Method Article

Analisi sistematica delle In Vitro Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

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Questo studio ha utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, aumentando notevolmente la velocità di rotolamento studi cella in flusso di taglio fisiologicamente rilevanti. Data l'importanza della laminazione di cellule nella cella multi-step homing a cascata e l'importanza di homing delle cellule dopo la consegna sistematica delle popolazioni esogeni di cellule nei pazienti, questo sistema offre un potenziale come piattaforma di screening per migliorare la terapia cellulare.

Abstract

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Una sfida importante per terapia cellulare è l'incapacità di indirizzare sistemicamente una grande quantità di cellule vitali con alta efficienza per tessuti di interesse dopo infusione endovenosa o intraarteriosa. Di conseguenza, l'aumento homing delle cellule è attualmente studiata come una strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella rotolamento sull'endotelio vascolare è un passo importante nel processo di homing delle cellule e può essere sondato in vitro utilizzando una camera di flusso a piatti paralleli (PPFC). Tuttavia, questo è estremamente noioso, basso dosaggio produttività, con condizioni di flusso scarsamente controllato. Invece, abbiamo utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto che consente lo studio delle proprietà di rotolamento cellulare in un throughput più elevato sotto controllato con precisione, fisiologicamente rilevante flusso di taglio 1,2. In questo articolo, vi mostriamo come le proprietà di rotolamento di HL-60 (leucemia promielocitica umana), le cellule su superfici E-selectina-rivestite-P e così come su superfici monostrato rivestite cellulari possono essere readily esaminato. Per meglio simulare condizioni infiammatorie, la superficie canale microfluidico è stata rivestita con le cellule endoteliali (EC), che sono stati poi attivati ​​con Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), aumentando notevolmente le interazioni con cellule HL-60 in condizioni dinamiche. La velocità aumentata e piattaforma integrata di analisi software multi-parametro, che permette una rapida analisi di parametri quali la velocità di rotolamento e il percorso di rotolamento, sono vantaggi importanti per la valutazione delle cellule laminazione di proprietà in-vitro. Consentire l'analisi rapida e accurata di approcci di ingegneria progettato per avere un impatto rotolamento delle cellule e homing, questa piattaforma può aiutare terapia anticipo cell-based esogeno.

Introduction

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Una delle sfide principali nella traduzione clinica di successo della terapia a base di cellule è la consegna inefficiente o il targeting di cellule sistemica infuse ai siti desiderati 3,4. Di conseguenza, vi è una costante ricerca di metodi per migliorare homing delle cellule, e specificamente cellula rotolamento, come strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella a rotazione sui vasi sanguigni è un passo fondamentale nella cascata di homing delle cellule, definito classicamente per i leucociti che vengono reclutati per siti di malattia 5. Questa fase è regolata da interazioni specifiche tra selectine endoteliali, cioè-P ed E-se....

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Protocol

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1. Cell Culture

  1. Leucemia promielocitica umana (HL-60) le cellule
    1. Culture cellule HL-60 nel 75 cm 2 palloni con 15 ml di Iscove Modified Medium (IMDM) di Dulbecco, supplementato con 20% (v / v) di siero fetale bovino (FBS), 1% (v / v) L-glutammina e 1 % (v / v) Penicillina-Streptomicina.
    2. Cambiare supporto ogni 3 giorni aspirando metà del volume di sospensione cellulare e sostituendolo con mezzi IMDM completo.
    3. Per carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl (CFSE) colorazione, centrifuga HL-60 sospensione cellulare (400 xg, 5 min), risospendere in una soluzione 1 mM CFSE (preparato in PBS preriscaldata) e incub....

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Results

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Cellule HL-60 rotolano sulle superfici-P ed E-selectina, ma non su fibronectina

Cellule HL-60 sono considerati "rulli" gold standard quanto esprimono una varietà di ligandi homing, compresi i leganti rotolamento P-sel-1 glicoproteina ligando (PSGL-1) e Sialyl-Lewis X (sLex) 5,14 (Figura 1A ). La proteina di superficie PSGL-1 agisce come impalcatura per il SLeX tetra-saccaridi, che mediano l'interazione specifica con P ed E-sel, che sono up-regolati sull'endotelio dur.......

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Discussion

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Una delle sfide principali nella traduzione di successo della terapia a base di cellule esogena è l'incapacità di fornire in modo efficiente le celle a siti di lesioni e infiammazioni con alta efficienza attecchimento 3. Laminazione cella rappresenta un passo fondamentale nel processo di homing delle cellule, facilitando la decelerazione di cellule sulle pareti dei vasi sanguigni, portando infine alla loro ferma adesione e trasmigrazione attraverso l'endotelio nel tessuto 5. Una migliore co.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Acknowledgements

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Cellule CHO-P sono stati un gentile dono del Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health di sovvenzione HL095722 a JMK Questo lavoro è stato supportato anche in parte da un Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award per JMK

....

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Materials

AnticorpiAltri reagenti

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cellule endoteliali microvascolari polmonari umaneLonzaCC-2527
Cellule ovariche di criceto cinese che esprimono P-selectina (CHO-P)Gentile dono della dottoressa Barbara Furie11,12
HL-60 CelluleATCCCCL-240
Reagenti per colture cellulari
Endoteliale Lonza media basaleCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
Endoteliale Integratore Basale Medium LonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1xGibco12440
F-12 (1x) Miscela di nutrienti (prosciutto)Gibco11765-054
Penicillina Streptomicina (P/S)Gibco15140
L-Glutammina (L/G) 200 mMGibco25030
Siero fetale bovino (FBS)Atlanta BiologicalsSa550
Piastre di Petri BDFalconBD-353003
Piastra per colture cellulari da 100 mm, polistirene
trattato con coltura tissutaleProvette da centrifuga (provette coniche in polipropilene da 15 ml)MedSupply PartnersTC1500
T75 FlaconiBD Falcon353136
Soluzione di gelatina (2%)SigmaG1393
dPBS (senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio)SigmaD8537
Soluzione di tripsina-EDTA (10x)SigmaT4174<
Anti-hE-Selectina/CD62ER& D SystemsBBA21
FITC IgG di topo coniugato 1R& D SystemsBBA21
Anti-hP-SelectinR& D SystemsBBA34
FITC IgG di topo coniugato 1R& D SystemsBBA34
FITC Topo IgG­ 1 κ Controllo dell'isotipoBD Bioscience555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, clone: 5F18Santa CruzSC70545
FITC coniugatoSanta CruzSC70545
normale controllo dell'isotipo IgM-FITC di topoSanta CruzSC2859
PE anti-umano CD162, clone: KPL-1BD Pharmingen556055
PE IgG di topo1 k Controllo isotipoBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)Santa CruzSC19996
Anti-E-Selectin Ab, clone P2H3MilliporeMAB2150
IgG di topo1 Controllo isotipoSanta CruzSC3877<
ricombinanti TNF-alfaPeproTech300-01A
- per citometria a flussoInvitrogenC34554
Proteina ricombinante umana P-selectina-FCR& D Systems137-PS-050
Proteina ricombinante E-selectina-FC umanaR& D Systems724-ES-100
Fibronectina Umana,Plasma Invitrogen33016-015
Equipment
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage era il software utilizzato per eseguire gli esperimenti e analizzare i dati
BioFlux Piastre a 48 pozzettiFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow CitometroBD BioscienceCFlow Plus è stato il software utilizzato per eseguire gli esperimenti e analizzare i dati
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD cameraPhotometrics
td colspan="4">td colspan="4"> Kit di proliferazione cellulare CFSE per tracce cellulari

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C.

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Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

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