Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.
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Articolo metodologico
Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Embrioni metà della gestazione del mouse fase sono state coltivate utilizzando un mezzo di coltura privo di siero preparato da disponibili in commercio integratori multimediali cellule staminali in un sistema di coltura bottiglia di laminazione ossigenato. Embrioni di topo a E10.5 sono stati attentamente isolati dal dell'utero con intatta sacco vitellino e, in un processo che coinvolge manovra chirurgica precisione gli embrioni sono stati gentilmente esteriorizzato dal sacco vitellino, pur mantenendo la continuità vascolare dell'embrione con il sacco vitellino. Rispetto agli embrioni preparati con intatta sacco vitellino o con il sacco vitellino rimosso, questi embrioni esposti tasso di sopravvivenza superiore e progressione evolutiva quando coltivate in condizioni simili. Abbiamo dimostrato che questi embrioni di topo, quando coltivate in un mezzo definito in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C per 16-40 ore, mostrano crescita e sviluppo morfologico paragonabile a gli embrioni in via di sviluppo in utero. Crediamo thè il metodo sarà utile per gli investigatori che hanno bisogno di utilizzare tutta la cultura dell'embrione per studiare le interazioni di segnalazione importanti nell'organogenesi embrionale.
Introduzione
In vitro metodi colturali che utilizzano embrioni integrali sono adatti a studiare meccanismi di segnalazione coinvolti nella organogenesi embrionale che sono altrimenti di difficile accesso in utero. Embrioni integrali forniscono l'integrità dei tessuti e un sostegno adeguato per le interazioni dei tessuti che sono cruciali per la tempestiva presenza di meccanismi di segnalazione essenziali per i diversi processi cellulari durante l'organogenesi. Mentre intere culture embrione di fornire una piattaforma per una pletora di applicazioni come gli studi di trapianto, manipolazioni genetiche e biologiche, studi tallone di impianto, gli studi tos....
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Protocollo
Cultura embrione di topo:
Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con le linee guida del National Institutes of Salute seguente protocollo # A2010 07-119, che è stato esaminato e approvato dalla University of Georgia Institutional Animal Care ed uso commissione, che mantiene costante supervisione regolamentare.
1. Preparazione of Culture Media
- Preparare terreno di coltura utilizzando supporti e integratori di cellule staminali disponibili in commercio nei seguenti importi: KnockOut DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Supplementare (1x), albumina, da siero....
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Risultati
Sviluppo di embrioni di topo ex utero dipende da molteplici fattori a partire dal momento in cui l'utero è isolato dal corpo al tempo gli embrioni sono coltivate. Come illustrato nella Figura 1, la procedura prevede una serie di operazioni, in particolare, la separazione di utero gravido dal corpo (Figura 1A), l'isolamento degli embrioni con intatta sacco vitellino (Figura 1B), esteriorizzazione degli embrioni dal sacco vitellino ( Figura 1C) e.......
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Discussione
Embrioni metà della gestazione topo fase sono state coltivate in un mezzo di coltura privo di siero in un'atmosfera di 95% O 2/5% di CO 2 in un apparecchio di coltura bottiglia rotolamento a 37 ° C. Sviluppo embrionale ex utero è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento in cui il utero è isolato dai topi sacrificati al completamento della coltura (Figura 1). Il fattore più importante che influenza lo sviluppo è il tem.......
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Dichiarazioni
Noi non abbiamo interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dott. Julie Gordon e il Dr. Nancy Manley per il loro consiglio utile con la tecnica cultura. Questo lavoro è stato sostenuto da Glaucoma Fondazione dei Bambini e Sharon-Stewart aniridia Research Trust.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Siero di ricambio | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Integratore | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumina, da siero bovino | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotico - Soluzione antimicotica | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillina (10.000 UI/ml); Streptomicina (10.000 µ g/ml; Amfotericina (250 µ g/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Unità incubatrice di precisione | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Bottiglie di vetro per unità rotante | B.T.C. Engineering | ||
| Gomma siliconica Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cilindro | AirGas Inc. | ||
| Microscopio da dissezione Stemi SV11 Apo | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Incubatore | con | ||
| 2 | Forma Scientific | Modello: 3110 | |
| Cappa di coltura | Nuaire Armadi di sicurezza biologica Classe II TipoA2 | Modello: Nu-425-600 | |
| Bagno d'acqua | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Bilancia per centrifuga | Mettler Toledo | AG285 | |
| , 50 ml | Forbici operative Corning | 430291 | |
| Light | Roboz | RS-6702 | |
| Forbici operative affilate | Roboz | RS-6812 | |
| Pinze per microdissezione, 4 in | Roboz | RS-5211 | |
| Pinze per microdissezione - Hudson (cWALD), 4-3/4 in | Roboz | RS-5237 | |
| Pinzette per microdissezione (5/45) | Roboz | RS-5005 | modificato - Le estremità affilate sono state smussate |
| Pinzette per microdissezione (5) | Roboz | RS-5060 | modificato - Le estremità affilate sono state rese smussate |
| Pinzette per microdissezione (55) | Roboz | RS-5063 | Modificato - Le estremità affilate sono state realizzate smussate |
| Vassoio strumenti | Roboz | RT-1401S | |
| Vassoio strumenti Coperchio | Roboz | RT-1401L | |
| Piastra di Petri-100 mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Piastra di Petri-60 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35 mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Sistema di filtraggio ( 0,22 & micro; m Acetato di cellulosa)-150 ml | 431153 | Corning | |
| (0,22 & micro; m Acetato di cellulosa)-250 ml | Corning | 430756 | |
| Sistema di filtraggio (0,22 &; micro; m Acetato di cellulosa)-500 ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipettor | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Pipetta sierologica-10 ml | VWR | 89130-898 | |
| Pipetta sierologica monouso-25 ml | Corning | 4251 | |
| Pipetta di trasferimento - 7,7 ml | Thermo Scientific | 202-20S |
Riferimenti
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E.
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Ristampe e permessi
