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Articolo metodologico

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

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DOI:

10.3791/50841

⸱

21 gennaio 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

In questo articolo

Sommario

Microiniezione è una tecnica comune per fornire strutture di DNA, mRNA, oligonucleotidi antisenso morfolino o altri trattamenti in uova, embrioni e cellule di varie specie.

Abstract

Microiniezione in cellule ed embrioni è una tecnica comune utilizzata per studiare una vasta gamma di processi biologici. In questo metodo una piccola quantità di soluzione di trattamento viene caricato in un ago microiniezione che viene utilizzato per iniettare fisicamente cellule immobilizzate singole o embrioni. Nonostante la necessità di formazione iniziale per eseguire questa procedura per la consegna ad alta produttività, microiniezione offre la massima efficienza e la consegna riproducibile di una vasta gamma di soluzioni di trattamento (comprese le miscele complesse di campioni) nelle cellule, uova o embrioni. Applicazioni alle microiniezioni includono la consegna dei costrutti di DNA, mRNA, proteine ​​ricombinanti, guadagno di funzione, e la perdita di reagenti funzione. Fluoroforo o colorimetrica viene aggiunto alla soluzione iniettata per consentire la visualizzazione immediata della consegna efficiente e un attrezzo per la normalizzazione affidabili della quantità della soluzione erogata. Il metodo descritto consente microiniezione di 100-400 ricci di mare zygotes entro 10-15 minuti.

Introduzione

Consegna trattamento efficace e riproducibile è una delle principali sfide metodologiche per i ricercatori. Diversi metodi sono stati stabiliti per fornire transitoriamente soluzioni di trattamento nelle uova, embrioni e cellule. Questi metodi includono elettroporazione (basato su una generano transitori pori nella membrana mediante piccoli impulsi elettrici) 1,2, lipofezione (consegna attraverso la fusione di liposomi contenenti trattamento con la membrana) 1, microparticelle bombardamento 1 (DNA viene precipitato sulla micron particelle di dimensioni metallo che vengono poi utilizzati per penetrare le celle ad alta velocità) e trasduzione (virus viene utilizzato come veicolo di consegna di transgeni). Al momento, la microiniezione è l'unico approccio che tiene il vantaggio di fornire qualsiasi soluzione con un'efficienza del 100% con reagenti minimi. Inoltre, una singola soluzione iniettabile può essere composta da una miscela complessa di trattamenti. Questa tecnica è stata utilizzata per successoly microinject le uova e gli embrioni da numerose specie come ricci di mare, pesce zebra 3,4 5, mouse 6, rana 7, 8 e bovini, nonché singole cellule in coltura tissutale 9. Blastomeri singole iniezioni a stadi di sviluppo successivi sono stati condotti anche 10-12.

Gli attuali metodi di microiniezioni sono basati sul metodo della pressione di iniezione che è stato inizialmente descritto da Hiramoto 10, tuttavia, sono stati fatti grandi progressi verso l'ottimizzazione di questo processo. Eccellente tecniche di microiniezione sono state descritte altrove 11, e qui descrivere uno dei metodi specifici attualmente utilizzati per microinject riccio di mare (Strongylocentrotus purpuratus) le uova appena fecondate. Per oltre un secolo, ricci di mare sono stati un valido modello sperimentale 15,16. I ricci di mare sono evolutivamente strettamente legati alla cordati (compresi noi) e l'analisi diloro genoma ha rivelato che contengono tutte le principali famiglie di geni come l'umano 17. Essi producono un gran numero di sincrono sviluppare embrioni trasparenti che possono essere facilmente manipolati. Utilizzo di riccio di mare come organismo modello, la comunità riccio di mare ha contribuito alla nostra comprensione del processo di fecondazione 18-21, cellulari processi biologici 22-24, e le reti di regolazione genica (GRN) 25-28.

Microiniezione in zigoti riccio di mare richiede diversi passaggi. In primo luogo, le uova devono essere immobilizzato prima iniezioni (descritto di seguito). Piatti microiniezione sono rivestiti con protamina solfato (PS), che crea una superficie caricata positivamente a cui le uova carica negativa possono aderire 3. Le uova sono dejellied mediante incubazione in acqua di mare acida (pH 5,15) per 10 minuti, seguito da due lavaggi in acqua di mare naturale o acqua di mare artificiale (pH 8,0). Le uova dejellied sono accuratamente remato in linea rettanel mezzo del piatto PS rivestite in presenza di 1 mM 3-aminotriazole (3-AT), necessaria per inibire l'attività di ovoperoxidase che viene secreto dai granuli corticali dell'uovo a seguito di fecondazione 29. Questa fase è importante per prevenire l'indurimento della busta fecondazione e l'inserimento dell'ago microiniezione. In alternativa a 1 mM 3-AT, 10 mM acido paraminobenzoic (PABA) può essere utilizzato. La soluzione iniettabile viene caricato in un ago microiniezione punta utilizzando microloading pipetta specializzata e montato su un supporto attaccato al micromanipolatore e gruppo pressore (Figura 1). Ogni ago può essere utilizzato per microinject singoli zigoti in esperimenti multipli in giorni diversi. Microiniezione può essere eseguita per 10-15 minuti fino zigoti indurire. Gli zigoti vengono quindi lavati con acqua di mare e coltivate a 15 ° C. Quando gli embrioni raggiungono cova blastula fase, rilasciano cova enzima che digerisce i componenti del fertilization busta 30 e permettere loro di staccarsi naturalmente dal piatto di PS-rivestito. Se necessario, gli embrioni possono essere staccate delicatamente dal piatto con una pipetta bocca o pipetta Pasteur soffiando delicatamente l'acqua di mare sulle embrioni. Il metodo descritto consente microiniezione efficiente ed affidabile di 100-400 uova fecondate giudicato su un singolo piatto, fornendo un metodo ad alta produttività per analisi a valle.

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Protocollo

1. Preparazione del solfato di protamina (PS) Piatti patinata

  1. Preparare la soluzione 1% di solfato di protamina (PS) aggiungendo 0,5 g di PS a 50 ml di acqua deionizzata, acqua distillata (DDH 2 O) in una provetta conica da 50 ml. Agitare bene ad alta velocità su un agitatore panchina a temperatura ambiente per 1-2 ore per garantire la completa dissoluzione del PS. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per almeno 3 mesi (assicurarsi per dissolvere completamente simile a gel precipitato prima di ogni utilizzo) 3.
  2. Prendete un manicotto 60 mm x 15 mm di polistirene Petri e lay out sia coperchi e fondi in panchina.
  3. Versare la soluzione PS 1% in ogni piatto (entrambi i fondi e coperchi possono essere utilizzati) appena sufficiente a coprire la superficie, lasciare agire per almeno 2 min. La soluzione PS rimanente può essere riutilizzato più volte entro 3 mesi se conservato a 4 ° C.
  4. Inserire piatti PS-trattati in un becher riempito con acqua distillata (dH 2 O). Lasciare il bicchiere sotto il getto dH 2 O per almeno10 min.
  5. Piatti PS-rivestiti possono essere utilizzati immediatamente o aria secca per l'archiviazione. Coprire loro per evitare l'accumulo di polvere. Essi possono essere conservati a temperatura ambiente per 1 mese 3.

2. Ottenere Sea Urchin Gameti e immobilizzare le uova in un piatto di PS rivestita per microiniezione

  1. Spawn ricci di mare di agitazione o iniezione intracoelomic fino a 1 ml di 0,5% KCl per indurre la contrazione della muscolatura liscia a rilasciare gameti 3 (Figura 2).
  2. Se l'animale è un maschio, come indicato dagli spermatozoi colore bianco, raccogliere sperma secco dalla superficie di un animale in una provetta da 1,5 ml. Sperma secco può essere conservato a 4 ° C per una settimana senza significativa perdita di funzione biologica.
  3. Se l'animale è una femmina, come indicato dal colore giallo dovuto al contenuto di tuorlo d'uovo, raccogliere i suoi gameti immergendo i gonopores in un bicchiere pieno di acqua di mare. Le uova verranno rilasciati da gonopores e stabilirsi per gravità.
  4. Filtrare le uova da detriti come spine animali, utilizzando 80 micron nylon filtro a rete. I migliori risultati si ottengono se le uova sono utilizzati entro 5-7 ore dopo la deposizione delle uova.
  5. Dejelly le uova:
    1. Preparare 100 ml di acqua di mare acida per circa 1 ml di uovo. Utilizzare acido citrico 0.5 M per aggiustare il pH dell'acqua di mare da pH 8,0 a 5,1-5,2. Troppo basso di un pH diminuirà la fecondazione e troppo alto di un pH non permetterà uova di allegare alle piastre rivestite PS.
    2. Aggiungere le uova (non più di 1 ml) di acqua di mare acida e lasciare le uova di stabilirsi in ghiaccio per 10 min. In alternativa, la rimozione del mantello gelatina può essere facilitato da una leggera roteazione delle uova durante il trattamento. Si può efficacemente dejelly S. uova purpuratus in 3-4 min questo modo.
    3. Versare con cautela l'acqua di mare acida, aggiungere acqua fresca del mare e lasciare che le uova stabilirsi sul ghiaccio di nuovo. Uova Dejellied possono essere memorizzati su ghiaccio per un massimo di 6 ore, senza problemi di fecondazione

3. Fila Uova

  1. Preparare 1 M soluzione stock di 3-aminotriazole (3-AT, PM = 84.08) sciogliendo 0,84 g di 3-AT in 10 ml di DDH 2 O. Questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per 6 mesi.
  2. Preparare la soluzione di lavoro 1 mM di 3-AT con l'aggiunta di 50 ml di 1 M soluzione madre a 50 ml di acqua di mare prechilled. Mantenere la soluzione su ghiaccio.
  3. Preparare bocca pipetta (Figura 3) per trattamento delicato delle uova:
    1. Punta della pipetta è tirato manualmente da micropipette di vetro (100 x OD 1,09 millimetri). Tenere la micropipetta con entrambe le mani sulla fiamma aperta. Come il vetro comincia a sciogliersi, estrarre delicatamente le estremità della pipetta in direzioni opposte.
    2. Collegare un tirato pipetta ad un tubo di plastica (ID 1,14 millimetri), sigillare stretto con Parafilm. La lunghezza del tubo deve essere di circa 50-70 cm.
    3. Inserire la punta P20 o P200 filtrata sterile alla fine del tubo opposta al tubo di vetroessere utilizzato come il boccaglio.
    4. Agganciare l'estremità della micropipetta di vetro con le forbici per regolare il diametro della punta. Il diametro ottimale supera leggermente il diametro delle uova (80 pm).
  4. Versare 4 ml di 1 mm di acqua di mare 3-AT in ogni piatto PS-rivestito (fondo o coperchio).
  5. Prendete la pipetta bocca, mettere la punta P20/P200 in bocca e fissarlo con i denti. Per aspirare uova, prima aspirare una piccola quantità di acqua di mare. Avendo una colonna di liquido prima di caricare le uova, si avrà il massimo controllo sulla tecnica di pipettaggio bocca.
  6. Posizionare la punta micropipetta vicino alle uova e aspirare delicatamente in diverse centinaia di uova nella pipetta. Confinare le uova all'interno della micropipetta di vetro.
  7. Row dejellied uova in una linea retta su un piatto da loro soffiando delicatamente della pipetta bocca mentre si muove la punta in linea retta. Row le uova destra prima le iniezioni, perché i problemi di fecondazione possono verificarsi a causa di prolonged esposizione a 3-AT acqua di mare 3. Inoltre, adesivi cationici come il PS può essere tossico per le uova, e non è consigliabile esporre embrioni a questi reagenti per lunghi periodi, soprattutto se sono state rimosse le buste di fertilizzante.
  8. Fare un graffio sul piatto vicino alla linea di uova filari utilizzando una pipetta di vetro. Questo scratch sarà importante per rompere l'ago di iniezione per regolare il flusso della soluzione secondo necessità. In alternativa, il graffio può essere fatta prima di versare acqua di mare a 3-AT al piatto.

4. Microiniezione dei ricci di mare zigoti

  1. Accendere la stazione microiniezione. Qui si descrive l'uso del sistema di iniezione FemtoJet.
  2. Tirare capillari iniezione con un estrattore ago. Un esempio di un buon ago è mostrata in Figura 4. Nota: Per le iniezioni RNA, capillari iniezione devono essere pretrattati per evitare la contaminazione RNasi 31:
    1. Mettere capillari di iniezione in 50 ml conicatubi e aggiungere 50 ml di filtrato metanolo / HCl (9,1). Agitare bene e lasciare per una notte per non più di 10 ore.
    2. Eliminare il metanolo / HCl e lavare i capillari 2x con metanolo filtrato nella stessa provetta.
    3. Pozzi metanolo per quanto possibile e liofilizzare i capillari durante la notte per assicurare la rimozione completa del metanolo.
  3. Montare con cautela il capillare ago su un supporto dell'ago di carico e caricarlo con <0,5 ml di una soluzione campione utilizzando punte microloader. Soluzioni campione solito contengono glicerolo al 20%, a seconda del materiale iniettato 3.
  4. Posizionare il piatto con le uova filari sul palco microscopio (uova dovrebbero essere allineati verticalmente quando viene visto attraverso gli oculari) e concentrarsi sulle uova.
  5. Montare con attenzione l'ago caricato sul supporto dell'ago microinjecting e regolare la posizione dell'ago di avere una punta perfettamente a fuoco al centro del campo.
  6. Premere il pulsante per applicare la pressione massima for pulizia ago. Soluzione dovrebbe uscire l'ago. Regolare la pressione se necessario: pressione di iniezione deve essere nell'intervallo di 90-360 hPa, con la pressione di compensazione a circa 1/3 della pressione di iniezione.
  7. Regolare il flusso della soluzione iniettando in ovulo non fecondato. Utilizzando un micromanipolatore joystick, dirigere la punta dell'ago per iniezione non fecondato. Per agevolare l'ingresso dell'ago, creare un leggero tremore picchiettando leggermente il palco con un oggetto duro, come un cacciavite. Un bolo iniezione formando all'interno dell'uovo va visto (Figura 5).
  8. Se il bolo iniezione non è visibile, sollevare leggermente la punta dell'ago sopra le uova, individuare il graffio sul piatto e regolarlo essere posizionato al centro del campo. Battere delicatamente la punta dell'ago al segno zero per rompere la punta di un ago per l'iniezione. Regolare le pressioni di iniezione e di compensazione per assicurare che il bolo iniezione non superi 1/5 del tegli diametro dell'uovo (1-2 pm).
  9. Una volta che il bolo di iniezione è stato calibrato, fecondare le uova con l'aggiunta di sperma diluito (1:1000) o 1-2 ml di sperma. Mescolare bene con cura per evitare di staccare la fila di uova.
  10. Inizia iniezioni subito dopo che la busta fecondazione diventa visibile (Figura 5). Sposta lungo la linea di uova filari utilizzando il controller stadio e iniettare quante zigoti possibile da essi colpendo con l'ago controllata da joystick micromanipolatore.
  11. Dopo 10-15 minuti, le uova fecondate giudicato risulteranno indurito e non possono essere iniettati più. Togliere il piatto dal palco e con attenzione aspirare fuori sperma in acqua di mare 3-AT utilizzando una pipetta Pasteur di plastica.
  12. Non lasciate che gli zigoti asciugare. Aggiungere rapidamente acqua dolce prechilled di mare per coprire il piatto. Incubare gli embrioni a 15 ° C.

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Risultati

GFP e mCherry costrutti reporter erano trascritto in vitro e microiniezione nelle uova appena fecondate. Gli embrioni sono state incubate a 15 ° C per 24 ore (fino allo stadio di blastula) e ripreso con microscopio Zeiss Observer Z1. Iniezione di costrutti reporter non ha dato luogo a difetti di sviluppo (Figura 6). Per la quantificazione dei segnali fluorescenti, acquisizione di immagini è stata eseguita a basso ingrandimento (100X) per catturare massimo pixel fluorescenti (Figure 6D-F...

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Discussione

Microiniezione è una tecnica potente per somministrare vari trattamenti quali DNA, mRNA, proteine ​​ricombinanti, perdita di funzione e guadagno di funzione reagenti, coloranti e loro combinazioni in uova, embrioni e cellule di diversi organismi 1-7. Tuttavia, alcune considerazioni devono essere tenuti a mente quando si progetta un esperimento microiniezione.

E 'estremamente importante considerare la solubilità del trattamento consegnato e il volume di iniezione. Se la soluzio...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo Santiago Suarez per la lettura critica del manoscritto e Betty Cowgill per gli aiuti in fotografia. Ringraziamo anche i revisori anonimi per il loro feedback critico. Questo lavoro è supportato dalla University of Delaware Fondo di ricerca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipette in vetro Pasteur VWR14673-043 
Microscopio invertito  Axiovert 40 ° CZeiss4109431007990000Microscopio per iniezione
Punte per microloaderEppendorf5242 956.003Soluzione per iniezione di carico
Nylon filtro a rete 80  μ mAmazon.com03-80-37Filtrare le uova per eliminare i detriti
P20 o P200 Barriera aerosol Puntali per pipetteFisher Scientific02707432 o 02707430Parte di una pipetta orale
ParafilmFisher Scientific13 374 12Parte di una pipetta orale
Tubo in polietileneIntramedicPE-160Parte di una pipetta orale
Solfato di protaminaMP Biomedicals, LLC194729Attacca le uova dejellied alle piastre per iniezione
Ricci di mare S. purpuratusPt. Loma Marine Invertebrate LabN/A 
Acqua di marequalsiasi negozio di animaliInstant Ocean 
Sterile 60 mm x 15 mm Piastra di Petri in polistireneFisher Scientific0875713APiastre per iniezione
Micromanipolatore a posizionamento grossolano a tre assi MMN-1Narishige9124Manipolare l'ago di iniezione
A tre assi Joystick a olio idraulico Micromanipolatore fine MMO-202NDNarishige9212Manipolare l'ago di iniezione
Pipette di trasferimentoFisher Scientific13-711-9
Estrattore verticale dell'ago NarishigePC-10Aghi per iniezione a trazione

Riferimenti

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