La miscelazione è un approccio efficace per generare biomateriali con una vasta gamma di proprietà e caratteristiche combinate. Per predire le interazioni molecolari tra diverse proteine della seta naturale, nuove piattaforme lega proteine della seta-seta con sintonizzabile resilienza meccanica, risposta elettrica, trasparenza ottica, lavorabilità chimica, biodegradabilità, stabilità termica o possono essere progettati.
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Articolo metodologico
Progettazione di materiali in lega di proteine della seta-seta per le applicazioni biomediche
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteine fibrose mostrano diverse sequenze e strutture che sono stati utilizzati per varie applicazioni in campo biomedico, quali biosensori, la nanomedicina, la rigenerazione dei tessuti, e la consegna della droga. Progettazione di materiali basati sulle interazioni su scala molecolare tra queste proteine vi aiuterà a generare nuovi biomateriali in lega proteina multifunzionale con proprietà sintonizzabili. Tali sistemi materiali lega anche fornire vantaggi rispetto ai polimeri sintetici tradizionali a causa della biodegradabilità dei materiali, biocompatibilità, e tenability nel corpo. Questo articolo ha usato le miscele di proteine della seta selvaggia tussah (Antheraea pernyi) e gelso seta domestico (Bombyx mori) come esempio per fornire protocolli utili riguardo questi argomenti, compreso il modo di predire le interazioni proteina-proteina mediante metodi computazionali, come per la produzione di leghe di proteine soluzioni, come per verificare sistemi di leghe mediante analisi termica, e su come fabbricare materiali in lega di variabilicompresi i materiali ottici con reticoli di diffrazione, materiali elettrici con circuiti rivestimenti e materiali farmaceutici per il rilascio del farmaco e la consegna. Questi metodi possono fornire informazioni importanti per la progettazione di biomateriali multifunzionali di nuova generazione basato su diverse leghe di proteine.
Introduzione
La natura ha creato strategie per generare matrici biologiche sintonizzabili e multifunzionali utilizzando un numero limitato di proteine strutturali. Ad esempio, elastins e collagene vengono sempre utilizzati insieme in vivo per fornire i punti di forza regolabili e le funzioni richieste per tessuti specifici 1,2. La chiave di questa strategia è la fusione. Blending coinvolge proteine di miscelazione con rapporti specifici ed è un approccio tecnologico per generare semplici sistemi materiali con sintonizzabile e varie proprietà di 3-5. Rispetto alle strategie di ingegneria sintetici 6,7, la miscelazione può anche migliorare l'uniformità del materiale e la capacità di elaborare il materiale a causa della facilità di funzionamento 8-16. Pertanto, la progettazione di materiali in lega di proteine multifunzionali, biocompatibili è un settore emergente della ricerca medica. Questa tecnologia fornirà anche la conoscenza sistematica dell'impatto di matrici proteiche naturali sulle funzioni di cellule e tessuti sia in vitro e in vivo 10,17. Ottimizzando interfacce molecolari tra proteine diverse, leghe a base di proteine può comprendere una gamma di funzioni fisiche, come la stabilità termica a temperature diverse, elasticità di sostenere i tessuti diversi, la sensibilità elettrica negli organi variabili, e le proprietà ottiche per la rigenerazione del tessuto corneale 3, 18-27. Il risultato di questi studi fornirà una nuova piattaforma di proteina-materiali nel campo della scienza biomedica con rilevanza diretta per la riparazione dei tessuti sintonizzabili e trattamenti di malattia e ulteriori portano a dispositivi di impianto biodegradabili dove le loro caratteristiche di novità terapeutiche e diagnostiche possono essere immaginato 3.
Molte proteine strutturali naturali hanno importanti proprietà fisiche e bioattive che possono essere sfruttate come candidati per le matrici biomateriale. Sete di diverse specie di vermi, cheratine da peli e lane, elastins e collagene da tessuti diversi, evarie proteine vegetali sono alcune delle proteine strutturali più comuni utilizzati per la progettazione di materiali a base di proteine variabile (Figura 1), 18-27. In generale, queste proteine possono formare diverse strutture molecolari secondarie (ad esempio, foglietti beta per sete, o bobine a spirale per cheratine) a causa delle loro uniche ripetitive sequenze di amminoacidi primaria 3,28-35. Queste caratteristiche favoriscono la formazione di strutture macroscopiche auto-assemblato con funzioni uniche in interfacce biologiche che spingono la loro utilità come una risorsa preziosa di materiali biopolimeri. Qui, sono stati utilizzati due tipi di proteine strutturali (proteina A da selvaggio seta tussah e proteine B addomesticati da seta di gelso come esempio) per dimostrare i protocolli generali di produzione di vari biomateriali in lega proteine. I protocolli sono dimostrati parte 1: le previsioni di interazione proteina e simulazioni, parte 2: produzione di soluzioni in lega proteine, e parte 3: fabbricazione di lega di proteinesistemi e per applicazioni ottiche, elettriche e farmaceutici.
Figura 1. materie prime di varie proteine strutturali che vengono comunemente utilizzati nel nostro laboratorio per la progettazione di materiali a base di proteine, tra cui sete di diverse specie di vermi, cheratine da peli e lane, elastins da diversi tessuti, e varie proteine vegetali.
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Protocollo
1 Pronostico interazioni proteiche
- Analisi Bioinfomatics di molecole proteiche
- Visita il Centro Nazionale per il sito web Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), e cercare i nomi di proteine che verranno utilizzati per lo studio della lega. Nota: Per questo esempio, sono stati utilizzati due proteine: la proteina A, che è la fibroina di seta tussah selvaggia, e la proteina B, che è la fibroina della seta di gelso domestico. Per la proteina A, le sequenze di amminoacidi possono essere trovati in "fibroina [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi è il cinese (Oak) Tussah Moth). Per la proteina B, le sequenze di amminoacidi si possono trovare in "fibroina catena pesante precursore [Bombyx mori] NCBI Sequenza Riferimento: NP_001106733.1" e "fibroina catena leggera precursore [Bombyx mori] NCBI Sequenza Riferimento: NP_001037488.1" insieme (Bombyx Mori è il baco da seta addomesticato del gelso).
- Selezionare e save le sequenze amminoacidiche della proteina A e la proteina B dal database.
- Visita il sito ExPASy (SIB Bioinformatica Resource Portal) (www.expasy.org) o utilizzare un altro software commerciale per calcolare i bioinfomatics base dati di proteine in base alle loro sequenze, tra cui, ma non limitato a, carica totale per molecola, indice di idrofobicità la molecola, curva di titolazione delle molecole a diversi valori di pH, ecc Queste informazioni saranno utilizzate come elementi di base per la simulazione computazionale delle interazioni proteiche, e aiuterà a capire se queste due proteine hanno interazioni forti. [Nota: Questo passaggio non è per prevedere con precisione ogni dettaglio delle interazioni proteina come quelli utilizzati in piccoli peptidi o proteine funzionali scienza. Lo scopo di questa sezione è solo per evitare di produrre una miscela proteica con evidenti separazioni macrofase, che non può essere chiamato un materiale "lega". Pertanto, la stima potrebbe essere approssimativa ma thsistema, in lega di proteine e può essere verificata da un metodo sperimentale descritto al punto 3.1 utilizzando precisa analisi termica].
- Simulazione computazionale di proteine sistema Alloy
Di seguito viene descritta una procedura per simulare il sistema lega proteine. Un programma di simulazione è scritto in linguaggio di programmazione C che può essere utilizzato su un singolo o multiprocessore sistema informatico. Un reticolo-molla-massa (LSM) modello è stato utilizzato per simulare i lega-proteine 36-39. Il modello LSM fornisce una semplice descrizione della forza risultante su una massa quando attaccato ad una molla e si può risolvere l'equazione forza di capire il movimento per ogni massa. Un algoritmo semplice programma per modellare questo sistema, in lega di proteine utilizzando il modello LSM è dato come segue:- Rappresentano una singola proteina come una particella a grana grossa che ha una massa di m.
- Utilizzare un Hookean o una molla neo-Hookean per rappresentare un legame 38,39. Collegando un numero finito di particelle con molle, una lattina make un dominio sub-lega che rappresenta un elemento stabile della lega-proteine. Per rappresentare diversi tipi di obbligazioni in intra-collegamento, utilizzare le costanti molla / rigidità diversa.
- Modellare il sistema, in lega di proteine come un materiale composto di ottusamente-reticolati sotto-leghe. Anche qui diverse rigidità sono stati usati per rappresentare i diversi legami tra interconnessioni dei sub-leghe.
- Modellare la rottura dei legami e del processo di riforma da un modello di Bell 40,41, attraverso le quali legami deboli possono essere riformato, ma forti legami non possono riformare una volta che sono rotti. Quando il sistema è sufficientemente sottolineato (sia sulle obbligazioni intra-e inter-suballoy suballoy), le obbligazioni possono essere rotti e riformati.
- Al fine di studiare gli effetti di deformazione sulla lega proteine quando sono stressati, applicare forze esterne al sistema. Distribuire queste forze anche per ogni particella quando risolvendo l'equazione di forza (leggi di Newton).
- Per modellare le interazionitra la soluzione (ad esempio molecole di acqua) e le proteine, applicano una forza di trascinamento supplementare o forza di attrito per ogni particella.
- Risolvere l'equazione vigore, per ogni particella, con le azioni di ogni forza (la forza della molla dal vincolo, la forza esterna, e la forza di attrito).
- Calcolare e estrarre le posizioni delle particelle proteiche in funzione del tempo.
- Calcola le grandezze fisiche che caratterizzano le leghe proteine dalle posizioni delle particelle.
- Cambiare la rigidità legame nel programma per capire le interazioni tra proteine diverse. (La rigidità media legame viene calcolata dal modulo di Young dei materiali proteici. Modulo di Young di diversi materiali proteina fibrosa può essere ottenuta o da Universal trazione Prova 18, o direttamente da precedenti letterature 2-4,18).
2 Produzione di proteine Solutions lega
Seta selvatica tussah (proteina A) e della seta di gelso domestico (proteina B) sono selezionate come esempio di sistema in lega di proteine. Questo protocollo presenta prima come ottenere la soluzione di seta tussah selvatico (proteina A).
- Tagliare bozzoli di seta tussah selvatici prime o fibre ad un peso di 3 g.
- Misura 3 g di dicarbonato sodio o carbonato di sodio (Nota: Se si utilizza carbonato di sodio, il peso molecolare delle catene proteiche riduce durante il processo di ebollizione 42).
- Riempire un bicchiere di vetro 2 L con acqua distillata (H 2 O). Quindi, posizionare il bicchiere di vetro su un palco caldo, coprire con un foglio di alluminio, e portare ad ebollizione.
- Rimuovere il coperchio foglio di alluminio e aggiungere il dicarbonato sodio misurata lentamente in acqua bollente, permettendo così di sciogliere completamente. (Nota: Il ruolo di dicarbonato di sodio è il "sapone" per pulire le proteine solubili sericina e altre impurità attaccate sulla superficie delle fibre di seta selvaggia Se si utilizza OTH.er fibre proteiche natura, si prega di selezionare agenti chimici corrispondenti secondo la letteratura).
- Aggiungere le fibre proteiche prime (fibre di seta selvatici) in acqua bollente e far bollire per 2-3 ore (Nota:. Il tempo di bollitura ha un impatto fondamentale per il peso molecolare delle catene proteiche 26,43 Uno dovrebbe selezionare un tempo adeguato a seconda alla letteratura o eseguendo esperimenti di controllo 26,43. La temperatura di ebollizione potrebbe anche essere regolata per influenzare il peso molecolare delle catene proteiche 26,43,44).
- Dopo l'ebollizione, rimuovere con attenzione le fibre proteiche con una spatola dalla soluzione e spremere loro di rimuovere l'acqua in eccesso. (ATTENZIONE: Le fibre sono molto caldo!)
- Successivamente, immergere le fibre in un bicchiere 2 L con acqua distillata fredda, e lavare le fibre due volte per 30 minuti ciascuno per rimuovere completamente i residui impuri dalla superficie della fibra. Asciugare le fibre in una cappa per almeno 12 ore.
- Sciogliere 45,784 g di nit calciofrequenza (Ca (NO 3) 2) in un becher di vetro per formare un liquido a 65 ° C per sciogliere le fibre proteiche seta selvatici. (Nota: Se si utilizzano altre fibre proteiche naturali, selezionare la corrispondente solvente per sciogliere le proteine Qui è anche possibile utilizzare una soluzione 9.3 M LiSCN o bromuro di litio, o una soluzione di fosfato 85% per sciogliere le fibre di seta differenti..)
- Combinare le fibre e il solvente in un rapporto di 1 g di fibre in 10 ml di solvente. Lasciare le fibre sciogliere a 95 ° C per 5 a 12 ore. (Nota: Il tempo di dissoluzione dipende dal peso molecolare delle proteine 26,43-45)
- Usando siringhe, iniettare la soluzione selvaggio seta in 12 ml di cassette dialisi (massimo 1.000 MW come la dimensione cutoff) o tubi di dialisi sigillati (massimo 1.000 MW come dimensione cutoff) e Dializzare contro 2 L di acqua distillata. (Nota: L'iniezione è più efficace se mantenendo la soluzione a 35 ° C, altrimenti la viscosità della soluzione proteica aumenterà notevolmente a temperatura ambiente). Cambiare l'acqua distillata per rimuovere frequentemente Ca (NO 3) 2 solventi in soluzione (dopo 30 min, 2 ore, 6 ore, e poi ogni 12 ore per 3 giorni. In totale, ci saranno circa 8 cambi d'acqua).
- Dopo 3 giorni, raccogliere le soluzioni proteiche dalle cassette dialisi o tubi e riporre in 13.000 tubi di giri nominale.
- Centrifugare le soluzioni per 1 ora a 3.500 rpm a 4 ° C 3x per rimuovere i depositi. Dopo ogni corsa centrifuga, tirare rapidamente il surnatante in nuovi tubi. Conservare le soluzioni finali in un frigorifero a 4 ° C.
- Versare 5 ml di soluzione di proteine su un polidimetilsilossano (PDMS) substrato o altro substrato idrofobico piatto e lasciarlo asciugare completamente (solitamente ciò richiede più di 12 ore). Pesare il residuo pellicola proteina solida e calcolare la concentrazione della soluzione finale percentuale in peso (w / v%) = peso misurato (in mg) ÷ 5 (in ml) ÷ 10.
- Raccogliere un'altra fibra proteina naturale selezionato (in questo case, seta di gelso addomesticati è stato utilizzato come la proteina B), e ripetere sopra di processo con un appropriato "sapone" e dissoluzione del solvente, fino ad ottenere la soluzione di acqua proteica finale con concentrazione misurata. [Nota: Se i materiali proteici sono in forma di polvere, utilizzare tubi o membrane porose appropriate per contenere i campioni durante il processo di "saponatura". Se la proteina è già stato purificato, passare direttamente al punto 2.8 per sciogliere la polvere. Se la proteina è già stato purificato ed è solubile in acqua, fare la sua soluzione acquosa con concentrazione desiderata prima e poi passare al punto 2.15 di seguito per rendere le soluzioni di proteine di fusione.]
- Diluire lentamente la soluzione di proteina A (soluzione seta qui selvatico) in acqua distillata a 4 ° C per formare una proteina 1.0 wt% Una soluzione acquosa. Fate lo stesso procedimento per Protein B (seta qui addomesticato).
- Lentamente mescolare la proteina 1% in peso Una soluzione con una soluzione di proteine B a 4 ° C con una pipetta per evitare protein aggregazione durante la miscelazione. (Nota 1: Non utilizzare uno strumento vortice per mescolare le proteine in quanto alcune proteine (ad esempio, sete) formeranno idrogel durante la vibrazione 46,47 Nota 2:. Se possibile, utilizzare ulteriori dispositivi per controllare il rateo di miscelazione e miscelazione making dimensioni Assicurarsi di mescolare il più lentamente possibile, per evitare l'aggregazione. Non pipettare rapidamente la soluzione durante la miscelazione).
- Le soluzioni di fusione finali dovrebbero avere un rapporto di massa specificata o un rapporto molare di Proteina A: Proteine B. In genere, li mescola con rapporto di massa di 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 per ottenere un ampio spettro di soluzioni in lega. Utilizzare soluzioni pura proteina A e la proteina B come controlli. Per una soluzione miscelazione con un rapporto molare di Proteina A: B = proteina R: (100-R). Calcolare il rapporto di volume di miscelazione (in base a una stessa soluzione 1% in peso) da: A Volume: Volume B = R · (MW di A): (100-R) · (MW di B).
- Lanciare immediatamente le soluzioni finali a PDMS substrati per formare film o altro desimateriali tati. (Nota: Non conservare le soluzioni in lega proteine di alta concentrazione per lungo tempo altri aggregati possono formarsi in seguito a causa delle interazioni proteina-proteina in acqua.). Se necessario, diluire le soluzioni miscela con acqua distillata priva di ioni e tenerli in un 4 ° C frigorifero per evitare l'aggregazione proteica aggiuntiva nelle soluzioni.
3 Fabbricazione di materiali in lega proteine Variabile
- Confermare Alloy Prediction da Analisi Termica 3,9,31-35
- Preparare substrati PDMS e pulirli da immersione in acqua distillata.
- Cast le soluzioni miscela proteica con rapporti di miscelazione differenti sui substrati PDMS.
- Asciugare le soluzioni per almeno 12 ore in una cappa chimica con flusso d'aria fino a quando i film si formano (Nota: utilizzare lo stesso volume per diverse soluzioni in modo che lo spessore del film può essere fissata).
- Rimuovere le pellicole in lega di proteine dei substrati PDMS e metterli sui piatti puliti.
- Pesare molti calorimetria a scansione differenziale (DSC) pentole in alluminio e coperchi per lo studio DSC. Abbina le coppie pan e coperchio ad avere un peso totale uguale (peso del pan Peso di coperchio corrisponde ad un peso costante). Ad esempio, ecco un peso totale di coperchio e pan 22,50 mg è stato utilizzato, e otto serie di coperchio e pan combinazioni con questo peso totale sono stati preparati.
- Incapsula 6 mg ogni tipo di proteina essiccata si fonde con pentole DSC in alluminio e chiuderli con i loro coperchi abbinati nel processo 3.1.5. Sigillare un pan vuoto e coppia coperchio da utilizzare con il campione come riferimento in modo che solo la capacità termica dei campioni stessi saranno registrati durante l'analisi termica (Nota: La DSC si confronta la capacità termica di riferimento pan + coperchio contro che di campione + vaschetta + coperchio. Grazie ai pesi uguali, la capacità sfondo calore dalle pentole e coperchi sarà contabilizzata lasciando solo la capacità termica del campione in padella).
- Mettere riferimenti sigillati e padelle campione in uno strumento DSC, conpurgato asciutto flusso di gas di azoto di 50 ml / min, e dotato di un sistema di raffreddamento refrigerato. Prima che le misurazioni del campione, lo strumento DSC deve prima essere calibrato con zaffiro e indio per il flusso di calore e temperatura, rispettivamente.
- Pre-eseguire il DSC ad una velocità di riscaldamento di 2 K / min a 150 ° C e poi mantenere a questa temperatura per 15 minuti per rimuovere le molecole di acqua rimanente nel campione (tipicamente circa 3-10% del peso totale). Raffreddare rapidamente (10 K / min) a 25 ° C.
- Eseguire nuovamente il DSC ad una velocità di riscaldamento di 2 K / min a 300 ° C, o fino a quando il picco di degradazione di miscele di proteine appaiono 34. Registrare le capacità termiche del campione proteina a temperatura diversa durante questo processo. Raffreddare la DSC e cambiare il vecchio campione di un nuovo campione con un diverso rapporto di miscelazione.
- Calcolare e tracciare la capacità termica contro le curve di temperatura per ogni campione miscela proteica utilizzando il software DSC 31-35.
- Giudicate il miscibility di miscele di proteine con il metodo seguente (vedi figura 4 termica e Figura 5) e se le due proteine sono completamente miscibili, che può essere chiamato "leghe di proteine". In caso contrario, il termine "proteina composito" sarebbe un nome adatto in base al polimero teorie descrittive 48,49):
- Le singole proteine A e B devono avere individuo singolo temperatura di transizione vetro, T g (A) e T g (B) (Vedere le curve verde e blu in figura 5) 3,48;
- Questo singolo temperatura di transizione vetrosa è normalmente intermedio tra quelli dei due singoli componenti proteiche, T g (A) e T g (B) (vedi Figura 5) 3,48;
- Separazione di fase non miscibile miscele si ottiene se entrambi g T (A) e T g (B) apparvero loro posizioni originali (Figura 5), e con T g ogni passoaltezza in proporzione alla composizione, le due proteine sono completamente immiscibile 3,48.
- Semi-miscibile composito tipo di miscela avrà una molto ampia di transizione vetrosa, o può ancora avere due transizioni vetrose, ma ciascuno è migrata più vicini tra loro rispetto alle componenti proteiche puri, T g (A) e T g (B) ( vedi Figura 5). In questo caso, ci potrebbe essere in fase di micro-strutture eterogenee formate tra le due componenti proteiche, e la composizione possono variare da un luogo all'altro.
- Se (3.1.11.1), è il caso mostrato in DSC, e può essere confermato che la proteina AB è un sistema in lega, per poi passare a fabbricare materiali in lega di proteine.
- Fabbricazione di materiali ottici da Leghe Proteine
- Produrre (in laboratorio di fabbricazione) o acquistare una superficie topografica progettata per la fusione. In questo esempio specifico, è stato utilizzato un vetro con quattro modelli di diffrazione (figura 4Ottica).
- Posizionare il vetro con pattern di diffrazione in un piatto, e assicurarsi che la superficie modellata si trova di fronte verso l'alto.
- Stendere soluzione PDMS in modo uniforme sulla superficie di vetro, e coprire completamente i modelli di superficie (la soluzione PDMS è fatta da invasatura e la soluzione di catalizzatore in un 9: rapporto di miscelazione 1 secondo le istruzioni all'utente 23,44).
- Porre la capsula fusione in un forno a 65 ° C per almeno 2 ore, mentre su una superficie piana. La soluzione PDMS deve asciugare in un solido substrato durante questo processo.
- Rimuovere substrato PDMS dal vetro. I pattern di diffrazione dovrebbero ora essere trasferiti alla superficie PDMS.
- Punch out gli stampi PDMS con i modelli di diffrazione con un foro adatto pugno.
- Goccia soluzioni lega proteine sulle superfici PDMS con modelli di diffrazione, e li asciugare per almeno 12 ore per ottenere film con pattern di diffrazione.
- Per ottenere materiali in lega di proteine insolubili, posizionare l'intero set di drfilm y, compresi gli stampi PDMS in un forno sotto vuoto C 60 ° (25 kPa) con un piatto di acqua sul fondo della camera. Pompare fuori l'aria nel forno, e lasciare che i vapori d'acqua campioni ricottura per almeno 2 ore. (Questo processo è chiamato a temperatura controllata di vapore acqueo ricottura 45. Confrontando con il metodo del metanolo ampiamente utilizzato, può generare simile contenuto di beta-sheet nei materiali di seta 45). Rilasciare il vuoto e rimuovere la pellicola insolubile acqua dal substrato PDMS con pinze. Per questo esempio, vengono utilizzate leghe di seta di seta-addomesticati selvatici.
- Verificare la qualità del pattern di diffrazione su film confrontandoli con i modelli originali sul vetro (ad esempio, raccogliere le immagini SEM per i dettagli micro-scala; raccogliere modelli di diffrazione laser per la qualità generale del modello).
- Fabbricazione di circuiti elettrici sulle proteine Materiali Leghe
- Per realizzare un modello di circuito elettrico sul substrato di vetro, prima CLEAna vetrino utilizzando alcuni sgrassaggio solvente come Alconox in ultrasuoni per 5 minuti, seguiti da 5 minuti in acetone, seguito da 5 minuti in metanolo. Il metanolo viene usato scorso dal momento che evapora più lentamente di acetone in modo da può essere soffiata fuori dal substrato piuttosto che di essiccazione e residui di partenza.
- Soffiare il vetrino a secco utilizzando gas di azoto secco che viene generato dal boil-off da una 180 L azoto liquido dewar.
- Introdurre i materiali del substrato nella camera di deposizione. (Queste linee guida sono per un sistema di sputtering, ma potrebbero essere usate altre tecniche di deposizione.) Se la camera è progettato con una loadlock, il vuoto nella camera di deposizione non è significativamente influenzato. Evacuare l'loadlock ad una pressione di 30 mTorr.
- Aprire la saracinesca tra il loadlock e la camera di deposizione principale e introdurre il substrato nella camera.
- Accendere il gas Ar e il regolatore di pressione e controllare la pressione al Depositio desideratopressione n. Pressioni più elevate danno energia atomizzate inferiori atomi di metallo e di film più uniformi, mentre pressioni più basse migliore resa aderendo film più veloce depositato. La gamma di pressioni è generalmente compresa tra 3 e 60 mTorr mTorr, con 20 mTorr funziona bene.
- I metalli vengono poi proiettate su un otturatore che protegge il supporto da rivestimento utilizzando una potenza RF di 100 W. è necessaria una circuito di sintonia per dirigere la potenza RF al bersaglio metallico. Alimentazione CC può essere usato al posto di RF per bersagli metallici. Al fine di rimuovere gli strati di ossido e contaminanti dalla porta, pre-sputter per alcuni minuti.
- Aprire l'otturatore e polverizzazione catodica del metallo sul substrato. La velocità di deposizione per la configurazione descritta è di circa 10 nm al min. Questo tasso dipende dalla distanza, la pressione, la forza del magnete che lavorano nel catodo magnetron, lo spessore target e il metallo atomizzate. Regolare il tempo di deposizione per ottenere lo spessore desiderato.
- Rimuovere il vetrino rivestito dalcamera.
- Utilizzando un filatore, girare un rivestimento di resina fotosensibile sulla superficie della pellicola. Molti resist possono essere usate. Per questo caso, è stato utilizzato photoresist positivo.
- Dopo il resist è filata sulla pellicola, cuocere morbido a 90 ° C per 5 minuti per asciugare il resist.
- Inserire una maschera contatto con un'immagine del dispositivo saldamente contro la resistenza. Una sorgente di luce UV è utilizzata per esporre il photoresist. L'esposizione è 10 sec ma varia a seconda della forza della sorgente luminosa e il resist utilizzato.
- Posizionare la pellicola nella sviluppatore photoresist fino a visualizzare l'immagine proiettata. I lavaggi sviluppatore via il resistono che è stato esposto alla luce UV che causano la rottura dei legami polimerici. Subito dopo appare l'immagine, immergere la pellicola in acqua deionizzata per fermare lo sviluppatore di lavorare sul photoresist non esposto.
- Soffiare i film secco con azoto secco.
- Posizionare i film in stufa a 120 ° C per 15 min a "duro cuocere" la fotoresistere.
- Dopo i film raffreddare, metterli in una soluzione di attacco finché il metallo non protetto dal fotoresist solleva. Immergere in acqua per fermare l'attacco.
- Risciacquare con acetone per rimuovere il photoresist indurito.
- Risciacquare con metanolo e asciugare con azoto secco.
- Una volta che i vetri rivestiti sono pronti, cadere diverse soluzioni in lega proteine sulle superfici di vetro, e asciugare per almeno 12 ore per ottenere film di lega proteine sui bicchieri. (Si suggerisce di concentrare prima le soluzioni in lega a 5% in peso per ottenere film di spessore in lega di proteine.)
- A causa delle interazioni idrofobiche-idrofila, i film metallici sottili saranno trasferiti dalle superfici di vetro alla lega proteina allegata pellicola superfici 51. Staccare le pellicole in lega proteine con i modelli metallici sottili dei substrati di vetro con una pinza.
- Per ottenere materiali in lega di proteine insolubili, posizionare i film asciutto in C sotto vuoto forno a 60 ° (25 kPa) con awpiatto ater sul fondo della camera. Pompare fuori l'aria nel forno, e lasciare che i vapori d'acqua campioni ricottura per almeno 2 ore. Rilasciare il vuoto e rimuovere la pellicola insolubile acqua dal substrato con pinze.
- Testare le qualità elettriche di modelli metallici su film in lega di proteine come la resistenza elettrica e confrontarle con i modelli originali sul vetro.
- Fabbricazione di materiali farmaceutici da Leghe Proteine
- Per realizzare un film in lega proteine con composti farmaceutici, prima di preparare un substrato PDMS come descritto al punto 3.2. Pulire il substrato PDMS formata da acqua distillata.
- Disciogliere o disperdere i composti farmaceutici in una soluzione acquosa. Utilizzare ultrasuoni o agitare per miscelare omogeneamente i composti farmaceutici con l'acqua. Se i composti non sono solubili in acqua, disperdere le polveri con una distribuzione omogenea in acqua distillata priva di ioni.
- Calcolare il rapporto di massa desideratodei composti alle leghe di proteine per: volume della soluzione del composto x percentuale in peso di soluzione composta: volume della lega di proteine soluzione x percentuale in peso di soluzione di composto (qui la soluzione lega 1% in peso è stato usato). Selezionare un rapporto per ottenere un film con densità composto desiderato nel film lega proteine.
- Lentamente mescolare la soluzione composto con la soluzione in lega proteina seguendo le stesse istruzioni della sezione 2 di processo 2.16. (Nota: per evitare la gelificazione, non ultrasonicate o agitare la soluzione durante la miscelazione).
- Versare un volume calcolato di composto sul substrato PDMS e asciugare almeno 12 ore in una cappa chimica per un film di ottenere lega di proteina contenente un rapporto progettato di composti farmaceutici.
- Fisicamente reticolato il film segue la stessa istruzione nella sezione 3.2 di processo 3.2.8. Un esempio di film in lega con farmaci insolubili modello di bassa densità (LD) o un (HD) ad alta densità potrebbe essere visto in Figura 4 Chimica.
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Risultati
Interazioni proteina-proteina tipica (ad esempio, tra la proteina A e la proteina B) potrebbero contenere carica-carica (elettrostatici) attrazioni, idrogeno formazione di legami, interazioni idrofobiche-idrofila, così come dipolo, solventi, contatore di ioni, e gli effetti entropici tra la specifica domini delle due proteine (Figura 2) 3. Quindi, fondamentalmente, siamo in grado di prevedere gli effetti di queste interazioni di simulazioni computazionali.
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Discussione
Una delle procedure più critici nella produzione del sistema proteina "lega" è quello di verificare la miscibilità delle proteine miscelati. Altrimenti, è solo una miscela di proteine o di proteine sistema immiscibile composito senza proprietà stabili e sintonizzabili. Un metodo di analisi termica sperimentale può essere utilizzato per questo scopo e per confermare le proprietà della lega. Interazioni proteina-proteina possono essere visualizzate in base al modello di Flory-Huggins reticolo 48...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Rowan University per il supporto di questa ricerca. XH grazie anche Dr. David L. Kaplan presso la Tufts University e il NIH P41 Tissue Engineering Resource Center (TERC) per i precedenti corsi di formazione tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Calorimetri a scansione differenziale Q100 (DSC) | TA Instruments, New Castle, DE, USA | N/A | È possibile utilizzare qualsiasi tipo di DSC con un software per calcolare la capacità termica. |
| Sistema di sputtering a vuoto SS30T | TM Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA | N/A | Con parti costruite su misura; è possibile utilizzare qualsiasi tipo di sistema di sputtering per rivestire. |
| VWR 1415M Forno a vuoto | VWR International, Bridgeport, NJ, USA | N/A | È possibile utilizzare qualsiasi tipo di forno a vuoto per reticolare fisicamente i campioni. |
Riferimenti
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