Method Article

Saggi per l'individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

DOI:

10.3791/50820

⸱

October 11th, 2013

 ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

In This Article

Summary

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Tre saggi, tra cui l'effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d'azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Abstract

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Per identificare potenziali farmaci antivirali contro il BTV, abbiamo sviluppato, ottimizzato e validato tre saggi qui presentati. Il saggio basato CPE-è stato il primo test sviluppato per valutare se un composto ha mostrato alcuna efficacia antivirale e sono stati utilizzati per lo screening grande libreria di composti. Nel frattempo, la citotossicità di farmaci antivirali potrebbe anche essere valutata utilizzando il saggio basato CPE-. Il dosaggio dose-risposta è stato progettato per determinare il campo di efficacia per l'antivirale prescelto, cioè il 50% della concentrazione inibente (IC 50) o la concentrazione effettiva (EC 50), così come la sua gamma di citotossicità (CC 50). Il saggio ToA è stato impiegato per lo studio iniziale MoA per determinare il meccanismo alla base dei nuovi farmaci antivirali durante il ciclo di vita virale del virus o il possibile effetto su un host macchinario cellulare. Questi test sono essenziali per la valutazione dell'efficacia antivirale nel sistema di coltura cellulare, e sono stati utilizzati per le nostre ricerche recenti portarezione per l'identificazione di una serie di nuovi farmaci antivirali contro il BTV.

Introduction

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BTV è un prototipo di virus a RNA a doppio filamento in genere Orbivirus, famiglia Reoviridae. BTV è una delle malattie più importanti del bestiame domestico, tra cui ovini, caprini, bovini e altri animali domestici, con la perdita di 3.000 milioni dollari / anno nel mondo 1,2. La BTV sierotipo esotico è un importante patogeno animale elencati nella sezione "USDA alta Consequence Bestiame patogeni." Recentemente, il riemergere di BTV ha causato una grave focolaio di malattia in bovini e ovini in diversi paesi in tutto il Nord Europa 3,4. Come risultato della sua rilevanza economica e come sistema modello, BTV è stato oggetto di....

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Protocol

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1. Le cellule, virus e antivirale Compounds

  1. Mantenere cellule BSR, un derivato di criceto neonato (BHK) rene alveoli 10, in mezzo di Eagle modificato da Dulbecco (DMEM) contenente siero fetale di vitello al 5% (FCS), 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina.
  2. Per tutti e tre saggi, cellule piastra in DMEM con 1% FCS, 100U/ml penicillina e 100 pg / ml streptomicina, ottimizzata in precedenza 5. Questo mezzo è indicato come terreno di coltura per tutti e tre saggi.
  3. Incubare tutte le celle in incubatrice a 37 ° C, con 5% di CO 2 e 80-95% di umidità.
  4. Targa-purificare e propagare il tipo 10 BT....

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Results

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1. Efficacia antivirale del composto

Il saggio CPE a base di cellule è stato sviluppato, ottimizzato e validato in vitro utilizzando il kit CTG basata luminescenti a identificare nuovi farmaci antivirali contro BTV come descritto in precedenza 2,5. Il test di risposta ten-dose è stata impiegata per riflettere l'efficacia antivirale e citotossicità di un composto guida identificato misurando il numero di cellule metabolicamente vitali in coltura a base di quantificazione di A.......

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Discussion

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Per l'identificazione iniziale di colpi antivirali, uno dei passaggi chiave per la scoperta di farmaci antivirali e di sviluppo è quello di sviluppare analisi robuste, che prevede la selezione di un indicatore quantificabile, lo sviluppo di un protocollo semplice, ottenendo segnali sufficienti e meno del 10% CV. Quasi tutte le schermate biochimiche o basati su cellule sono progettati per fornire un punto di partenza chimica basato sulla più robusta, semplice e poco costoso saggio, causa la riproducibilità richiesta .......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

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Questo progetto è stato sostenuto dalla concessione 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 dal NIH per Q. Li, e dai fondi IMPACT dal Dipartimento di Medicina a UAB di Q. Li. Il sostegno del Fondo Molette e Auburn University è apprezzato. Ringraziamo anche le assistenze tecniche da Ms. Pulin Che e Mr. Volodymyr Musiienko durante il corso dei lavori.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM mediumGibco1134218Per colture cellulari
FBSGibco16000044Per colture cellulari
0,05% Tripsina-EDTAGibco1000185Per colture cellulari
DPBSGbico1049769Per colture cellulari
Kit CellTiter-Glo (CTG)PromegaTB288Per la misurazione della vitalità cellulare
70% etanoloFisherS25309BDiluito dal 95%
Composti huasil antiviraliNIH MLSMR e sintesi
BTV-10ATCCVR-187
Cella BSRSviluppato internamente
Lettore di micropiastre multimodale Synergy-IIBioTekPer la lettura del segnale luminescente
Dispenserselezionato MicroFloBioTekAggiunta di cellule, virus e reagenti
Micropiastra a fondo piatto a 384 pozzettiCORNING28908031Per colture cellulari
Software Gen. 5BioTekPer l'analisi dei risultati di lettura dal lettore di micropiastre multimodale Synergy-II
GraphPad Prism 5GraphPadVersione 5Per analisi biostatiche e tracciatura
de novo

References

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  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
  3. Meiswinkel, R., et al.

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Tags

Bluetongue VirusCPE Based AssayDose Response AssayTime Of Addition AssayCytopathic EffectCell Viability AssayAntiviral ScreeningEC50 DeterminationCC50 MeasurementMechanism Of Action

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