Questo studio ha utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, aumentando notevolmente la velocità di rotolamento studi cella in flusso di taglio fisiologicamente rilevanti. Data l'importanza della laminazione di cellule nella cella multi-step homing a cascata e l'importanza di homing delle cellule dopo la consegna sistematica delle popolazioni esogeni di cellule nei pazienti, questo sistema offre un potenziale come piattaforma di screening per migliorare la terapia cellulare.
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Articolo metodologico
Analisi sistematica delle In Vitro Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic
In questo articolo
Sommario
Abstract
Una sfida importante per terapia cellulare è l'incapacità di indirizzare sistemicamente una grande quantità di cellule vitali con alta efficienza per tessuti di interesse dopo infusione endovenosa o intraarteriosa. Di conseguenza, l'aumento homing delle cellule è attualmente studiata come una strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella rotolamento sull'endotelio vascolare è un passo importante nel processo di homing delle cellule e può essere sondato in vitro utilizzando una camera di flusso a piatti paralleli (PPFC). Tuttavia, questo è estremamente noioso, basso dosaggio produttività, con condizioni di flusso scarsamente controllato. Invece, abbiamo utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto che consente lo studio delle proprietà di rotolamento cellulare in un throughput più elevato sotto controllato con precisione, fisiologicamente rilevante flusso di taglio 1,2. In questo articolo, vi mostriamo come le proprietà di rotolamento di HL-60 (leucemia promielocitica umana), le cellule su superfici E-selectina-rivestite-P e così come su superfici monostrato rivestite cellulari possono essere readily esaminato. Per meglio simulare condizioni infiammatorie, la superficie canale microfluidico è stata rivestita con le cellule endoteliali (EC), che sono stati poi attivati con Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), aumentando notevolmente le interazioni con cellule HL-60 in condizioni dinamiche. La velocità aumentata e piattaforma integrata di analisi software multi-parametro, che permette una rapida analisi di parametri quali la velocità di rotolamento e il percorso di rotolamento, sono vantaggi importanti per la valutazione delle cellule laminazione di proprietà in-vitro. Consentire l'analisi rapida e accurata di approcci di ingegneria progettato per avere un impatto rotolamento delle cellule e homing, questa piattaforma può aiutare terapia anticipo cell-based esogeno.
Introduzione
Una delle sfide principali nella traduzione clinica di successo della terapia a base di cellule è la consegna inefficiente o il targeting di cellule sistemica infuse ai siti desiderati 3,4. Di conseguenza, vi è una costante ricerca di metodi per migliorare homing delle cellule, e specificamente cellula rotolamento, come strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella a rotazione sui vasi sanguigni è un passo fondamentale nella cascata di homing delle cellule, definito classicamente per i leucociti che vengono reclutati per siti di malattia 5. Questa fase è regolata da interazioni specifiche tra selectine endoteliali, cioè-P ed E-selectina (-P e E-sel), e loro ligandi contatore sulla superficie dei leucociti 5,6. Una migliore comprensione e una migliore efficienza di homing delle cellule, e in particolare la fase di laminazione, sono di grande importanza nella ricerca di nuove piattaforme per migliorare la terapia cellulare. Fino ad oggi questo è stato ottenuto utilizzando camere di flusso piastra parallele (PPFCs), comprendente due plat piattoes con una guarnizione tra loro, con una apertura di afflusso e deflusso trova alla piastra superiore, attraverso la quale una sospensione cellulare è perfuso utilizzando una siringa pompa 7,8, 9. La superficie della piastra inferiore può essere rivestito con un monostrato di cellule competenti / substrati e l'interazione tra cellule perfusi e la superficie sotto flusso di taglio è poi esplorato 7. Tuttavia, PPFC è un volume basso, reattivo-consumo, e metodo abbastanza noioso, con formazione di bolle, perdite, e il flusso scarsamente controllato presenta gravi inconvenienti.
Una tecnica alternativa alla PPFC tradizionale è un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, permettendo prestazioni più elevate velocità di analisi cellulari (fino a 10 volte superiore rispetto PPFCs) sotto flusso preciso e taglio controllato da computer, con basso consumo di reagente 1,10. Esperimenti di laminazione delle cellule vengono eseguiti all'interno dei canali microfluidica, che può essere rivestito con monostrati cellulari o substrati ingegnerizzati e USI ripresong un microscopio, con proprietà di rotolamento prontamente analizzati utilizzando un software adatto. In questo studio, abbiamo dimostrato le capacità di questo multi-well sistema di microfluidica piastra di studiare le proprietà di rotolamento di leucemia promielocitica umana (HL-60) le cellule su superfici diverse. HL-60 rotola su supporti come-P ed E-sel, nonché su monostrati di cellule che esprimono diversi recettori di rotolamento, è stato analizzato. Inoltre, l'anticorpo (Ab) di blocco è stato utilizzato per dimostrare coinvolgimento diretto di selectine specifici nel mediare il movimento di rotolamento di HL-60 su tali superfici. Esperimenti di rotolamento sono stati effettuati con maggiore velocità, sotto flusso di taglio stabile, con il minimo consumo di reagente / cellulare, che permette l'analisi efficiente dei parametri di laminazione chiave come velocità di rotazione, il numero di cellule di rotolamento, e rotolamento proprietà del percorso.
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Protocollo
1. Cell Culture
- Leucemia promielocitica umana (HL-60) le cellule
- Culture cellule HL-60 nel 75 cm 2 palloni con 15 ml di Iscove Modified Medium (IMDM) di Dulbecco, supplementato con 20% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), 1% (v / v) L-glutammina e 1 % (v / v) Penicillina-Streptomicina.
- Cambiare supporto ogni 3 giorni aspirando metà del volume di sospensione cellulare e sostituendolo con mezzi IMDM completo.
- Per carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl (CFSE) colorazione, centrifuga HL-60 sospensione cellulare (400 xg, 5 min), risospendere in una soluzione 1 mM CFSE (preparato in PBS preriscaldata) e incubare per 15 min a 37 ° C. Poi centrifugare le cellule, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un mezzo fresco preriscaldato per 30 min. Lavare le cellule in PBS e poi utilizzare per esperimenti di laminazione (vedere Figura 1B per un'immagine rappresentativa della CFSE colorati con cellule HL-60 su P-sel-superficie rivestita).
Nota: CFSE colorazione è facoltativo, ed è presentato qui per dimostrare il fenomeno di laminazione nel canale microfluidica. Analisi dei parametri di laminazione presentati in questo manoscritto è stato eseguito su cellule non colorate utilizzando l'imaging campo chiaro standard.
- Cellule endoteliali microvascolari polmonari (LMVECs)
- Coat 100 millimetri piastre di Petri con soluzione di gelatina 0,1% (v / v in PBS) e incubare a 37 ° C per almeno 30 min.
- LMVECs Cultura in gelatina rivestite 100 millimetri piastre di Petri in mezzo completo di crescita endoteliale (endothelial basale medio-2 (EBM-2)), integrato con uno specifico kit di supplemento di crescita, vedi REAGENTI). Cambiare i media ogni altro giorno e cellule sub-cultura al raggiungimento di 80-90% di confluenza.
- Per sub-coltura, lavare le cellule con PBS e poi staccare cellule con 4 ml di 1x Tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C e neutralizzare in un volume uguale di completi EBM-2 media. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifuge (400 xg, 5 min). Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di mezzi completi endoteliali e contare le cellule con un emocitometro. Non oltre-passare le cellule, in quanto questo incide sulla loro morfologia e funzione utilizzare solo cellule sotto il passaggio 7 per tutti gli esperimenti.
- Ovaio di criceto cinese-P-selectina (CHO-P) Cells
- Cellule CHO-P, che sono cellule CHO trasfettate stabilmente per esprimere umana P-sel, sono stati forniti dai collaboratori (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) 11,12.
- Cellule Cultura CHO-P nel T175 cm 2 boccette in 25 ml di F-12 media.
- Per passaging, lavare le cellule con 10 ml di PBS per 4-5 secondi e poi trypsinize in 10 ml di 1x Tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C, seguito da neutralizzazione in mezzi completi.
- Centrifugare la sospensione cellulare (400 xg, 5 min), aspirare accuratamente il surnatante, risospendere il pellet di cellule in 1 ml di mezzi completi e contare le cellule conun emocitometro.
2. Il funzionamento del Integrated Multi-pozzetti sistema Microfluidic
- Assicurarsi che tutta l'attrezzatura sia collegato correttamente e accendere i diversi moduli: il calcolatore, controllore, microscopio invertito, e fotocamera CCD.
- Aprire il software di imaging, assicurarsi che il modulo piastra multi-bene e il modulo di imaging siano correttamente presentate sullo schermo.
- Collegare i tubi alla trappola del vapore (collegato al controller), e anche li collegano all'interfaccia pressione.
- Posizionare la piastra multi-pozzetto nella piastra di riscaldamento / adattatore. Aggiungere nei pozzetti (descritti sotto) e attaccare un interfaccia sulla parte superiore della piastra. Posizionare la piastra per l'imaging sul palco automatizzato.
- L'interfaccia attribuisce alla parte superiore della piastra e applica una pressione pneumatica dal controller all'inizio dei pozzi, guidando il fluido attraverso i canali microfluidica alla portata definita, facilmente controllato utilizzando la piastra multi-pozzettoschermo di modulo in modalità manuale.
- Reagenti nel flusso canale attraverso un'area di osservazione, situato tra i pozzetti. Dimensioni del canale microfluidica sono 350 micron di larghezza x 70 micron di altezza. La lunghezza del canale lineare è 1 mm e il fondo dei canali comprende un coprioggetti da 180 micron, che è compatibile con campo chiaro, fase, fluorescenza e microscopia confocale.
- Acquisire video utilizzando una camera CCD (acquisizione flusso, 11 fotogrammi / sec) e analizzare tramite software compatibile.
3. Rivestimento di canali microfluidica con un substrato di proteine o di un monostrato di cellule
- Rivestimento canale microfluidica con fibronectina o P-/E-selectin
- Preparare 1 ml di 20 mg / ml soluzione fibronectina in PBS. Modificare il volume in base al numero di canali da verniciare (utilizzare 25-50 ml di fibronectina per canale).
- Aggiungere 25-50 ml di soluzione di fibronectina ad ogni ingresso bene. Applicare forza di taglio di 2 dine / cm 2per 5 min a perfusione canale. Si prega di notare il tallone di liquido che compare nella presa bene. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente
- Aspirare la soluzione da pozzi (non aspirare direttamente dal cerchio centrale che alimenta il canale) 1,13. Aggiungere 200-500 ml di PBS in presa e lavare canale con PBS applicando flusso di taglio di 2 dyn / cm 2 per 5 min. Il canale è ora correttamente rivestito con fibronectina e pronto per essere utilizzato.
- Per ricoprire con P-o E-SEL, preparare una soluzione 5 mg / ml di proteina ricombinante umana desiderata in PBS, e rivestire i canali come descritto sopra, con 1 ora di incubazione a 37 ° C per un rivestimento superficiale.
- Creazione di CHO-P o LMVEC monostrato all'interno del canale microfluidica
- Trypsinize delicatamente le cellule dai piatti di coltura per 3 minuti, spegnere utilizzando un volume di 2 volte di supporti pieni e centrifugare (5 min a 400 xg). Risospendere le cellule con 10 ml di supporti pieni e centrifugare (5 min a 400 xg) again.
- Contare le cellule per determinare la concentrazione delle cellule in sospensione. Per garantire la formazione di un monostrato confluente LMVEC all'interno del canale, portare la concentrazione cellulare a 15-20 milioni di cellule / ml. Per un confluente CHO-P monostrato cellulare, utilizzare 50-60 milioni di cellule / ml. Utilizzare 25-50 ml di sospensione cellulare per ogni canale - determinare il numero di cellule iniziale usato per l'esperimento di conseguenza.
- Aggiungere 25-50 ml di sospensione cellulare in concentrazione adeguata al bocchettone. Posizionare la piastra sul palco microscopio e introdurre cellule nel canale (2 dyn / cm 2) finché le cellule si osservano sullo schermo riempiendo tutto canali, e quindi arrestare il flusso.
- Riempire sia uscita e ingresso con 200 ml di LMVEC sia pieno o CHO media. Lasciate che le cellule si depositano ed aderiscono per 3 ore in incubatore (37 ° C, 5% CO 2).
- Seguendo la incubazione 3 hr, lavare il canale con piena supporti (2 dyn / cm 2, 10-15 min) per rimuovere distaccaticellule. Le cellule dovrebbero ora appaiono completamente confluenti e il canale è ora pronto per l'uso. A seconda iniziale densità di semina cellulare, ulteriori 2-3 ore di tempo di assestamento può essere necessaria per assicurare una copertura completa della superficie con le cellule.
4. LMVEC attivazione pro-infiammatoria e anticorpo Blocco di P-/E-selectin
- Preparare una soluzione di TNF-α (10 ng / ml) in LMVEC mezzi basale.
- Per indurre l'attivazione infiammatoria LMVEC nei canali, aggiungere 100 microlitri della soluzione di TNF-α al bocchettone e introdurre la soluzione nel canale applicando flusso di taglio di 2 dyn / cm 2 per 5 min. Per i canali di controllo (non attivato EC), aggiungere 100 ml di LMVEC supporti basale a bocchettone e introdurre nel canale (2 dyn / cm 2 per 5 min). Canale è ora pronto per un saggio di rotolamento.
- Per bloccare P-sel e E-sel su LMVECs e cellule CHO-P, introdurre neutralizzando P-sel (clone AK4, 5 mg / ml in basal media) o E-sel (P2H3 clone, 5 ug / ml in mezzi basale) anticorpi nel canale e incubare per 1 ora a 37 ° C. Successivamente, lavare canali con i media basale (2 dyn / cm 2 per 5 min). I canali sono ora pronti per un saggio di rotolamento.
5. HL-60 di Rolling saggio sul substrato / Cellulari monostrato-Coated canali microfluidica
- Esaminare attentamente i canali al microscopio per confermare che i canali siano rivestite (nel caso del rivestimento con cellule, un monostrato di cellule confluenti completamente deve osservare).
- Per preparare HL-60 sospensione cellulare per gli esperimenti di rotolamento, centrifuga HL-60 sospensione cellulare (5 min a 400 xg) e lavare una volta con terreni di base. Contare le cellule e risospendere in IMDM (supporti basali, contenenti Ca 2 + e Mg 2 +) per creare una sospensione di cellule HL-60 con 5 milioni di cellule / ml. Utilizzare 25-50 ml di sospensione cellulare per ogni canale per eseguire il test di rotolamento.
- Aggiungere 25-50 ml di Sosp cellularension alla presa bene, piastra posto all'interno del portatarga a temperatura controllata (37 ° C) e posto sul palco microscopio. Quindi, introdurre cellule nel canale applicando forza di taglio di 2 dine / cm 2 (celle devono essere osservate entro 10-15 secondi che scorre dalla presa di ingresso).
- Per esaminare la risposta rotolamento in funzione della sollecitazione di taglio, ridurre taglio a 0,25 dyn / cm 2 e acquisire video 20-30 sec (tramite la funzione "acquisizione stream") in ogni taglio desiderata (shear aumentare gradualmente da 0,25 fino a 5 dyn / cm 2. E 'anche possibile utilizzare cesoie superiori).
- Acquisire video utilizzando una camera CCD (acquisizione flusso, 11 fotogrammi / sec) e analizzare i percorsi di laminazione e di laminazione velocità via software compatibile.
6. Citometria a flusso per rilevare l'espressione di molecole di superficie
- Dopo tripsinizzazione, preparare una sospensione cellulare (con 1-2 x 10 5 cellule / campione) di tipo cellulare desiderato (HL-60, CHO-P o LMVECs) in PBS (- / -), supplementato con 2% FBS. Lavare le cellule due volte e portare il volume del campione a 50 microlitri (usando lo stesso tampone).
- Incubare ogni campione con il fluoroforo coniugato desiderato Ab (vedi tabella allegata per informazioni dettagliate) a 4 ° C per 20 min (coprire con un foglio di alluminio).
- Lavare le cellule due volte (stesso tampone) e portare il volume finale della sospensione cellulare tinto a 200 microlitri. Analizzare campioni usando un citometro a flusso per rilevare l'espressione di molecole di superficie.
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Risultati
Cellule HL-60 rotolano sulle superfici-P ed E-selectina, ma non su fibronectina
Cellule HL-60 sono considerati "rulli" gold standard quanto esprimono una varietà di ligandi homing, compresi i leganti rotolamento P-sel-1 glicoproteina ligando (PSGL-1) e Sialyl-Lewis X (sLex) 5,14 (Figura 1A ). La proteina di superficie PSGL-1 agisce come impalcatura per il SLeX tetra-saccaridi, che mediano l'interazione specifica con P ed E-sel, che sono up-regolati sull'endotelio dur...
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Discussione
Una delle sfide principali nella traduzione di successo della terapia a base di cellule esogena è l'incapacità di fornire in modo efficiente le celle a siti di lesioni e infiammazioni con alta efficienza attecchimento 3. Laminazione cella rappresenta un passo fondamentale nel processo di homing delle cellule, facilitando la decelerazione di cellule sulle pareti dei vasi sanguigni, portando infine alla loro ferma adesione e trasmigrazione attraverso l'endotelio nel tessuto 5. Una migliore co...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Cellule CHO-P sono stati un gentile dono del Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health di sovvenzione HL095722 a JMK Questo lavoro è stato supportato anche in parte da un Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award per JMK
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Materiali
AnticorpiAltri reagenti
td colspan="4">td colspan="4"> Kit di proliferazione cellulare CFSE per tracce cellulari
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule endoteliali microvascolari polmonari umane | Lonza | CC-2527 | |
| Cellule ovariche di criceto cinese che esprimono P-selectina (CHO-P) | Gentile dono della dottoressa Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cellule | ATCC | CCL-240 | |
| Reagenti per colture cellulari | |||
| Endoteliale Lonza media basale | CC-3156 | ||
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endoteliale Integratore Basale Medium Lonza | CC-4147 | ||
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Miscela di nutrienti (prosciutto) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillina Streptomicina (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutammina (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Piastre di Petri BD | Falcon | BD-353003 | |
| Piastra per colture cellulari da 100 mm, polistirene | |||
| trattato con coltura tissutaleProvette da centrifuga (provette coniche in polipropilene da 15 ml) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flaconi | BD Falcon | 353136 | |
| Soluzione di gelatina (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio) | Sigma | D8537 | |
| Soluzione di tripsina-EDTA (10x) | Sigma | T4174< | |
| Anti-hE-Selectina/CD62E | R& D Systems | BBA21 | |
| FITC IgG di topo coniugato 1 | R& D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R& D Systems | BBA34 | |
| FITC IgG di topo coniugato 1 | R& D Systems | BBA34 | |
| FITC Topo IgG 1 κ Controllo dell'isotipo | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC coniugato | Santa Cruz | SC70545 | |
| normale controllo dell'isotipo IgM-FITC di topo | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE anti-umano CD162, clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE IgG di topo1 k Controllo isotipo | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| IgG di topo1 Controllo isotipo | Santa Cruz | SC3877< | |
| ricombinanti TNF-alfa | PeproTech | 300-01A | |
| - per citometria a flusso | Invitrogen | C34554 | |
| Proteina ricombinante umana P-selectina-FC | R& D Systems | 137-PS-050 | |
| Proteina ricombinante E-selectina-FC umana | R& D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectina Umana, | Plasma Invitrogen | 33016-015 | |
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage era il software utilizzato per eseguire gli esperimenti e analizzare i dati | |
| BioFlux Piastre a 48 pozzetti | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Citometro | BD Bioscience | CFlow Plus è stato il software utilizzato per eseguire gli esperimenti e analizzare i dati | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
