzando un test z per proporzioni.

Risultati

Il software di analisi dei dati e il layout, di cui un esempio può essere visto in Figura 1, sono utilizzate per valutare le prestazioni di ciascun volo durante la sua prova di 10 min secondo un insieme di criteri di analisi. I seguenti criteri sono utilizzati per determinare se i dati di ogni volo saranno utilizzati per l'analisi dei dati e sono progettati per eliminare le mosche che sono in grado di eseguire l'operazione di ricerca alimentare a causa di infortunio, malattia, stress, o la mancanza di m...

Discussione

In questo protocollo, si descrive una procedura step-by-step per il saggio comportamento di ricerca di cibo. Oltre agli odori legati all'alimentazione, può anche essere adattato per lo studio della capacità della mosca per individuare altri oggetti odore. Ad esempio, può essere applicato verso lo studio del comportamento localizzazione compagno in mosche maschio ³ Ci sono diverse considerazioni aggiuntive per questo protocollo che citeremo qui quest'azienda procedura.:

In ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Aceto di sidro di mele	Spectrum		disponibile in commercio
Agarosio, Tipo VII	Sigma-Aldrich	A0701
	di prova acrilica	personalizzata	contiene 6 arene. Ogni arena ha un diametro di 60 mm e un'altezza di 6 mm. Vedere i diagrammi delle piastre di prova per misurazioni specifiche.
Piattaforma LabVIEW V.8.5	National Instruments	776670-09	per programmi: PositioningTool.vi, FlyTracking--Six Zones.vi NOTA: "elapsed time.vi", "time into file.vi" e "two object detect.vi" sono subroutine incluse che devono essere disponibili per l'esecuzione del programma di acquisizione dati principale "FlyTracking--Six zones.vi".
LabVIEW Vision 8.5
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5
LabVIEW Vision Builder AI 3.5
Igor Pro V.6	Wavemetric, Inc.		piattaforma per macro: analisi dei dati per il Fly Tracking - Sei zone
Basler scA1390-17fm	National Instruments	779980-01	Fotocamera digitale NOTA: driver per fotocamera disponibile su Baslerweb.com
obiettivo da 8 mm	National Instruments	780024-01	Obiettivo per fotocamera digitale Basler
Piastra diffusore in vetro smerigliato	Edmund Optics	personalizzato	Diffonde la luce, 25 cm x 30 cm
US Std. No. 100	Fischer Scientific	04-881X	Setaccio con apertura nominale di 150 μ m
Opzione di illuminazione: 1
LED retroilluminazione: 660 nm (20 cm x 20 cm)	Spectra West	BL47192	un'opzione di illuminazione più semplice ma più costosa.
Alimentatore per retroilluminazione a LED	Spectra West
Opzione di illuminazione 2
>660 nm LED	Superbrightleds	RL5R1330	lunghezza d'onda 660 nm (circa 7 x 7 array di LED per un pannello da 14,7 pollici x 9,75 pollici)
Alimentatore CC lineare	GW Instek	GPS-1830D	Alimentatore per pannello LED
Breadboard senza saldatura	Digikey	922354-ND	Breadboard per LED