Microiniezione cella singola per l'analisi cellulare comunicazione

Summary

Descriviamo qui come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi, e fornire alcuni suggerimenti utili. Ci aspettiamo che questo articolo vi aiuterà a tutti di valutare il grado di accoppiamento cellulare a causa di giunzioni funzionali. Tutto qui descritto potrebbe essere, in linea di principio, atto ad altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore a 1000 Daltons.

Abstract

Le giunzioni gap sono canali intercellulari che permettono la comunicazione delle cellule vicine. Questa comunicazione dipende dal contributo di un emicanale da parte di ciascuna cella vicina per formare la giunzione gap. Nelle cellule di mammifero, l'emicanale è formato da sei connessine, monomeri con quattro domini transmembrana e un terminale C e N all'interno del citoplasma. Le giunzioni gap consentono lo scambio di ioni, secondi messaggeri e piccoli metaboliti. Inoltre, hanno ruoli importanti in molte forme di comunicazione cellulare all'interno di processi fisiologici come la trasmissione sinaptica, la contrazione cardiaca, la crescita e la differenziazione cellulare. Descriviamo in dettaglio come eseguire una microiniezione di Giallo Lucifero su una singola cellula per visualizzare la comunicazione cellulare attraverso le giunzioni gap nelle cellule viventi. Si prevede che nelle giunzioni gap funzionali, il colorante si diffonda dalla cella caricata alle celle collegate. È una tecnica molto utile per studiare le giunzioni gap poiché è possibile valutare la diffusione della fluorescenza in tempo reale. Discutiamo di come preparare le cellule e la micropipetta, come utilizzare un micromanipolatore e iniettare un colorante fluorescente a basso peso molecolare in una linea cellulare epiteliale.

Introduction

Giunzioni intercellulari sono canali che permettono l'intercomunicazione tra cellule vicine ^1. Questa comunicazione connette due o più celle confinanti, dove ognuno contribuisce con connessone o hemichannel per formare il canale intercellulare. In cellule di mammifero, la connessone è formata da sei connessine, monomeri con quattro domini transmembrana e un C e terminale N all'interno del citoplasma ^2. Giunzioni non solo permettono il flusso di ioni, secondi messaggeri e piccoli metaboliti, ma contribuiscono anche a molte forme di comunicazione cellulare in molti processi fisiologici, come la trasmissione sinaptica, contrazione cardiaca, la crescita e la differenziazione cellulare ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Inoltre giunzioni sono stati associati conmolte malattie tra cui il cancro ^{9, 10, 11} atrofia muscolare, alcune malattie genetiche e malattie demielinizzanti ^12.

Questo tipo di crosstalk intercellulare può essere valutata mediante diversi metodi ^{13, 14, 15, 16.} In questo lavoro, si mostra come eseguire una microiniezione cella singola di Lucifero giallo di visualizzare la comunicazione cellulare attraverso gap giunzioni nelle cellule viventi. Discutiamo come preparare le cellule e la micropipetta, l'uso del micromanipolatore e l'iniezione di Lucifero colorante giallo in una linea di cellule epiteliali del timo. Solitamente, questa procedura sperimentale potrebbe essere analizzato dalla media delle celle collegate alla cella caricato con colorante. Inoltre, questo metodo può essere usato con altri coloranti fluorescenti con peso molecolare inferiore del gapgiunzioni cut-off, che è di circa 1.000 dalton.

Protocol

1. Preparazione di cellule

1. Mantenere una cultura di una linea timica cellule epiteliali (IT76M1) o cellule da testare in un incubatore (37 ° C / 5% di CO _2).
2. Lavare le cellule con PBS 1x (ripetere questo punto 3x).
3. Aggiungere tripsina alle cellule per 5 min.
4. Aggiungere mezzo (il doppio del volume di tripsina aggiunto al punto 1.3) con 10% FBS (siero bovino fetale) alle cellule con tripsina e centrifugare (800 xg per 5 min).
5. Contare le cellule in un emocitometro.
6. Regolare la densità di cellule a seconda del tipo di cellule come le cellule devono essere in stretto contatto con l'altro per consentire l'accoppiamento. Nota: Nel nostro caso, abbiamo utilizzato 3 x 10 ⁵ cellule per 35 millimetri Petri.

2. Preparazione Micropipetta

1. Tirare la micropipetta come specificato da una micropipetta capillare di vetro (1,5 mm di diametro) per una finale di 0,2 micron di diametro in modo da raggiungere una resistenza finale di circa 30 MWf "> ^{17, 18.}
   NOTA: In alternativa, pipette di iniezione possono essere acquistati. La resistenza dipende dalla dimensione della cella, per esempio sarebbe necessario per cellule acinose pancreatiche un microelettrodo resistenza maggiore, per esempio (100-150 MW) ^19. Un problema comune che potrebbe verificarsi è la precipitazione della soluzione giallo Lucifero che può ostacolare la micropipetta e possono richiedere filtrazione o centrifugazione prima. Prima dell'iniezione, la micropipetta deve essere analizzato al microscopio per rilevare se vi è un'ostruzione o qualsiasi tipo di interruzione ^13. La micropipetta può essere testato iniettando LY con la punta micropipetta all'interno di una soluzione salina.

3. Test del Micropipetta

1. Preparare la soluzione giallo Lucifero (5%) in 150 mmol / L LiCI e caricare la micropipetta con una siringa o riempimento (messo in esso LY Solution).
2. Posizionare il micropipette over da 35 mm piastra di Petri con le cellule IT76M1 sulla workstation microiniezione e immergere la punta della micropipetta di vetro nel mezzo cellulare. Focus sul micropipetta ed eseguire un test di tinteggiatura che scorre mediante l'applicazione di un impulso.

4. Single-cell Lucifer Yellow microiniezione

1. Mettere a fuoco il microscopio proprio sopra lo strato di cellule con un alto fi cazione ingrandimento (40X), quindi abbassare lentamente la pipetta alle cellule utilizzando il micromanipolatore.
2. Perforare la cella di destinazione quando la punta è abbastanza vicino a toccare la membrana cellulare, e applicare un piccolo impulso iperpolarizzante di introdurre il LY nella cella. La tensione applicata dipende dalla carica netta di colorante da iniettare. In alternativa, alcuni altri coloranti possono essere usati con questa tecnica come mostrato nella Tabella 1.
   Nota: In linea di principio qualsiasi colorante idrofilo con MW meno di 1KDa potrebbe essere utilizzato. Tuttavia, la velocità di trasferimento può variare a seconda del peso e idrofilia. Inoltre, utrasferimento nspecific del colorante utilizzato deve essere valutata.
3. Catturare le immagini delle cellule 3 minuti dopo l'iniezione di tintura o di fare un piccolo film con lasso di tempo la microscopia (30 fps).
   NOTA: Un approccio simile potrebbe essere visto in Hitomi et al (2015) ^20. Per evitare comunicazione da ponti intercellulari (mitosi incompleta), un co-iniezione di rhodamin destrano (da 2 a 10 KDa), che non passa attraverso giunzioni gap ma passa attraverso ponti intercellulari e certi tipi di nanotubuli è raccomandato come mostrato in figura 2 .

Results

Timica linea di cellule epiteliali IT-76MI sono stati utilizzati per valutare l'accoppiamento colorante da giunzioni in quanto queste cellule sono state descritte per esprimere giunzioni funzionali formati da connessina 43 ^21. La Figura 1 mostra l'iniezione di Lucifer Yellow quando applicato in una cella sotto la punta della pipetta. Dopo alcuni minuti, celle collegate diventano fluorescenti (asterischi) indica la diffusione del colorante fluorescente attraverso l...

Discussion

Al fine di verificare la presenza di funzionali gap junction intercellulare, l'uso di rivelatori, che sono membrana impermeabile, anche se permeabile da canali intercellulari sono necessari ^16. Fluoresceina, il primo colorante fluorescente per osservare cellula-cellula di accoppiamento ^22, è permeabile tra membrane non giunzionali ³ ed è stato quindi sostituito da Lucifer colorante giallo ^15. Attualmente, per trovare la m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifero giallo	Sigma	L0259
Cloruro di litio	Sigma	L4408
PBS compresse	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Siero fetale bovino	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
tavolo isolato dalle vibrazioni	Newport	VH3036W-OPT	È necessario un tavolo isolato dalle vibrazioni per proteggere gli esperimenti dalle vibrazioni ed evitare danni alle cellule
Micromanipolatore	Narishige	MMO-203	Questa apparecchiatura consente regolazioni di precisione della micropipetta, necessaria per la microiniezione cellulare.
Generatore di corrente	Digitimer	DS2	Per produrre il flusso di colorante attraverso la micropipetta, è stata somministrata una corrente inferiore a un nano ampere utilizzando un generatore di corrente con un elettrodo all'interno della micropipetta o un amplificatore dotato di un circuito di compensazione della capacità (vecchio elettrometro) o funzioni di iniezione di corrente dei nuovi amplificatori patch clamp e il filo di terra immerso nel piatto della piastra. In alternativa, il colorante può essere iniettato da un microiniettore pneumatico, seguendo le raccomandazioni della fabbrica.