Picoinjection di Microfluidic Gocce senza elettrodi in metallo

Sommario

Abbiamo sviluppato una tecnica per picoinjecting gocce microfluidici che non richiedono elettrodi metallici. Come tale, dispositivi che incorporano la nostra tecnica sono più semplici da fabbricare e da usare.

Abstract

Metodi esistenti per picoinjecting reagenti in gocce microfluidica richiedono elettrodi metallici integrati nel chip microfluidica. L'integrazione di questi elettrodi aggiunge passaggi ingombranti e soggetti a errori del processo di fabbricazione del dispositivo. Abbiamo sviluppato una tecnica che elimina le necessità di elettrodi metallici durante picoinjection. Invece, utilizza il fluido di iniezione stesso come un elettrodo, poiché la maggior parte reagenti biologici contengono elettroliti disciolti e sono conduttivi. Eliminando gli elettrodi, riduciamo dispositivo tempo di fabbricazione e la complessità, e rendere i dispositivi più robusti. Inoltre, con il nostro approccio, il volume di iniezione dipende dalla tensione applicata alla soluzione picoinjection; questo ci permette di regolare rapidamente il volume iniettato modulando la tensione applicata. Abbiamo dimostrato che la nostra tecnica è compatibile con i reagenti contenenti composti biologici comuni, tra tamponi, enzimi e acidi nucleici.

Introduzione

In microfluidica basata gocciolina-, micron scala goccioline acquose sono usati come "provette" per reazioni biologiche. Il vantaggio di eseguire reazioni nelle minuscole goccioline è che ogni goccia utilizza solo qualche pl di reagente e, con microfluidica, le gocce può essere formato e trattati a tassi kilohertz ^1. La combinazione di queste proprietà consentono milioni di reazioni con cellule singole, molecole di acido nucleico, o composti da eseguire in pochi minuti con pl di materiale totale.

Per utilizzare gocce per applicazioni come queste, sono necessarie tecniche per l'aggiunta di volumi controllati di reagenti per le gocce; tali operazioni sono analoghi a pipettare nelle provette. Un metodo per risolvere questo problema consiste electrocoalescence, in cui una goccia di reagente è fusa con la goccia di destinazione applicando un campo elettrico. Il campo elettrico interrompe la disposizione delle molecole di tensioattivo sulle interfacce delle gocce, inducing una instabilità a film sottile e innescando coalescenza in emulsioni che sono altrimenti stabili ^2. Fusione elettricamente indotta viene sfruttata anche nel design del picoinjector, un dispositivo che inietta reagenti in gocce mentre fluiscono passato un canale in pressione ^3. Per applicare il campo elettrico, dispositivi picoinjector utilizzano elettrodi metallici, ma l'integrazione di elettrodi metallici in chip microfluidici è spesso un processo complesso e soggetto ad errori come i fili liquido-saldatura sono facilmente compromesse da bolle d'aria o polvere e altri detriti nel canale , così come fratture da stress o di flessione durante l'installazione del dispositivo.

Presentiamo qui un metodo per eseguire picoinjection senza l'uso di elettrodi metallici, rendendo la fabbricazione più semplice e più robusto. Per attivare picoinjection, noi invece utilizziamo il fluido di iniezione stesso come un elettrodo, poiché la maggior parte reagenti biologici contengono elettroliti disciolti e sono conduttivi. Aggiungiamo anche un "Faraday Moat "per schermare regioni sensibili del dispositivo e di agire come un terreno universale (Figura 1). Il fossato isola elettricamente le goccioline a monte del sito picoinjection fornendo un terreno, impedendo volute gocciolina fusione. Un ulteriore vantaggio della nostra tecnica è che l' volume iniettato nelle gocce dipende dalla grandezza della tensione applicata, consente di essere regolato sintonizzando il segnale applicato.

Noi costruiamo i nostri dispositivi in poli (dimetilsiloxano) (PDMS), utilizzando tecniche di fotolitografia morbide ^4,5. Il nostro approccio è compatibile con i dispositivi fabbricati in altri materiali, come resine, plastiche e resine epossidiche. I canali hanno altezze e larghezze di 30 micron, che sono ottimali per lavorare con goccioline 50 micron di diametro (65 pl). Introduciamo reagenti tramite tubazione in polietilene (diametro interno / esterno 0.3/1.09 mm) inserito nelle porte create durante la fabbricazione di dispositivi con 0,50 millimetri punzoni di biopsia, simili ai metodi described in precedenza ^5. La composizione esatta del fluido di iniezione dipende dall'applicazione specifica. Il fluido bisogno solo contiene elettroliti disciolti in concentrazioni sufficienti per produrre conduttività sufficiente per il segnale elettrico da trasmettere al picoinjector. In prove al banco, abbiamo trovato che le concentrazioni ioniche superiori a 10 mm dovrebbero essere sufficienti ^6, se questo valore e conducibilità del fluido dipendono dalle dimensioni dei dispositivi specifici e ampiezza della tensione applicata.

Protocollo

1. Progettazione di dispositivi Dimensioni e topologie Basato su Experimental esigenze, utilizzando Computer Aided Design (CAD) Software

Nota: Selezione diametri dei canali emulsione inferiori a quelle delle goccioline sferiche. Questo costringe le goccioline in una forma cilindrica o "salsiccia" e permette picoinjection più efficace. Per i nostri scopi, abbiamo progettato di 30 x 30 micron canali di goccioline che erano 50 micron di diametro.

1. Sito picoinjection modello (s) dopo quelli descritti da Abate et al. ³ con l'eccezione che i canali per gli elettrodi metallici vengono rimossi, come sono inutili.
2. Aggiungere canali per servire come Faraday Moat (Figura 1) che corrono tra sito picoinjection (s) e l'emulsione monte tale che schermano le goccioline dal campo elettrico.
   Nota: Questo impedisce fusione non volute.

2. Dispositivi fabbricare Uso molle FotolitoTecniche radiografico

1. Generare una maschera di trasparenza fotolitografia in base al file CAD utilizzando i servizi commerciali esistenti.
2. Con la fotomaschera, curare photoresist su wafer di silicio per produrre un GSD, come descritto in precedenza ^4.
3. Pour PDMS miscelato con il catalizzatore (11:01 ratio) il master del dispositivo contenuto in una capsula di Petri 5 centimetri di polistirolo.
4. Posizionare il maestro con PDMS in un essiccatore a vuoto per circa 15 minuti per eliminare eventuali bolle d'aria.
5. Curare il dispositivo PDMS ponendolo in un forno a 95 ° C per 1 ora. In alternativa, il PDMS curerà a temperatura ambiente dopo 24 ore.
6. Rimuovere il dispositivo tagliando lungo il perimetro con una lama chirurgica e peeling accuratamente il dispositivo dal master.
7. Punch di ingresso e uscita fori nelle PDMS utilizzando una biopsia di 0,5 mm.
8. Fissare il dispositivo su un vetrino da microscopio vetro con un bonder plasma ^4.

3. Preparare una pressione d'ariaControllo pompa per pressurizzare un serbatoio contenente il fluido

1. Modificare le prestazioni della pompa in modo tale che le uscite d'aria in pressione attraverso una lunghezza di 2,7 millimetri tubo in polietilene diametro interno.
2. Costruirlo tale che il tubo termina in una siringa luer-lock montando il lume sopra l'ugello sul retro del luer-lock.
3. Sigillare riempiendo lo spazio tra i fili luer-lock e il tubo con resina epossidica.
4. Attaccare un ago 27.5 G.

4. Preparare una Monodisperse emulsione acquosa di goccioline (acqua in olio) sospesi in un inerte Fluorinated Carrier olio con 2% (peso / peso) disciolto biocompatibili tensioattivo ⁷

I reagenti specifici contenuti in queste goccioline dipendono dall'applicazione

1. In preparazione per la reiniezione, caricare l'emulsione in una siringa da 1 ml con un ago G 27.5.
2. Fissare la siringa in una pompa a siringa e orientare verticalmente la pompa (ago verso l'alto).
   Appunto: Questo orientamento provoca le goccioline di confezionare in un livello sopra il olio vettore. Quando si avvia la pompa, le goccioline saranno spinti dalla siringa a frazione ad alto volume lo strato di olio sotto di loro.

5. Preparare Reagenti per Introduzione alla Microfluidic Chip

1. Punch tre fori di 0,5 millimetri nel tappo di un tubo da centrifuga da 15 ml (qualsiasi contenitore con tappo a vite sarà sufficiente) con una biopsia, ago, o trapano.
2. Inserire un filo elettrodo 0,5 mm di diametro e lunghezza cm ~ 20 di PE-2 tubo attraverso due dei fori in modo che raggiungano il fondo della provetta.
3. Nella rimanente foro, infilare un ~ 2,5 cm lunghezza cm ~ 20 di tubo PE tale che riposerà sopra del livello del liquido.
4. Sigillare eventuali lacune sulla parte superiore del tappo con resina epossidica UV-cured.
5. Riempire il tubo con il fluido picoinjection e vite sul tappo.
6. Collegare l'uscita dalla pompa di aria di controllo della pressione per la minore lunghezza dei tubi da insertozione l'ago nel lume. L'ago dovrebbe adattarsi comodamente.
7. Riempire una siringa da 1 ml con 1 M NaCl per servire come Faraday fossato.
8. Collegare un ago G 27.5 e fissare la siringa in una pompa a siringa.
9. Riempire un'altra siringa da 1 ml con olio vettore / distanziatore, collegare un ago G 27.5, e fissarlo in una pompa a siringa.

6. Preparare il dispositivo Microfluidic per Picoinjection

1. Collegare il tubo di uscita (lunghezza più lunga) dal contenitore di fluido di iniezione alla porta di entrata del fluido picoinjection sul chip microfluidica.
2. Collegare la siringa contenente il 1 M NaCl alla porta di ingresso per il Faraday fossato sul chip microfluidica con un pezzo di tubo in PE.
3. Collegare la siringa contenente il vettore di petrolio alla porta di ingresso del chip microfluidica con un pezzo di tubo in PE.
4. Inserire tubo PE nella porta di uscita dell'emulsione sul chip microfluidica. Il tubo deve terminare in un vaso di raccolta emulsione, némalmente una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
5. Inserire tubo PE nella porta di uscita per il Faraday fossato sul chip microfluidica. Il tubo deve terminare in un non-conduttore e il contenitore isolato elettricamente per evitare un corto circuito.
6. Collegare l'uscita dell'amplificatore ad alta tensione (HV) tramite pinze alla elettrodo metallico immerso nel liquido picoinjection.
7. Collegare l'elettrodo di massa dell'amplificatore HV via coccodrillo al metallo dell'ago della siringa contenente 1 M NaCl.

7. Infondere reagenti in Microfluidic Chip

1. Introdurre il 1 M NaCl (Faraday Moat) al dispositivo a una velocità di 100 pl / h.
2. Introdurre l'emulsione goccia e olio vettore a tassi adeguati per le dimensioni del dispositivo. Per il nostro dispositivo di demo, vi presentiamo le gocce e l'olio a 200 e 400 ml / h, rispettivamente. Le portate dovrebbero consentire le goccioline di superare l'picoinjector ad intervalli regolari separatida un gap di olio vettore.
3. Regolare la pressione applicata al fluido picoinjection tale che la pressione del fluido in corrispondenza dell'orifizio picoinjection è in equilibrio meccanico con il canale gocciolina.
   Nota: A questa pressione (pressione di Laplace), il fluido di iniezione deve sporgere nel canale gocciolina senza erba off e formando i propri gocce (Figura 2). A queste portate sopra descritte, si applica una pressione di ~ 13 psi al fluido di iniezione a raggiungere l'equilibrio nel sito di iniezione.

8. Inizia Picoinjection

1. Come goccioline passano il foro di iniezione, applicare un 0-10 V, 10 kHz, segnale AC amplificato 1.000 x nel HV-amplificatore (Figura 3).
2. Modulare il volume di iniezione modificando l'ampiezza della tensione applicata.
   Nota: Tensioni superiori dovrebbero consentire più fluido per essere introdotto per le goccioline. Nel nostro test, osserviamo iniezione stabile e coerente a tensioni esseretra 100 e 3000 V utilizzando soluzioni di iniezione di NaCl che vanno 10-500 mM (Figura 4).

Risultati

Immagini microscopiche portati al sito picoinjection mostra che l'elettrificazione del fluido picoinjection è sufficiente a provocare l'iniezione (Figura 2). Il volume iniettato può essere controllata modulando l'ampiezza della tensione applicata, con tensioni superiori che consentono elevati volumi di iniezione. Noi tracciamo il volume di iniezione rispetto l'ampiezza della tensione applicata per tre molarità rappresentativi di liquido iniettabile in (Figura 3). Per dim...

Discussione

Il rapporto tra volume di iniezione e la tensione applicata dipende da molti fattori tra cui le dimensioni del dispositivo, la lunghezza del tubo che trasporta il fluido picoinjection al dispositivo, molarità di fluido picoinjection, e la velocità delle gocce che passano essi iniettore. Per questo motivo si consiglia che il rapporto volume / Tensione essere caratterizzato prima di ogni corsa di picoinjection misurando volumi di iniezione ai bordi dei campi di lavoro di tensione e molarità. Inoltre, a tensioni superiori ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringhe Luer-Lok™ da 1 ml BD	Medical	309628
LocTite Adesivo a polimerizzazione UV	Henkel	35241
Tubo PE-2	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
Provette	da centrifuga da 1,5 mlEppendorf	22363531
BD Falcon Tubo da 15 ml	BD Biosciences	352097
Pompa di controllo della pressione dell'aria	Control Air Inc.		Ne consigliamo uno sotto il controllo del DAQ e del software di controllo
Pompe a siringa	New Era		Deve essere in grado di contenere siringhe da 1 ml e fluire a velocità fino a 100 μ l/hr
HV-amplfier			Deve essere in grado di amplificare 1.000x i segnali tra 0,01 e 10 V
Bonder/pulitore al plasma	Harrick Plasma
3" wafer di silicio	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 con agente indurente dovrebbe essere incluso
SU-8 fotoresist	MicroChem		La viscosità dipende dalle dimensioni del dispositivo