Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.
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Articolo metodologico
Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli ultimi anni, l'imaging a due fotoni è diventato uno strumento prezioso in neuroscienze, in quanto consente di misurazione cronica della attività delle cellule geneticamente identificati durante comportamento 1-6. Qui si descrivono metodi per eseguire due fotoni di imaging in topo corteccia mentre l'animale si sposta un ambiente di realtà virtuale. Ci concentriamo sugli aspetti delle procedure sperimentali che sono fondamentali per l'imaging in un animale si comporta in un ambiente virtuale illuminata. I problemi principali che sorgono in questa configurazione sperimentale che noi qui l'indirizzo sono: ridurre al minimo gli artefatti da movimento legati al cervello, riducendo al minimo perdite luce dal sistema di realtà virtuale di proiezione, e minimizzando laser indotto danni ai tessuti. Forniamo anche software di esempio per controllare l'ambiente di realtà virtuale e di fare il monitoraggio allievo. Con queste procedure e risorse dovrebbe essere possibile convertire un microscopio a due fotoni convenzionale per uso nel comportarsi topi.
Introduzione
Due fotoni di imaging di indicatori di calcio (geneticamente codificate come GCaMP5 7 o R-GECO 8, o coloranti sintetici come OGB o Fluo4) è emersa come un potente metodo di misurazione dell'attività neuronale nel comportarsi topi 1-6. Esso consente la misurazione simultanea dell'attività di centinaia di cellule a potenziale risoluzione azione quasi unico, fino a circa 800 micron sotto la superficie del cervello 9,10. Inoltre, utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) attività neuronale può essere misurata cronicamente 5,11,12, e in tipi di cellule geneticamente definiti 13.
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità alle direttive del Dipartimento veterinario del Cantone di Basilea-Città.
1. Configurazione hardware e software
- Due fotoni configurazione microscopio a scansione:
- Utilizzare un laser infrarosso ad impulsi come fonte di illuminazione (larghezza di impulso <120 fsec).
- Utilizzare una testa di scansione composta da uno scanner di risonanza 8 o 12 kHz e un livello galvanometro. Nota: questo permette un frame rate di 40 o 60 Hz a 750 x 400 pixel. Un frame rate elevato è fondamentale per ridurre al minimo il movimento de....
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Risultati
La qualità dell'immagine in due fotoni Imaging di calcio di popolazioni di cellule marcate con un GECI dipende in gran parte la qualità della finestra protesi cranica. Due settimane dopo l'iniezione del virus della finestra del cranio devono essere ispezionati per chiarezza. Non ci dovrebbe essere tessuto di granulazione o ricrescita ossea visibile (Figura 1A). Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali rimanga invariato e confini del sistema vascolare deve essere nettamente definito. A.......
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Discussione
La chiave del successo di comportamentale due fotoni di imaging è la stabilità della preparazione in due modi:
- Nel corso della finestra giorni dopo l'impianto, risposte infiammatorie del tessuto possono portare al miglioramento della formazione di tessuto di granulazione e la cartilagine che ostacolare o addirittura impedire imaging.
- Durante l'esperimento il cervello deve essere abbastanza stabile per evitare artefatti da movimento di danneggiare segnale di fluorescenza attività relativa n.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, la Max Planck Society, e la Scienza del programma Human Frontiers.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini coprioggetti (diametro = 3-5 mm) | Impianto a finestra | Menzel | |
| Laser InSight DeepSee | Microscopio Spectra-Physics | ||
| Scanner a risonanza 12 kHz Microscopio | Cambridge Technology | G1-003-30026 | |
| Galvometro | Cambridge Technology | G6215H | |
| microscopio Digitalizzatore | National Instruments | NI 5772 | microscopio |
| FPGA | Instruments | PXIe 7965R | microscopio |
| Scheda di acquisizione | Instruments | PCIe 6363 | |
| microscopio Filtro di emissione 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | |
| Piezoelettrico z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscopio |
| Controller per piezoelettrico azionamento | Physikinstrumente | E665 Microscopio LVPZT | |
| Obiettivo 16X, 0,8NA | Microscopio Nikon | CFI75 | |
| Amplificatore di corrente | Microscopio Femto | DHPCA-100 | |
| Tubo fotomoltiplicatore | Microscopio Hamamatsu | ||
| Fotocamera USB senza filtro IR | ImagingTracciamento | ||
| della sorgente DMK22BUC03 pupillaObiettivo 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | tracciamento pupillare |
| Anelli adattatori macro | ImagingSource | LAexSet | tracciamento pupillare |
| Mouse ottico per computer | Logitech | G500 | rilevamento del movimento |
| Palla di polistirolo 20 cm | , ad es. idee-shop.de | 08797.00.15 | ambiente virtuale |
| Proiettore LED | Samsung | SP-F10M | virtuale National |
| Instruments | NI 6009 | ambiente virtuale | |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Libreria Numpy per Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy libreria per Python | www.scipy.org | ambiente virtuale | |
| Driver NI-DAQmx | National Instruments | www.ni.com | ambiente virtuale |
| Gel per ultrasuoni | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
Riferimenti
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W.
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Ristampe e permessi
