Un approccio biochimico è descritto per identificare in vivo interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine di membrana. Il metodo combina proteina reticolazione, purificazione per affinità e spettrometria di massa, ed è adattabile a qualsiasi tipo cellula o organismo. Con questo approccio, anche l'identificazione degli IPP transitori diventa possibile.
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Articolo metodologico
Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine di membrana In Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine di membrana sono essenziali per la vitalità delle cellule e sono quindi importanti bersagli terapeutici 1-3. Dal momento che funzionano in complessi 4, sono necessari metodi per identificare e caratterizzare le loro interazioni 5. A questo scopo, abbiamo sviluppato l'esperimento di interazione Strep-proteina di membrana, denominata membrana SPINE 6. Questa tecnica combina in vivo reticolazione usando l'reversibile reticolante formaldeide con purificazione per affinità di una proteina di membrana esca Strep-tag. Durante la procedura, proteine preda reticolati sono co-purificati con la proteina esca membrana e successivamente separati mediante ebollizione. Quindi, due compiti principali possono essere eseguiti quando si analizzano le interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine di membrana con membrana SPINE: in primo luogo, la conferma di un partner di interazione proposto da immunoblotting, e in secondo luogo, l'individuazione di nuovi partner di interazione mediante analisi di spettrometria di massa . Inoltre, anche low affinità, PPI transitori sono rilevabili da questa tecnica. Infine, membrana SPINE è adattabile a quasi ogni tipo di cellula, che lo rende applicabile come strumento di screening potente per identificare PPI di proteine di membrana.
Introduzione
Per comprendere la funzione di una proteina è fondamentale conoscere i suoi partner di interazione. Diverse tecniche classiche sono disponibili per l'identificazione di partner di interazione di proteine solubili. Tuttavia, queste tecniche non sono facilmente trasferibili ad proteine della membrana a causa della loro natura idrofoba 4. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato il Strep-proteina esperimento di interazione membrana (Membrane-SPINE) 6. Si basa sul metodo colonna vertebrale, che è adatto solo per le proteine solubili 7.
Benefici membrana e colonna vertebrale da due vantaggi....
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Protocollo
Nota: Le informazioni per i buffer indicati nel protocollo è disponibile in Tabella 1.
1. Fissazione delle interazioni proteina-proteina da formaldeide Cross-linking nelle cellule viventi
- Per iniziare a preparare i terreni di crescita, soluzioni madre e tampone P1
- Preparare medie 500 ml: Il mezzo deve offrire le condizioni che supportano l'interazione tra proteina di membrana esca e proteine preda. Inoltre, un esperimento deve essere effettuato in condizioni in cui si prevede alcuna interazione (ad esempio, senza cross-linking).
Nota: Confrontiamo interazioni proteina-proteina nei....
- Preparare medie 500 ml: Il mezzo deve offrire le condizioni che supportano l'interazione tra proteina di membrana esca e proteine preda. Inoltre, un esperimento deve essere effettuato in condizioni in cui si prevede alcuna interazione (ad esempio, senza cross-linking).
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Risultati
Analisi membrana SPINE permette la co-purificazione di proteine di membrana e transitoriamente interagenti partner proteici. Il co-purificazione è ottenuto utilizzando l'agente formaldeide reticolazione. Due parametri sono fondamentali per evitare aspecifiche legami incrociati: la concentrazione di formaldeide e il tempo di reticolazione. L'uso sufficiente, ma non eccessivo di formaldeide può essere facilmente controllato mediante immunoblotting. Complessi proteici formaldeide reticolati possono essere separati median.......
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Discussione
Analisi membrana colonna vertebrale è un approccio biochimico che permette di confermare e per identificare a questo punto sconosciuti partner di interazione di proteine di membrana. Membrana SPINE combina in vivo reticolazione da formaldeide con purificazione di una proteina di membrana esca Strep-tag. La combinazione con immunoblotting facilita la conferma di partner di interazione previsti (Figura 2). Inoltre, la combinazione con analisi MS consente l'identificazione di partner di inte.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 di SH
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 37% Formaldeide | Roth | 4979.1 | Non deve essere più vecchio di un anno |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA | Pierce | 23225 | |
| Asta micromagnetica | Roth | 0955.2 | 5 mm di lunghezza, 2 mm di diametro |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | detergente standard per solubilizzazione |
| n-Dodecil-beta;-maltoside | Glycon | D97002-C | il miglior detergente per solubilizzare CpxA |
| 1 ml Colonna di flusso per gravità superflow Strep-Tactin | IBA | 2-1207-050 | |
| Set di tamponi per la purificazione delle proteine Strep-tag | IBA | 2-1002-001 | Contiene tampone W e tampone |
| Filtro centrifugo Amicon Ultra-4 | Millipore | UFC803024 | |
| Substrato chemiluminescente SuperSignal West Pico | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Kit di colorazione dell'argento | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Kit di colorazione | Proteome Factory | PS-2001 | |
| Ultracentrifuga |
Riferimenti
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identificat....
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Ristampe e permessi
