Descriviamo come eseguire l'imaging MRI e PET del cuore del topo. Il protocollo è studiato su misura per valutare l'efficacia del trattamento in modelli di infarto del miocardio e insufficienza cardiaca.
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Articolo metodologico
Risonanza magnetica e PET in modelli murini di infarto miocardico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infarto del miocardio è una delle principali cause di morte nel mondo occidentale. La somiglianza del cuore del topo con il cuore umano lo ha reso un modello ideale per testare nuove strategie terapeutiche.
La risonanza magnetica (MRI) in vivo offre un'eccellente visione del cuore in modo non invasivo con chiari dettagli anatomici, che possono essere utilizzati per una valutazione funzionale accurata. I mezzi di contrasto possono fornire misure di base della vitalità tissutale, ma queste non sono specifiche. La tomografia a emissione di positroni (PET) è una tecnica complementare altamente specifica per l'imaging molecolare, ma priva dei dettagli anatomici della risonanza magnetica. Utilizzate insieme, queste tecniche offrono uno strumento sensibile, specifico e quantitativo per la valutazione del cuore nella malattia e il recupero dopo il trattamento.
In questo articolo spieghiamo come questi metodi vengono eseguiti in modelli murini di infarto miocardico acuto. Le procedure qui descritte sono state progettate per la valutazione di presunti trattamenti farmacologici protettivi. Abbiamo utilizzato la risonanza magnetica per misurare la funzione sistolica e le dimensioni dell'infarto con l'aumento tardivo del gadolinio e la PET con fluorodesossiglucosio (FDG) per valutare la funzione metabolica nella regione infartuata. Il documento si concentra su aspetti pratici come la pianificazione delle sezioni, il gating accurato, la somministrazione di farmaci, la segmentazione delle immagini e la coregistrazione multimodale. I metodi qui presentati raggiungono una buona ripetibilità e precisione mantenendo un'elevata produttività.
Introduzione
Al fine di misurare l'efficacia delle nuove strategie di trattamento per l'infarto del miocardio (IM) negli studi preclinici, è necessaria la valutazione dello stadio acuto e dell'esito a lungo termine1. Metodi come l'istopatologia, i cateteri intracardiaci2 e i modelli cardiaci ex vivo 3 sono comunemente usati per gli studi preclinici sui topi. È impossibile, tuttavia, seguire il trattamento con metodi ex vivo o altamente invasivi. Tecniche di misurazione non invasive come la risonanza magnetica (MRI) in vivo e la tomografia a emissione di positroni (PET) consentono disegni sperimentali longitudinali per la stadiazione della malattia in singoli soggetti. La cine-MRI viene utilizzata per derivare parametri funzionali globali come la massa ventricolare sinistra (LVM), la frazione di eiezione (EF) e la gittata cardiaca (CO). Inoltre, dopo l'iniezione di un mezzo di contrasto al gadolinio, a causa della ridotta perfusione e del washout nell'infarto, la vitalità tissutale può essere valutata con la risonanza magnetica tardiva per l'aumento del gadolinio (LGE). Complementare, la PET offre una misura sensibile delle molecole radiomarcate al fine di valutare il metabolismo tissutale. L'elevata accuratezza di queste tecniche consente di ridurre significativamente il numero di animali necessari per testare nuovi farmaci mirati all'infarto miocardico.
Le procedure PET e MRI sono coinvolte, e senza un protocollo attentamente progettato la riproducibilità è difficile da mantenere. Le procedure stabilite nella clinica per i pazienti richiedono modifiche sostanziali per l'uso nei topi, a causa della loro frequenza cardiaca considerevolmente più veloce e delle dimensioni più piccole del cuore4. C'è un'ampia variazione tra i singoli soggetti, sia al basale che in risposta al danno indotto, quindi è necessario un numero considerevole di topi per stabilire l'efficacia del trattamento.
In questo rapporto, descriviamo il nostro metodo per l'imaging sequenziale PET/MRI del cuore del topo. Entrambe le modalità utilizzano mezzi di contrasto per via endovenosa, che vengono erogati attraverso la vena caudale. La risonanza magnetica consiste in una valutazione standard con Cine-MRI5 con un protocollo ottimale per LGE come descritto nel nostro precedente lavoro6. L'intera procedura di risonanza magnetica dura 30 minuti. Abbiamo ottenuto accessori coerenti per le cuccette dei nostri strumenti in modo che sia possibile trasferire l'animale su una piattaforma con lo stesso apparato di monitoraggio e somministrazione dell'anestesia tra le macchine. La scansione PET dura 45 minuti con iniezione in situ una volta avviata la scansione. Il passaggio finale consiste nel misurare i parametri delle immagini MRI e PET dopo la coregistrazione.
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Protocollo
Tutti i componenti di questo studio sono stati condotti in conformità con l'UK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986, e con l'approvazione dell'Ethical Review Panel dell'Università di Cambridge.
1. Preparazione degli animali
- Indurre infarti con un intervento chirurgico7,8. Per la misurazione nella fase acuta, eseguire l'imaging 24 ore dopo l'intervento.
- Preparare un tubo siringa sottile per la somministrazione del farmaco con un ago da 25 G a un'estremità e una siringa con un ago da 25 G all'altra estremità. La lunghezza della linea dovrebbe essere sufficiente per consentire l'iniezione dall'esterno del foro del magnete (circa 1,5 m).
- Preparare una soluzione diluendo il Gadovist in soluzione fisiologica. Caricare una siringa con la giusta quantità di soluzione per ottenere 3 mmol/kg aggiustati per il peso corporeo del topo. Mantenere il volume di iniezione tra 50-100 μl.
- Preriempire la linea con la soluzione Gadovist. Per evitare la coagulazione del sangue, riempire l'estremità della linea vicino alla cannula con soluzione salina di eparina.
- Posizionare il mouse nella scatola di induzione per l'anestesia con isoflurano al 3% in O2 1 L/min per 3-5 minuti se necessario. La corretta profondità dell'anestesia può essere identificata con il rallentamento della frequenza respiratoria, che dovrebbe diminuire a meno di 70 bpm.
- Incannulare la vena caudale utilizzando la linea precedentemente preparata, utilizzare del nastro chirurgico per mantenere l'ago in posizione durante la procedura.
2. Posizionamento e monitoraggio degli animali
- Posizionare il mouse sul lettino per la risonanza magnetica, erogando l'1-2% di isoflurano in 1 L/min O2 per il mantenimento dell'anestesia, se necessario. Mantenere la frequenza respiratoria tra 20 e 70 bpm.
- Assicurarsi che il centro della bobina MRI si trovi sopra la posizione del cuore del mouse.
- Monitorare la respirazione posizionando un sensore a cuscino respiratorio leggermente sotto il diaframma. Utilizzare un termometro rettale con un vetrino coprioggetti prelubrificato per monitorare la temperatura interna. Assicurarsi che la temperatura sia mantenuta costante durante le scansioni a 37±2 °C.
- Per il monitoraggio dell'ECG, posizionare tre elettrodi sulle zampe anteriori e sulla zampa posteriore sinistra, assicurandosi che il palmo della punta sia completamente aperto. Scegli la coppia di elettrodi che ottiene la migliore qualità del segnale per derivare l'ECG. Attorcigliare insieme i cavi ECG, per assicurarsi che non formino circuiti risonanti alla frequenza di risonanza MRI, che corromperebbero gravemente il segnale ECG durante l'esecuzione di sequenze di impulsi.
- Assicurarsi che gli elettrodi siano saldamente fissati al letto con del nastro adesivo. Gli elettrodi e il cono del naso manterranno l'animale in posizione durante l'intera procedura.
- Posizionare una coperta riscaldata ad acqua sopra il mouse, incapsulando i cavi di monitoraggio e bobina per mantenere la temperatura corporea.
- Allineare il laser del letto con la posizione del cuore; utilizzare la linea delle dita anteriori come punto di riferimento. Posizionarlo nell'isocentro del magnete utilizzando un letto automatico.
- Eseguire le regolazioni standard per il sistema MRI.
- Impostare l'apparecchiatura di monitoraggio per rilevare l'onda R nell'ECG. Regolare le soglie per ciascun mouse e all'interno delle sessioni di imaging in modo da garantire un'attivazione affidabile.
3. Risonanza magnetica
- Acquisire un'immagine pilota per pianificare le immagini pilota multiplanari.
- Identifica il cuore nell'immagine, più facilmente dai suoi artefatti di flusso. Se le immagini mostrano che il mouse non è ben centrato nella bobina o nell'isocentro, ritrarre il letto e ripetere il posizionamento.
- Acquisisci un'immagine GE (Fast Gradient Echo) con cinque sezioni per orientamento e un campo visivo (FOV) di 3 cm con il gating ECG attivato.
- Eseguire una scansione 3D non eseguita centrata sul cuore per la coregistrazione PET (vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione). Durante l'esecuzione di questa scansione, pianificare le analisi successive.
- Pianificare una scansione a quattro camere (4 canali) (vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione). Questo dovrebbe tagliare l'apice e le valvole tricuspide e mitrale, mostrando tutte e 4 le camere.
- Pianificare una vista a due camere (2 canali) (vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione). Dovrebbe tagliare l'apice e la valvola tricuspide, mostrando l'atrio sinistro e il ventricolo.
- Controllo incrociato della geometria delle due viste dell'asse lungo. Se la pianificazione della sezione non è ottimale, ripetere la scansione.
- Pianificare una pila di sezioni ad asse corto (vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione) ortogonali sia alla vista a 4 canali che a quella a 2 canali. Coprire tutto il cuore, a partire dalla prima fetta apicale senza pozze di sangue fino alla prima fetta basale senza alcun RV. Le fette devono essere equidistanti senza spazi vuoti.
4. Miglioramento tardivo del gadolinio
- Aumentare il tempo vuoto per l'acquisizione del gating ogni due battiti cardiaci (TR = 550-750 msec). Deve essere applicato un ritardo in modo tale che l'acquisizione venga eseguita nella fase telediastolica dell'ECG.
- Eseguire una versione a bassa risoluzione della sequenza LGE (vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione) prima dell'iniezione per verificare che il gating sia corretto e che non siano presenti artefatti di flusso. Se sono presenti artefatti di flusso nella fase diastolica, aumentando leggermente il ritardo (cioè l'imaging nella fase molto precoce della sistole) li elimineremo.
- Eseguire l'iniezione della soluzione di Gadovist lentamente e costantemente per 15 secondi.
- Avviare l'imaging LGE (vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione) dopo l'iniezione. Un buon contrasto si ottiene quando si esegue l'imaging entro i primi 15 minuti.
5. Imaging PET
- Trasferire il lettino MRI sullo scanner PET lasciando il ricevitore in posizione e ancorarlo saldamente al supporto del lettino PET. Collegare l'apparecchiatura di anestesia e monitoraggio.
- Posizionare il cuore al centro del campo visivo in PET spostando il letto solo assialmente.
- Acquisisci una scansione a trasmissione a passaggio singolo con una sorgente di germanio.
- Estrarre 10-30 Mbq di FDG marcato radioattivamente dal suo contenitore con una siringa. Prestare la necessaria attenzione con il materiale radioattivo. Misurare l'attività con un contatore di pozzi. Un buon volume di iniezione per i topi varia tra 50-100 μl, se il volume è troppo piccolo, diluire la soluzione con soluzione fisiologica.
- Avviare la scansione delle emissioni, impostare l'acquisizione della PET con gate in modalità elenco per 45 minuti. Contemporaneamente, iniettare il tracciante lentamente e costantemente per 15 secondi. Lavare la linea con una quantità di soluzione salina sufficiente a rilasciare l'intero tracciante radioattivo.
- Per la salute degli animali, non superare i 300 μl con le tre iniezioni (ad es. Gadovist, FDG, flush).
- Riposizionare la siringa nel contatore dei pozzetti per misurare l'attività residua.
- Seguire le regole locali per la manipolazione di materiale radioattivo.
6. Segmentazione MRI
- Caricare le immagini Cine-MRI nel segmento v1.9 9.
- Esegui gli strumenti automatici per la segmentazione. A partire da un punto all'interno del ventricolo, questi gonfieranno le pareti del ventricolo stimate fino a trovare la migliore corrispondenza.
- Delineare manualmente il ventricolo sinistro e il ventricolo destro alla fine della sistole (ES) e alla fine della diastole (ED), definiti rispettivamente come i fotogrammi con il volume ventricolare sinistro globale massimo e minimo. Escludere i muscoli papillari e le trabeculazioni dappertutto. Non regolare il contrasto dell'immagine, poiché l'incoerenza del contrasto porta a una diversa interpretazione degli effetti di volume parziale.
- Delineare manualmente l'epicardio a ES e ED per i calcoli della massa del ventricolo sinistro, come mostrato nella Figura 6. Il muscolo cardiaco è incomprimibile, quindi la massa ventricolare sinistra deve essere costante in ES e ED. Se la differenza è superiore al 5%, è probabile che l'errore dell'operatore sia rivisto e questi dovrebbero essere rivisti.
- Alla base dei ventricoli, utilizzare una linea retta per discriminare i ventricoli dagli atri, come mostrato nella Figura 6, identificando l'angolo della fetta con l'aiuto delle viste dell'asse lungo.
- Effettuare un controllo incrociato della segmentazione sulle viste dell'asse lungo.
- Delinea l'area della cicatrice sulle immagini LGE. Dividere il volume della cicatrice per la massa del ventricolo sinistro derivata nell'imaging cine per ottenere l'infarto come percentuale del ventricolo sinistro.
7. Analisi PET e coregistrazione con risonanza magnetica
- Ricostruisci le immagini PET utilizzando un algoritmo di retroproiezione filtrato 3D ed esporta i dati in formato Nifti (http://nifti.nimh.nih.gov/) mostrando i valori di assorbimento standard.
- Trasforma tutte le immagini PET utilizzando la matrice di trasformazione fissa tra la PET e il sistema MRI. Se la matrice non è nota, riempire un fantoccio geometrico con materiale radioattivo ed eseguire una risonanza magnetica, quindi spostare il letto sulla PET ed eseguire una scansione di emissione. La matrice ottenuta per trasformare la PET nell'immagine MRI è la matrice standard per passare dalla PET al sistema MRI.
- Registra l'immagine PET media nella risonanza magnetica 3D utilizzando lo strumento di coregistrazione di massa SPM-mouse10.
- Impilare le fette da Cine-MRI per ottenere una ricostruzione 3D, interpolare per ottenere una risoluzione isotropa di 0,3 mm. Registrare il volume PET telediastolico nel volume della risonanza magnetica telediastolica utilizzando gli strumenti di coregistrazione SPM-Mouse. Usa la stessa matrice per tutte le altre fasi del cuore.
- Per valutare le dimensioni dell'infarto PET, scegliere il 50% dell'intensità massima nel cuore per discriminare tra voxel infartuati e non infartuati. Esprimere i voxel infarati come percentuale del LV.
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Risultati
Uno dei vantaggi dell'uso della risonanza magnetica è che può essere utilizzato un disegno longitudinale allo scopo di definire le fasi della malattia. Questo è particolarmente importante quando si valutano composti nuovi, poiché il decorso temporale dell'effetto potrebbe non essere noto. Le variazioni nei volumi cardiaci dovute al progredire della malattia nello stesso animale sono mostrate nella Figura 4. La figura mostra chiaramente gli effetti del rimodellamento successivo all'infarto miocardico.
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Discussione
La PET/MRI è un metodo di misurazione completo per la valutazione non invasiva e longitudinale della funzione sistolica, della vitalità tissutale e di specifici marcatori metabolici in modelli murini di infarto del miocardio. Qui abbiamo descritto un protocollo per l'esecuzione sequenziale di risonanza magnetica e PET, in cui la coregistrazione è semplificata dal trasferimento dello stesso letto tra i sistemi. Questa strategia, adottata anche dai produttori di sistemi clinici11, non richiede uno scanner combin...
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Dichiarazioni
Non c'è nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati per il finanziamento da parte della British Heart Foundation a TK e al UK Medical Research Council per una borsa di studio post-laurea per la ricerca in GB.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Gadovist | Bayer Schering Pharma | PL 00010/0535 | |
| FDG | IBA Apparecchiature | ||
| Bruker BioSpec 47/40 | Bruker | ||
| Bruker Letto per topi Bruker | Questo letto include tubi per l'erogazione dell'anestesia e lo scavenging. | ||
| Trasmettitore a gabbia per uccelli da 12 cm di diametro | Bruker | T5346 | |
| Ricevitore a bobina di superficie da 2 cm | di diametro Bruker | T7027 | |
| Elettrodi per il monitoraggio neonatale Red Dot | 3M | P/N: 2330 | |
| Apparecchiatura di monitoraggio | SA Systems | Il kit di monitoraggio comprende un cuscino respiratorio e una sonda rettale per le misurazioni della temperatura. | |
| Apparecchiature per anestesia | Servizi | ||
| Scatola di induzione | Vet Tech Solutions LTD | ||
| Scanner PET/MRI a magnete diviso Cambridge | Università di Cambridge | Per eseguire la PET è stato utilizzato uno scanner PET/MRI personalizzato22 le sue prestazioni PET sono simili a quelle di uno scanner per micropet F12023 | |
| Segment | Medviso, Università | Disponibile gratuitamente | |
| SPM-mouse | Università di Cambridge | Disponibile gratuitamente |
Riferimenti
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