Microiniezione cella singola per l'analisi cellulare comunicazione

Summary

Descriviamo qui come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi, e fornire alcuni suggerimenti utili. Ci aspettiamo che questo articolo vi aiuterà a tutti di valutare il grado di accoppiamento cellulare a causa di giunzioni funzionali. Tutto qui descritto potrebbe essere, in linea di principio, atto ad altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore a 1000 Daltons.

Abstract

Le giunzioni gap sono canali intercellulari che permettono la comunicazione delle cellule vicine. Questa comunicazione dipende dal contributo di un emicanale da parte di ciascuna cella vicina per formare la giunzione gap. Nelle cellule di mammifero, l'emicanale è formato da sei connessine, monomeri con quattro domini transmembrana e un terminale C e N all'interno del citoplasma. Le giunzioni gap consentono lo scambio di ioni, secondi messaggeri e piccoli metaboliti. Inoltre, hanno ruoli importanti in molte forme di comunicazione cellulare all'interno di processi fisiologici come la trasmissione sinaptica, la contrazione cardiaca, la crescita e la differenziazione cellulare. Descriviamo in dettaglio come eseguire una microiniezione di Giallo Lucifero su una singola cellula per visualizzare la comunicazione cellulare attraverso le giunzioni gap nelle cellule viventi. Si prevede che nelle giunzioni gap funzionali, il colorante si diffonda dalla cella caricata alle celle collegate. È una tecnica molto utile per studiare le giunzioni gap poiché è possibile valutare la diffusione della fluorescenza in tempo reale. Discutiamo di come preparare le cellule e la micropipetta, come utilizzare un micromanipolatore e iniettare un colorante fluorescente a basso peso molecolare in una linea cellulare epiteliale.

Introduction

Giunzioni intercellulari sono canali che permettono l'intercomunicazione tra cellule vicine ^1. Questa comunicazione connette due o più celle confinanti, dove ognuno contribuisce con connessone o hemichannel per formare il canale intercellulare. In cellule di mammifero, la connessone è formata da sei connessine, monomeri con quattro domini transmembrana e un C e terminale N all'interno del citoplasma ^2. Giunzioni non solo permettono il flusso di ioni, secondi messaggeri e piccoli metaboliti, ma contribuiscono anche a molte forme di comunicazione cellulare in molti processi fisiologici, come la trasmissione sinapt....

Protocol

1. Preparazione di cellule

1. Mantenere una cultura di una linea timica cellule epiteliali (IT76M1) o cellule da testare in un incubatore (37 ° C / 5% di CO _2).
2. Lavare le cellule con PBS 1x (ripetere questo punto 3x).
3. Aggiungere tripsina alle cellule per 5 min.
4. Aggiungere mezzo (il doppio del volume di tripsina aggiunto al punto 1.3) con 10% FBS (siero bovino fetale) alle cellule con tripsina e centrifugare (800 xg per 5 min).
5. Contare le cellule in un emocitometro.
6. Regolare la densità di cellule a seconda del tipo di cellule come le cellule devono essere in stretto contatto con l'altro per....

Results

Timica linea di cellule epiteliali IT-76MI sono stati utilizzati per valutare l'accoppiamento colorante da giunzioni in quanto queste cellule sono state descritte per esprimere giunzioni funzionali formati da connessina 43 ^21. La Figura 1 mostra l'iniezione di Lucifer Yellow quando applicato in una cella sotto la punta della pipetta. Dopo alcuni minuti, celle collegate diventano fluorescenti (asterischi) indica la diffusione del colorante fluorescente attraverso l.......

Discussion

Al fine di verificare la presenza di funzionali gap junction intercellulare, l'uso di rivelatori, che sono membrana impermeabile, anche se permeabile da canali intercellulari sono necessari ^16. Fluoresceina, il primo colorante fluorescente per osservare cellula-cellula di accoppiamento ^22, è permeabile tra membrane non giunzionali ³ ed è stato quindi sostituito da Lucifer colorante giallo ^15. Attualmente, per trovare la m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifero giallo	Sigma	L0259
Cloruro di litio	Sigma	L4408
PBS compresse	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Siero fetale bovino	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
tavolo isolato dalle vibrazioni	Newport	VH3036W-OPT	È necessario un tavolo isolato dalle vibrazioni per proteggere gli esperimenti dalle vibrazioni ed evitare danni alle cellule
Micromanipolatore	Narishige	MMO-203	Questa apparecchiatura consente regolazioni di precisione della micropipetta, necessaria per la microiniezione cellulare.
Generatore di corrente	Digitimer	DS2	Per produrre il flusso di colorante attraverso la micropipetta, è stata somministrata una corrente inferiore a un nano ampere utilizzando un generatore di corrente con un elettrodo all'interno della micropipetta o un amplificatore dotato di un circuito di compensazione della capacità (vecchio elettrometro) o funzioni di iniezione di corrente dei nuovi amplificatori patch clamp e il filo di terra immerso nel piatto della piastra. In alternativa, il colorante può essere iniettato da un microiniettore pneumatico, seguendo le raccomandazioni della fabbrica.