Cortisolo (CORT) si accumula nel fusto del pelo crescente di esseri umani e primati non umani. Descriviamo metodi per l'estrazione e l'analisi dei capelli CORT con alta precisione e sensibilità. Misura di capelli CORT è particolarmente adatto per la valutazione dello stress cronico per periodi di settimane o mesi.
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Articolo metodologico
Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cortisolo, ormone dello stress (CORT) sta lentamente incorporato nel fusto del capello crescente di esseri umani, primati non umani, e altri mammiferi. Abbiamo sviluppato e validato un metodo per l'estrazione e l'analisi CORT da capelli scimmia rhesus e successivamente adattato questo metodo per l'utilizzo con i capelli del cuoio capelluto umano. In contrasto CORT "campioni point" ottenuti dal plasma o saliva, capelli CORT fornisce una misura integrata di attività del sistema ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA), e quindi lo stress fisiologico, durante il periodo di ormone incorporazione. Perché i capelli del cuoio capelluto umano cresce ad un tasso medio di 1 cm / mese, i livelli di CORT ottenuti dai segmenti di capelli diversi cm di lunghezza possono potenzialmente servire come biomarcatore di stress sperimentato un certo numero di mesi.
Nel nostro metodo, ciascun campione di capelli viene prima lavato due volte in isopropanolo per rimuovere eventuali CORT dall'esterno del fusto del capello che è stato depositato dal sudore o sebo. Dopo l'essiccazione, lacampione viene macinato in polvere finissima per rompere matrice proteica del capello e aumentare la superficie per l'estrazione. CORT dall'interno del fusto del capello è estratto in metanolo, il metanolo viene evaporato, e l'estratto viene ricostituito in tampone di saggio. Estratto CORT, con norme e controlli di qualità, viene poi analizzato mediante un enzima disponibile in commercio immunodosaggio sensibile e specifico (EIA) kit. Lettura della VIA viene convertito in pg CORT per mg peso dei capelli in polvere. Questo metodo è stato utilizzato nel nostro laboratorio per analizzare i capelli CORT negli esseri umani, diverse specie di macachi, uistitì, cani e orsi polari. Molti studi sia dal nostro laboratorio e da altri gruppi di ricerca hanno dimostrato la vasta applicabilità di capelli CORT per la valutazione dell'esposizione stress cronico in naturale così come le impostazioni di laboratorio.
Introduzione
Misurazione di CORT nel plasma, saliva, o occasionalmente in urina o feci è stato usato come indice di stress fisiologico Dalla scoperta di Selye del ruolo dell'asse HPA stress 1. Sebbene numerosi articoli sono stati pubblicati relative attività HPA a situazioni di stress acuto, il campo è stato ostacolato dalla mancanza di un indice semplice e affidabile di stress fisiologico cronico. Questo problema si verifica perché al plasma e saliva sia resa "punto" stime di attività HPA che sono soggette a variazione circadiana e possono essere confusi da disturbi ambientali. Campioni urinari e fecali producono misure di CORT e / o metaboliti che si estendono su un numero di ore fino ad un giorno intero in alcuni casi. Raccolta di campioni multipli utilizzando una delle seguenti matrici possono fornire un indice grezzo composito di livelli CORT nel tempo, tuttavia, nessuno di questi approcci fornisce un indice veramente a lungo termine di attività HPA e la reattività di questa systaminali a fattori di stress cronico.
Misurazione CORT nei capelli ha iniziato ad occupare questa esigenza importante nella letteratura stress. Gli studi iniziali di diversi laboratori hanno dimostrato la presenza di CORT in capelli umani, ma non ha verificato se i livelli di capelli CORT modificate in funzione di stress 2. Come il nostro laboratorio è stato interessato per molti anni nella regolazione dell'asse HPA scimmia rhesus da vari fattori sociali e comportamentali 3, abbiamo deciso di stabilire e convalidare metodi per l'estrazione e l'analisi di scimmia rhesus capelli 4. Basato sulla premessa che CORT ematica viene lentamente e continuamente incorporato in crescita dei capelli, lo scopo di questo nuovo metodo è stato quello di utilizzare livelli di CORT-capelli derivato come indice integrato di attività HPA su periodi di settimane o mesi.
Diverse sfide metodologiche sono state incontrate nello sviluppo del presente protocollo. Primo, studi precedenti avevano dimostrato che piccole quantità of circolante CORT sono escreti nel sudore e sebo e quindi potrebbe rivestire l'esterno del fusto del capello 2. Al fine di eliminare questo potenziale confondere, abbiamo sviluppato un procedimento di lavaggio delicato che appare per rimuovere CORT esterno pur avendo un effetto minimo sulla CORT presente all'interno del fusto del capello crescente. Così, capelli scimmia sottoposti a questa procedura (cioè due 3-min lavaggi con isopropanolo) perso circa il 7-8% del contenuto totale di capelli CORT, ed un terzo lavaggio rimosso meno dell'1% più steroideo del campione 4. Sembra che ci sia più CORT esterno in capelli umani, dal momento che la stessa procedura rimossa una media di contenuti CORT totale il 27% dei campioni (K. Rosenberg e J. Meyer, non pubblicati). Come capelli scimmia, tuttavia, un lavaggio supplementare conteneva molto meno CORT (circa 7%) rispetto ai primi due lavaggi. Pertanto, i risultati di entrambi scimmia e capelli umani supportano la tesi che la maggior parte (se non tutti) CORT esterno può essere rimosso, pur mantenendo una grande frazionezione CORT all'interno della matrice interna del capello. In secondo luogo, i nostri studi pilota hanno inoltre dimostrato che la macinazione capelli prima dell'estrazione significativamente maggiore recupero CORT dal campione, presumibilmente rompendo aperto matrice proteica complessa del fusto del capello oltre ad aumentare la superficie disponibile per la penetrazione del solvente. Sono stati sviluppati due diversi metodi di rettifica, ognuna con vantaggi e svantaggi. Metodo 1, che utilizza un mulino a sfere, ha il vantaggio di produrre la polvere più fine. Tuttavia, un mulino a sfere è un elemento dell'impianto relativamente costoso e, se utilizzato con giare standard e palle, è in grado di macinare solo due campioni per volta. Piccoli campioni sono anche difficili da trattare utilizzando un mulino a palle con giare standard. Metodo 2, che utilizza un beadbeater, è meno efficace nella sua capacità di macinazione. Come risultato, recupero medio CORT inferiore di circa il 10% utilizzando questo metodo rispetto al mulino a sfere (dati non pubblicati). D'altra parte, un beadbeaterè considerevolmente meno costoso di un mulino a palle, 16-24 campioni possono essere macinati contemporaneamente a seconda del modello, e il metodo è adatto per piccoli campioni. A causa del recupero differenziale suddetto, è consigliabile utilizzare lo stesso metodo di macinazione per tutti i campioni all'interno di un particolare studio.
Una volta che i campioni di capelli sono stati elaborati, vengono estratti con metanolo e CORT negli estratti viene analizzato mediante un kit EIA commerciale sensibile e specifico originariamente progettato per misurare CORT salivare. Le procedure di estrazione e di analisi sono stati convalidati in parte dimostrando che diluizioni seriali di estratti di campioni di capelli scimmia ha prodotto letture EIA che strettamente parallela alla letture ottenute dagli standard CORT autentici. Abbiamo poi dimostrato che CORT capelli (in aggiunta al plasma e salivare CORT) era sensibile alla importante fattore di stress vita di un trasferimento amministrativo incaricato delle scimmie a nuovi quartieri abitativi 4,5. La presentazionecarta t fornisce un resoconto dettagliato dei metodi utilizzati di routine nel nostro laboratorio per elaborare campioni di capelli umani e scimmie e per estrarre e analizzare CORT da tali campioni.
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Protocollo
1. Raccolta dei campioni e conservazione
- Capelli umani
- Fissare l'intera lunghezza dei capelli da campionare (fino a una matita larghezza di diametro) con un elastico o clip. Tagli capelli vicino al cuoio capelluto il più possibile (facendo attenzione a non intaccare la pelle), con un paio di forbici pulite. Nota: L'area di campionamento standard è il vertice posteriore del cranio.
- Alcuni ricercatori hanno segnalato una diminuzione dei livelli di CORT capelli umani con la distanza dal cuoio capelluto 6, che può essere dovuto a dilavamenti da ripetute esposizioni all'acqua e shampoo 7 (anche se vedi Manenschijn et al. 8 e Thomson et al. 9 per i risultati contrari a che è stato osservato alcun calo segmentale) Per ridurre al minimo l'impatto di questo potenziale "effetto washout", si consiglia di raccogliere i segmenti di capelli prossimale al cuoio capelluto con una lunghezza non superiore a 3 cm (ipotizzando un tasso di crescita media di 1 cm / mese 10, di un 3 segmento cm contiene CORT che è stato depositato su circa degli ultimi 3 mesi). Per fare questo, utilizzare un righello per misurare 3 cm dal primo taglio e tagliare di nuovo per cedere il campione tre centimetri. Nota: Una volta che i capelli sono stati tagliati a misura, non è più necessario mantenere i fili allineamento meno che lo studio comporta il taglio del campione in segmenti di 1 cm di lunghezza separati per stabilire un calendario retrospettiva di CORT deposizione nel periodo di tempo prima del campionamento 6.
- Posizionare il campione di capelli in un sacchetto realizzato in alluminio, una busta di carta pulita, o 15 ml con tappo a vite in polipropilene tubo da centrifuga del tipo utilizzato per il campione di lavaggio. Come CORT è estremamente stabile in capelli 2, i campioni possono essere conservati indefinitamente a -20 ° C e, se necessario, spedito notte a temperatura ambiente.
- La procedura di raccolta dei capelli dovrebbe essere praticata sui volontari ed i campioni di pratica deve essere valutato prima di imbarcarsi su uno studio completo. Nota: I campioni di capelli come small come 5-10 mg può essere analizzata utilizzando i metodi qui descritti, anche se è desiderabile raccogliere campioni> 10 mg per ridurre al minimo la probabilità di ottenere letture EIA sotto del livello più basso CORT.
- Capelli Scimmia
- Radersi i capelli (100-250 mg) dalla nuca con un clipper animale standard. Shave più vicino alla pelle il più possibile, facendo attenzione a non intaccare la pelle e causare sanguinamento perché i livelli di CORT sangue sono estremamente elevati rispetto a quelli trovati nei capelli. Nota: La zona del collo è stata scelta per il campionamento di routine perché è generalmente una buona fonte di capelli e può essere facilmente osservato per la ricrescita dei capelli prima ricampionamento.
- Collocare il campione di capelli in un sacchetto in carta stagnola o 15 ml con tappo a vite in polipropilene provetta. Campioni di capelli scimmia devono essere immagazzinati e spediti nello stesso modo come sopra descritto per i campioni di capelli umani.
- Perché i capelli scimmia, a differenza capelli delle persone, si sviluppa per una certa lunghezza e poi stops crescenti 11, non è generalmente possibile in questo caso utilizzare la distanza dalla pelle come un calendario per CORT deposizione. Tuttavia, se un animale può essere campionato più di una volta (per esempio, durante periodici esami sanitari di routine), è opportuno effettuare una rasatura iniziale per impostare un punto di tempo basale e poi reshave stessa zona dopo che è trascorso il periodo di tempo desiderato. CORT nel secondo campione è stato depositato durante l'intervallo di rasatura-reshave, che permette una precisa attribuzione di contenuti CORT del campione all'attività HPA oltre quell'intervallo 5.
2. Lavaggio del campione ed asciugatura
- Lavaggio
- Collocare ogni campione di capelli in un 15 ml con tappo a vite in polipropilene provetta.
- Aggiungere 5 ml di cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)-grade isopropanolo a ciascuna provetta seguita da inversione ripetuta per 3 min usando un rotatore.
- Versare il isopropanolo in un contenitore di rifiuti, tenendo csono di non perdere alcuna del campione.
- Ripetere i punti 2.1.2 e 2.1.3, una volta di più.
- Essiccazione
- Asciugare i capelli per almeno 2-3 giorni per garantire la completa evaporazione isopropanolo.
3. Rettifica campione e CORT estrazione - Metodo 1 per grandi campioni
- Macinazione del campione
- Posizionare fino a 250 mg di capelli secchi in un 10 ml di macinazione in acciaio inox vaso con un singolo di macinazione sfera in acciaio inox 12 millimetri.
- Macinare il campione per 6 minuti ad una velocità di 25 Hz utilizzando un mulino a palle.
- Pesare fino a 50 mg di capelli in polvere su una bilancia analitica e poi trasferirlo in un ambiente pulito 2,0 ml in polipropilene provetta per l'estrazione CORT successiva.
- Estrazione CORT
- Aggiungere 1,0 ml di metanolo per HPLC per la provetta contenente il campione in polvere.
- Chiudere la provetta e incubare il campione per 18-24 ore a temperatura ambiente con coinversione nstant utilizzando un rotatore.
- Centrifugare a 14.000 rpm per 1 min a temperatura ambiente per far sedimentare i capelli in polvere.
- Trasferire 0,6 ml di surnatante in un ambiente pulito da 1,5 ml provetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet di capelli in polvere.
4. Rettifica campione e CORT estrazione - Metodo 2 per i piccoli campioni
- Macinazione del campione
- Posizionare fino a 60 mg di capelli in un pre-pesate 2 ml provetta rinforzato per tallone pestaggio.
- Pesare il flaconcino per ottenere il peso del campione.
- Aggiungere tre perle 3,2 millimetri in acciaio cromato ad ogni flacone e poi macinare il campione per almeno 2 minuti in un battitore tallone. Se il controllo visivo rivela che il campione non è sufficientemente polverizzato, quindi eseguire macinazione supplementare per 0,5 o 1 min. Nota: Nessun trasferimento dei capelli terreno è necessaria in questo caso perché CORT estrazione viene eseguita nello stesso flaconcino come macinazione.
- Estrazione CORT
- Aggiungere 1,5 ml di metanolo per HPLC per la provetta contenente il campione in polvere.
- Chiudere la provetta e incubare il campione per 18-24 ore a temperatura ambiente con costante inversione usando un rotatore.
- Centrifugare a 10.000 rpm per 5 min a temperatura ambiente per far sedimentare i capelli in polvere. Nota: Le perle acciaio cromato rimangono nel tubo con i capelli durante le fasi di estrazione e centrifugazione, che rappresenta la velocità di centrifugazione inferiore rispetto al metodo 1.
- Trasferire 1,0 ml di surnatante in un ambiente pulito da 1,5 ml provetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet di capelli in polvere.
5. L'evaporazione del solvente e Ricostituzione del campione
- Essiccare per metanolo utilizzando un evaporatore sotto vuoto o un flusso di gas azoto se un evaporatore sotto vuoto non è disponibile. Se si utilizza un evaporatore sotto vuoto, il vapore metanolo può essere intrappolato mediantedi una trappola a freddo o una trappola chimico dotato di cartuccia di carbone attivo.
- Dopo la rimozione del metanolo, ricostituire l'estratto CORT in un volume adeguato di tampone EIA (test di diluente). Se sono previsti valori relativamente elevati CORT, quindi utilizzare un volume di tampone di 0,4 ml o superiore. Se sono previsti valori relativamente bassi, allora il volume può essere ridotto a 0,2 ml o meno per aumentare la sensibilità. Nota: 0.2 ml di volume è sufficiente per eseguire aliquote duplicati del campione almeno due volte nel caso in cui è necessaria una replica del campione.
- O saggiare il campione ricostituito immediatamente o congelarlo a -20 ° C per una successiva analisi. Nota: Se il campione ricostituito è congelato, è importante evitare sublimazione durante il periodo di congelamento da una alterazione del volume campione è causa di un valore CORT falsa quando vengono eseguiti i calcoli finali.
6. CORT Assay e conversione dei dati
- Analizzare i capelli con estratti diCORT con un alta sensibilità immuno-enzimatico (EIA) kit. Nota: Se si utilizza un salivare commerciale kit CORT EIA, seguire le raccomandazioni del fabbricante, come specificato nel foglietto kit, tranne che i campioni di prova saranno aliquote duplicato di ogni estratto capelli ricostituita invece di campioni di saliva.
- Preparare un estratto dei capelli di controllo di qualità (QC) per l'utilizzo in ogni test.
- Raccogliere un certo numero di campioni di capelli in più e uno elaborarli singolarmente come nei passi 4.1 e 4.2 o piscina per il campione di trasformazione grandi come nei passi 3.1 e 3.2.
- Far evaporare il solvente e ricostituire gli estratti come nei passi 5.1 e 5.2, quindi unire gli estratti ricostituiti da diversi campioni singoli o aggregati.
- Aliquota un volume adeguato dell'estratto ricostituito pool (ad esempio 0.10 ml) in provette da microcentrifuga individuali e congelare per un uso successivo.
- Scongelare ed eseguire un'aliquota QC in duplice copia su ogni micropiastra immunodosaggio a fornire un referenza valore CORT per il controllo della qualità di ogni esecuzione.
- Un coefficiente intra-saggio di variazione (CV, definita come la deviazione standard divisa per la media di un insieme di valori di esempio) può essere calcolato analizzando 10-12 QC pozzetti nello stesso periodo, mentre un inter-saggio CV può essere calcolato utilizzando i valori QC attraverso un gruppo di piste. Se il proprio software lettore di micropiastre calcola un CV per i pozzetti duplicati rappresentano ogni estratto di capelli, quindi un metodo alternativo per la determinazione intra-assay CV è quello di calcolare la media di tali valori individuali CV su tutta la piastra.
- Se un estratto del campione produce una lettura superiore al più alto standard CORT nella VIA, poi un'altra aliquota dell'estratto viene diluita con una quantità appropriata di tampone e la successiva lettura VIA viene corretto per il fattore di diluizione. I campioni vengono inoltre regolarmente rianalizzati se il CV per i pozzetti duplicati è> 10%.
- Perché kit CORT EIA sono progettati per misurare CORT values in campioni liquidi come saliva o plasma, l'uscita del software lettore di micropiastre deve essere convertito in quantità di CORT per unità di peso di capelli in polvere. La seguente formula converte l'uscita dosaggio in mg / dl a pg CORT per capelli mg:
(A / B) * (C / D) * E * 10.000 = F
dove A = mg / dl uscita dal dosaggio; B = peso (in mg) di capelli sottoposto ad estrazione; C = vol. (In ml) di metanolo aggiunto ai capelli in polvere; D = vol. (In ml) di metanolo recuperato dall'estratto e successivamente essiccato giù; E = vol. (In ml) di tampone usato per ricostituire l'estratto secco e F = Valore finale della concentrazione di CORT capelli in pg / mg.
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Risultati
La Figura 1 mostra la stampa da una serie rappresentativa di campioni di capelli umani (maschi adulti e soggetti umani femmine) trattati con il metodo 2 macinazione ed estrazione. Il software è stato utilizzato per generare l'uscita dei dati e per adattarsi a 4 parametri curva sigmoidale agli standard CORT (Figura 2). I tra-ben CV di questa piastra variava 0,01-5,73%, con una media di CV intra-saggio del 1,34%. Il CV inter-assay determinato utilizzando i valori di QC da nove recenti...
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Discussione
La procedura capelli CORT sopra descritto è semplice da eseguire, è relativamente poco costoso, fa uso di prodotti chimici facilmente disponibili, reagenti e materiali di consumo, e richiede attrezzature che, con una sola eccezione, è probabile che sia presente in un tipico laboratorio di analisi. L'eccezione è un apparecchio di macinazione come un mulino a sfere o mini-beadbeater. Notiamo che alcuni gruppi di ricerca tritare campioni di capelli in piccoli frammenti di circa 1 millimetro di lunghezza 12, ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Kymberlee O'Brien, Celia Moore, e Edward Tronick (Dipartimento di Psicologia, University of Massachusetts, Boston) per fornire i campioni di capelli umani analizzati in questo studio, e Stephen Suomi e Amanda Dettmer (Laboratorio di Etologia Comparativa, NICHD) per fornire i campioni di capelli scimmia rhesus. Sviluppo iniziale e l'uso continuato di questo metodo è stato sostenuto da NIH RR11122 MAN
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Isopropanolo di grado HPLC | Fisher | A451 | |
| Metanolo di grado HPLC | Fisher | A452 | |
| Kit per il dosaggio del cortisolo salivare | 1-3002 | Vedere il foglietto illustrativo del kit del produttore per informazioni sulla sensibilità e la specificità del test | |
| 15 ml di provette da centrifuga in polipropilene con tappo a vite | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1,5 ml Provette per microcentrifuga Safe-Lock | Fisher | 05-402-25 | |
| Provette per microcentrifuga Safe-Lock da 2,0 ml | Fisher | 05-402-7 | |
| Microfiale rinforzate XXTuff da 2,0 ml | BioSpec | 330TX | Da utilizzare con mini-beadbeater |
| Perline in acciaio cromato da 3,2 mm BioSpec | 11079132c | Utilizzare con mini-beadbeater | |
| Giare di macinazione in acciaio inox da 10 ml | Retsch | 02.462.0061 | Utilizzo con vibromulino |
| Sfere di macinazione in acciaio inox da 12 mm | Retsch | 05.368.0037 | Utilizzo con vibromulino |
| Cartuccia a carbone attivo | Savant | Fisher DTK120R | Utilizzo con trappola chimica Savant |
| Rotatore per provette da centrifuga da 15 ml | Fisher | S02135 | |
| Rotatore per provette da microcentrifuga | Fisher | NC9854190 | |
| Centrifuga da banco per provette per microcentrifuga | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 vibromulino | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant trappola di vapore refrigerata | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant trappola chimica | Fisher | SCT120 | Alternativa alla trappola di vapore refrigerata |
| Lettore di micropiastre Lavapiastre | |||
| Miscelatore | |||
| Pipettatore | |||
| Bilancia |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
