Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

Sommario

Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.

Abstract

Negli ultimi anni, l'imaging a due fotoni è diventato uno strumento prezioso in neuroscienze, in quanto consente di misurazione cronica della attività delle cellule geneticamente identificati durante comportamento ^1-6. Qui si descrivono metodi per eseguire due fotoni di imaging in topo corteccia mentre l'animale si sposta un ambiente di realtà virtuale. Ci concentriamo sugli aspetti delle procedure sperimentali che sono fondamentali per l'imaging in un animale si comporta in un ambiente virtuale illuminata. I problemi principali che sorgono in questa configurazione sperimentale che noi qui l'indirizzo sono: ridurre al minimo gli artefatti da movimento legati al cervello, riducendo al minimo perdite luce dal sistema di realtà virtuale di proiezione, e minimizzando laser indotto danni ai tessuti. Forniamo anche software di esempio per controllare l'ambiente di realtà virtuale e di fare il monitoraggio allievo. Con queste procedure e risorse dovrebbe essere possibile convertire un microscopio a due fotoni convenzionale per uso nel comportarsi topi.

Introduzione

Due fotoni di imaging di indicatori di calcio (geneticamente codificate come GCaMP5 ⁷ o R-GECO ^8, o coloranti sintetici come OGB o Fluo4) è emersa come un potente metodo di misurazione dell'attività neuronale nel comportarsi topi ^1-6. Esso consente la misurazione simultanea dell'attività di centinaia di cellule a potenziale risoluzione azione quasi unico, fino a circa 800 micron sotto la superficie del cervello ^9,10. Inoltre, utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) attività neuronale può essere misurata cronicamente ^5,11,12, e in tipi di cellule geneticamente definiti ^13. Insieme, questi metodi forniscono un grado di risoluzione temporale e spaziale che aprono una moltitudine di nuove possibilità nello studio della computazione neuronale in vivo.

È necessario un intervento chirurgico per esporre ed etichettare il cervello del mouse per l'imaging. Le cellule trasfettate sono tipicamente utilizzando un vir adeno-associato ricombinante siamo Sistema (AAV) per la consegna GECI e una finestra cranica è impiantato sul sito di iniezione per ottenere l'accesso ottico al cervello. Una barra di testa è poi collegato al cranio per il fissaggio testa sotto il microscopio a due fotoni. La progettazione e l'attuazione di questi passaggi è fondamentale come la maggior parte dei problemi con l'imaging sveglio derivano da instabilità nella preparazione. Idealmente la procedura qui descritta dovrebbe consentire per l'imaging cronica fino a diversi mesi dopo l'intervento.

Per abilitare il comportamento guidato visivamente durante l'imaging a due fotoni, il mouse fisso testa si siede su un gonfiabile tapis roulant sferica, che si può utilizzare per navigare in un ambiente di realtà virtuale. Locomozione del mouse sul tapis roulant è accoppiato al movimento in un ambiente virtuale che viene visualizzata su uno schermo toroidale che circonda il ^14,15 mouse. Variabili comportamentali come la locomozione, stimoli visivi, e la posizione della pupilla possono essere registrate ^6.

t "> Descriviamo le procedure necessarie cronica due fotoni di imaging in topi esplorare un ambiente di realtà virtuale I punti fondamentali affrontate sono:. riduzione di artefatti di movimento, riduzione della perdita di luce, massimizzazione del numero di cellule registrate simultaneamente, e ridurre al minimo danni photo. Abbiamo anche fornito dettagli sulla configurazione del tapis roulant aria-di sostegno, il monitoraggio allievo, e l'ambiente di realtà virtuale. Le procedure qui descritte possono essere utilizzate per l'imaging popolazioni di cellule fluorescente nei topi fissati alla testa in una potenzialmente vasta gamma di paradigmi comportamentali .

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità alle direttive del Dipartimento veterinario del Cantone di Basilea-Città.

1. Configurazione hardware e software

1. Due fotoni configurazione microscopio a scansione:
   1. Utilizzare un laser infrarosso ad impulsi come fonte di illuminazione (larghezza di impulso <120 fsec).
   2. Utilizzare una testa di scansione composta da uno scanner di risonanza 8 o 12 kHz e un livello galvanometro. Nota: questo permette un frame rate di 40 o 60 Hz a 750 x 400 pixel. Un frame rate elevato è fondamentale per ridurre al minimo il movimento del cervello distorsione dell'immagine indotta. Inoltre, i risultati di scansione veloce di risonanza in un rendimento superiore del segnale e riduce photobleaching ¹⁶ e fototossicità.
   3. Utilizzare una velocità elevata z-stepper piezo-elettrico in sequenza le immagini intercalati tempo acquisiscono a più profondità. Nota: Questo è opzionale e utilizzato per aumentare la resa dei dati a scapito del frame rate.
   4. Utilizzare amblanker eccanico per ridurre l'esposizione laser al tessuto. Regolare la larghezza della blanker funzione dell'ampiezza dello scanner risonante Nota:. Causa della natura sinusoidale del percorso di scansione di uno scanner di risonanza, il raggio laser si muove invece lento nei punti di consegna di scansione. Per evitare danni del tessuto in questi punti di consegna in cui l'esposizione laser è maggiore, un blanker meccanico viene introdotto nel piano focale tra la scansione e lenti tubo che interrompe il fascio laser.
   5. Per l'acquisizione dei dati utilizzare un digitalizzatore ad alta velocità (800 MHz) in combinazione con una matrice di field-programmable gate (FPGA). Nota: I filtri passa-alto FPGA e cestini il segnale PMT in pixel. La combinazione del filtro passa-alto sul FPGA e il filtro passa-basso effetto il risultato amplificatore PMT in un filtro passa-banda centrato approssimativamente intorno alla frequenza di ripetizione del laser (80 MHz). Esempio di codice FPGA viene fornito come supplemento.
2. Impostazione tapis roulant Air supportato basato sul disegno di Dombeck e colleghi ²
   1. Collegare il titolare palla per una linea di alimentazione dell'aria utilizzando un tubo di alimentazione di aria di almeno 10 mm di diametro interno. Massimizzare la sezione del bocchettone di rifornimento dell'aria portapalline e posizionare ampie quantità di tubazione tra l'alimentazione dell'aria principale e la porta pallina Nota:. Aumento sezione trasversale e una maggiore lunghezza del tubo di alimentazione dell'aria riduce la generazione di rumore.
   2. Mettere una pallina di polistirolo espanso (diametro 20 cm) in un supporto palla custom-designed e 3D-stampati.
   3. Se il paradigma comportamentale richiede solo avanti (e indietro) locomozione, limitare il movimento della sfera e la (pitch) asse orizzontale inserendo un perno (ad esempio un ago ipodermico G 19) sul lato della palla Nota:. Tipicamente animali si adattano alle l'installazione molto più veloce in questo paradigma di rotazione ridotta.
   4. Traccia movimento della palla con una o due mouse per computer otticiper rilevare il movimento intorno a due o tutti e tre gli assi, rispettivamente. Nota: I mouse per computer dovrebbe idealmente operare con un diodo ad infrarossi per almeno interferenze con il imaging.
3. Impostazione ambiente di realtà virtuale
   1. Preparare l'ambiente di realtà virtuale. Nota: Un ambiente campione basato su Panda3D, un motore di gioco liberamente disponibile, è fornito come supplemento. Gli oggetti dell'ambiente virtuale vengono generati utilizzando Wings3D, un modellatore 3D open source. Il programma di esempio legge le informazioni di posizione su una scheda di acquisizione dati e questo si traduce in movimento in un ambiente virtuale. Il codice esegue la trasformazione non lineare necessaria per l'ambiente da proiettare su uno schermo toroidale. La costruzione dettagliata della schermata toroidale è stato descritto altrove ^14,17.
   2. Utilizzare proiettori LED o schermi di computer retroilluminati a LED per la visualizzazione di un ambiente virtuale. Integrare un circuito gatingCUIT per un veloce sfarfallio dei LED durante l'imaging. Nota: Un problema inerente a due fotoni di imaging durante la stimolazione visiva è perdita di luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva, che può essere ridotto schermando l'obiettivo. Tuttavia, leggera perdita dal sistema di stimolazione visiva può essere completamente abolita sincronizzando l'emissione di luce del proiettore ai punti di consegna dello scanner di risonanza (quando i dati non vengono acquisiti), come si fa con arene LED utilizzati per la stimolazione visiva durante l'imaging in Drosophila ^18. Ciò si traduce in un efficace alternanza alta velocità di stimolazione visiva e acquisizione dati (vedere la Figura 2). La frequenza di sfarfallio (24 kHz) è ordini di grandezza superiori alla soglia sfarfallio di fusione, dal quale sfarfallio non è più percepito dall'animale. Lo schema del circuito elettronico di questa modifica a un proiettore commerciale LED è mostrato in Figura 3.
4. Cuccioloil monitoraggio
   1. Utilizzare una videocamera basata CMOS (30 fps) per il rilevamento di posizione della pupilla. Assicurarsi che la fotocamera non contiene un filtro di blocco infrarossi. Nota: L'allievo è visibile ad alto contrasto durante le registrazioni a causa della luce diffusa dal laser di eccitazione a due fotoni in uscita attraverso l'occhio. Posizione della pupilla e diametro viene estratto in tempo reale utilizzando software programmato personalizzato basato sul disegno di Sakatani e Isa ^19.

2. Iniezione di calcio genetica Indicator e la finestra Implant

L'iniezione di un indicatore di calcio ²⁰ e l'impianto della finestra cranica ²¹ vengono eseguiti come precedentemente descritto con le seguenti aggiunte:

1. Iniettare il virus nella regione di interesse utilizzando una pipetta di iniezione vetro ripiena con soluzione virus e collegato ad un sistema di iniezione a pressione. Regolare la pressione in funzione della pipetta interna-diametro, tipicamente ca. 70-140 mbar, per iniettare circa 100 nl di soluzione virus nel corso di 1-2 min. Impulsi di iniezione basso volume erogato a bassa frequenza (0,05 sec impulsi a 2 Hz) dovrebbero essere utilizzati al fine di evitare overflow del virus lungo la pipetta durante l'iniezione. Nota: Al fine di controllare il volume di iniezione, la pipetta può essere marcato in piccola , lunghezze equidistanti (ad esempio 0,5 millimetri) sotto un microscopio stereo. Spostamento del menisco tra le marcature può quindi essere utilizzato per stimare il volume iniettato.
2. Diversi iniezione settimane dopo ciò dovrebbe comportare un bolo di cellule densamente marcate con un diametro di circa 500 micron. Efficacia di espressione GECI nella regione di interesse dipende dalla scelta di GECI e combinazione promotore, così come il titolo infettivo e sierotipo di AAV ricombinante usato Nota:. Come esempio rappresentativo, iniezione di AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una tetta viraleer di 8 x 10 ¹² GC / ml nella corteccia visiva primaria del mouse comporta espressioni soddisfacente a circa due settimane dopo l'iniezione (Figura 1).
3. La barra testa non deve ostacolare il campo visivo del mouse, ma deve essere sufficientemente rigido per consentire l'imaging stabile durante il comportamento. Ciò richiede in genere due punti di attacco su entrambi i lati della barra di testa (vedi figura 1). Per fissare saldamente la barra testa al cranio, assicurarsi di massimizzare e asciugare la zona del cranio esposto in cui sarà allegata la barra testa. Inoltre, utilizzando un bisturi o una siringa, graffiare il cranio per creare scanalature superficiali aumentando così la superficie di incollaggio. Coprire l'osso con tessuto adesivo cianoacrilato prima di fissare la barra testa con cemento dentale.

3. Procedura sperimentale

1. Due o tre settimane dopo l'iniezione del virus, controllare la finestra di impianto craniale per chiarezza e di espressione in epiilluminazione a fluorescenza. Confini chiaramente visibili e ben definiti dei vasi sanguigni superficiali sono una buona indicazione che l'impianto finestra è adatto per l'imaging (vedere Figura 1).
2. Misurare e regolare la potenza del laser ad un valore inferiore a 50 mW a campione.
3. Accendere il flusso d'aria per il tapis roulant sferica.
4. Per il fissaggio testa sotto il microscopio, brevemente anestetizzare l'animale con isoflurano per ridurre lo stress. Posto l'animale in un contenitore anestesia isoflurano e attendere che le fermate degli animali in movimento (circa 10 sec). Rimuovere l'animale e subito la testa fissarlo sotto il microscopio.
5. Posizionare il sistema di visualizzazione più vicino possibile all'animale per consentire ancora per l'accesso agli animali. Il contatto visivo meno l'animale ha con lo sperimentatore, il meno stressato l'animale sarà durante la fase iniziale dell'esperimento.
6. Assicurarsi che la finestra di protesi cranica è libero di polvere e sporcizia. Pulire con acquase necessario.
7. Applicare il gel trasparente ultrasuoni come mezzo di immersione tra la finestra cranica e l'obiettivo di acqua-immersion. Questo risolve i problemi di lenta degradazione dell'immagine dovuta all'evaporazione di acqua o perdite e riduce la necessità di montare un cono sulla barra testa di trattenere l'acqua. Nota: Centrifugare il gel prima dell'uso per rimuovere tutte le bolle d'aria, e fare attenzione a non creare l'aria bolle durante l'applicazione del gel. Le bolle d'aria possono ridurre notevolmente la qualità dell'immagine.
8. Avvolgere un pezzo di nastro adesivo nero attorno al bar oggettiva e la testa per la schermatura della luce.
9. Spostare l'arena ambiente virtuale nella sua posizione definitiva e regolare la telecamera per il monitoraggio degli alunni.
10. Impostare la blanker laser per abbinare l'ampiezza di scansione utilizzata durante l'esperimento.
11. Avviare la registrazione dei dati.

Risultati

La qualità dell'immagine in due fotoni Imaging di calcio di popolazioni di cellule marcate con un GECI dipende in gran parte la qualità della finestra protesi cranica. Due settimane dopo l'iniezione del virus della finestra del cranio devono essere ispezionati per chiarezza. Non ci dovrebbe essere tessuto di granulazione o ricrescita ossea visibile (Figura 1A). Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali rimanga invariato e confini del sistema vascolare deve essere nettamente definito. Allo stes...

Discussione

La chiave del successo di comportamentale due fotoni di imaging è la stabilità della preparazione in due modi:

1. Nel corso della finestra giorni dopo l'impianto, risposte infiammatorie del tessuto possono portare al miglioramento della formazione di tessuto di granulazione e la cartilagine che ostacolare o addirittura impedire imaging.
2. Durante l'esperimento il cervello deve essere abbastanza stabile per evitare artefatti da movimento di danneggiare segnale di fluorescenza attività relativa n...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini coprioggetti (diametro = 3-5 mm)	Impianto a finestra	Menzel
Laser InSight DeepSee	Microscopio Spectra-Physics
Scanner a risonanza 12 kHz Microscopio	Cambridge Technology	G1-003-30026
Galvometro	Cambridge Technology	G6215H
microscopio Digitalizzatore	National Instruments	NI 5772	microscopio
FPGA	Instruments	PXIe 7965R	microscopio
Scheda di acquisizione	Instruments	PCIe 6363
microscopio Filtro di emissione 525/50	Semrock	FF03-525/50-25
Piezoelettrico z-drive	Physikinstrumente	P-726.1CD	microscopio
Controller per piezoelettrico azionamento	Physikinstrumente	E665 Microscopio LVPZT
Obiettivo 16X, 0,8NA	Microscopio Nikon	CFI75
Amplificatore di corrente	Microscopio Femto	DHPCA-100
Tubo fotomoltiplicatore	Microscopio Hamamatsu
Fotocamera USB senza filtro IR	ImagingTracciamento
della sorgente DMK22BUC03 pupillaObiettivo 50 mm	ImagingSource	M5018-MP	tracciamento pupillare
Anelli adattatori macro	ImagingSource	LAexSet	tracciamento pupillare
Mouse ottico per computer	Logitech	G500	rilevamento del movimento
Palla di polistirolo 20 cm	, ad es. idee-shop.de	08797.00.15	ambiente virtuale
Proiettore LED	Samsung	SP-F10M	virtuale National
	Instruments	NI 6009	ambiente virtuale
Panda3D game engine		www.panda3d.org	virtual environment
Libreria Numpy per Python		www.scipy.org	virtual environment
Scipy libreria per Python		www.scipy.org	ambiente virtuale
Driver NI-DAQmx	National Instruments	www.ni.com	ambiente virtuale
Gel per ultrasuoni	Dahlhausen	5701.0342.10	imaging