Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Sommario

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Abstract

Il prosencefalo sensoriale è composto da tipi di cellule strettamente connesse, le cui proprietà funzionali devono ancora essere completamente chiarite. La comprensione delle interazioni di questi circuiti del prosencefalo è stata recentemente aiutata dallo sviluppo di metodi optogenetici per la modulazione mediata dalla luce dell'attività neuronale. Qui, descriviamo un protocollo per esaminare l'organizzazione funzionale dei circuiti del proencefalo in vitro utilizzando la fotostimolazione a scansione laser della canalrodopsina, espressa optogeneticamente tramite trasfezione mediata da virus. Questo approccio sfrutta anche l'utilità della ricombinazione cre-lox in topi transgenici per indirizzare l'espressione in specifici tipi di cellule neuronali. Dopo la trasfezione, i neuroni vengono registrati fisiologicamente in preparazioni di fette utilizzando un patch clamp a cellula intera per misurare le loro risposte evocate alla fotostimolazione a scansione laser delle fibre che esprimono la canalrodopsina. Questo approccio consente una valutazione della topografia funzionale e delle proprietà sinaptiche. I correlati morfologici possono essere ottenuti mediante imaging dell'espressione neuroanatomica delle fibre che esprimono la canalrodopsina utilizzando la microscopia confocale della fetta viva o del tessuto post-fissato. Questi metodi consentono indagini funzionali dei circuiti del proencefalo che si espandono su approcci più convenzionali.

Introduzione

L'elaborato circuito del proencefalo dei mammiferi pone una sfida sperimentale per sezionare i ruoli funzionali dei suoi componenti intrecciati. Districare queste relazioni è stato recentemente aiutato dallo sviluppo di metodi optogenetici per eccitare e inibire specificamente le popolazioni neuronali e le loro proiezioni^1-3. Questi approcci si avvalgono dell'espressione geneticamente controllata dei canali di membrana sensibili alla luce^4-6. Di particolare nota, la canalrodopsina, un canale ionico luce-dipendente, depolarizza le membrane neuronali in seguito alla stimolazione ottica, portando all'eccitazione del neurone che esprime e alle sue proiezioni^4,7. Al contrario, l'alorodopina, una pompa per cloruro luce-dipendente, iperpolarizza la membrana, inibendo così la proiezione mirata^6,8,9. Sono state ingegnerizzate diverse varianti di queste opsine, sono stati prodotti vettori multipli per la trasfezione e l'espressione in popolazioni neuronali di interesse e sono state ingegnerizzate linee di topi transgenici che esprimono costitutivamente queste opsine o che consentono il controllo mediato da cre-lox della loro espressione^1,2,10,11.

L'utilità di questi metodi e materiali optogenetici ha rivoluzionato le moderne neuroscienze sperimentali, consentendo la dissezione del ruolo di specifici circuiti neurali nella fisiologia e nel comportamento dell'organismo^12-15. In particolare, questi metodi possono essere applicati in modo potente alla dissezione funzionale dei circuiti cerebrali utilizzando preparazioni in vitro di fette^16-20. In questo contesto, uno dei principali vantaggi di questo metodo è la capacità di caratterizzare la fisiologia di proiezioni a lungo raggio che sono difficili, se non impossibili, da conservare in una fetta spessa, come le connessioni commissurali tra emisferi corticali cerebrali¹⁶. Inoltre, questa tecnologia consente manipolazioni non possibili con altri metodi, come l'inibizione selettiva delle proiezioni con precisione temporale fine utilizzando l'alodopsina^6,8,9. Inoltre, l'espressione specifica del tipo cellulare di queste opsine consente di stimolare o inibire selettivamente componenti isolati in un circuito neurale^1,2,11,15,21. In quanto tali, questi nuovi strumenti optogenetici consentono l'analisi senza precedenti dei contributi neuronali alla fisiologia e al comportamento.

Qui, descriviamo un protocollo per esprimere la canalrodopsina nel cervello del topo utilizzando vettori virali adeno-associati (AAV)^1,2. La trasfezione specifica di popolazioni neuronali bersaglio può essere realizzata utilizzando questo protocollo, con la scelta appropriata di costrutti promotori o topi transgenici che esprimono Cre-ricombinasi nei neuroni bersaglio di interesse e un costrutto virale 'floxed'^1,11,15,21 (Figura 1). A titolo di esempio, esaminiamo le proiezioni corticocorticali tra la corteccia visiva primaria (V1) e la corteccia visiva secondaria (V2) e studiamo anche la proiezione corticotalamica di livello 6 dalla corteccia somatosensoriale primaria (S1) al nucleo mediale ventroposteriore (VPm). Combiniamo questa espressione specifica con la fotostimolazione a scansione laser in vitro per valutare la fisiologia sinaptica e la topografia funzionale. La configurazione qui presentata consente il posizionamento spaziale preciso e il controllo dei loci di fotostimolazione. Infine, descriviamo la visualizzazione dei pattern di espressione utilizzando la microscopia confocale.

Protocollo

1. Chirurgia e iniezioni

1. Anestetizzare i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale (si consiglia un ago da 22-25 G) di ketamina (100-120 mg/kg) e xilazina (7,5-16 mg/kg).
   1. Valutare la sedazione utilizzando forti pizzicotti delle dita dei piedi fino a quando non vengono suscitate risposte. Per tutte le procedure sugli animali descritte, modificare per seguire le linee guida IACUC locali, se necessario.
2. Metti i topi sedati in un dispositivo stereotassico fissando la testa e le orecchie nei rispettivi supporti.
   1. Lubrificare gli occhi prima di inserire l'animale nel dispositivo stereotassico con un unguento oftalmico sterile.
3. Radere il cuoio capelluto con un rasoio e sterilizzare la zona con tamponi Betadine.
4. Usando un bisturi, praticare un'incisione sulla linea mediana e riflettere la pelle e i muscoli sottostanti sopra l'area da iniettare.
5. Ruota la lama di un bisturi come un trapano per eseguire una craniotomia sopra la regione da esporre. In alternativa, utilizzare una piccola punta da trapano attaccata a un Dremel per eseguire la craniotomia.
   1. Per eseguire la craniotomia, posizionare la lama del bisturi o la punta del trapano sulla superficie del cranio e ruotare lentamente fino a quando non è stato scavato abbastanza osso per rivelare la pia madre sottostante.
   2. Una volta effettuato lo scavo iniziale, allargare la craniotomia utilizzando una pinza fine per rimuovere con cura l'osso dai bordi.
6. Riempire una siringa da 1 μl con la soluzione virale da iniettare (UNC Vector Core).
   1. Per migliorare l'efficacia della trasfezione, preparare una soluzione virale con 4 μg/ml di polibrene.
7. Abbassare l'ago nell'area da iniettare e infondere a pressione 200 nl di soluzione contenente virus con una pompa a siringa.
   1. Lasciare riposare la siringa per 10 minuti prima di estrarre l'ago.
8. Suturare la pelle con nylon monofilamento non assorbibile e coprire l'incisione con una pomata antibiotica.
   1. I punti di sutura devono essere rimossi dopo 7-10 giorni.
9. Iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per l'analgesia post-operatoria.
10. Lasciare che gli animali si riprendano dopo l'intervento per 14-21 giorni per consentire un'adeguata espressione del canale della rodopsina.

2. Preparazione della fetta

1. Dopo il periodo di convalescenza, anestetizzare profondamente l'animale con anestesia isoflurana, come verificato dall'assenza di riflesso di ritiro quando la zampa posteriore e/o le dita dei piedi sono saldamente pizzicate.
2. Sezionare il cervello mediante decapitazione seguita da tagli sulla linea mediana e frontali al cranio.
3. Staccare il cranio dalla linea mediana per esporre il cervello.
4. Rimuovere con cautela il cervello usando una spatola a paletta fine per separare i nervi cranici dalla base del cervello.
5. Posizionare rapidamente il cervello sezionato in un piccolo becher da 100 ml contenente liquido cerebrospinale artificiale freddo e ghiacciato (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 25 glucosio).
6. Rimuovere il cervello dall'ACSF e posizionarlo su un vetrino da microscopio coperto con carta da filtro preinumidita con ACSF.
7. Fai un taglio di blocco del cervello nell'orientamento desiderato usando una lama di rasoio pulita.
8. Fissare la superficie bloccata del cervello al palco di taglio utilizzando la colla adesiva istantanea.
9. Trasferire la fase in una camera di taglio a vibratomo (conservata in congelatore fino al momento del taglio).
10. Versare l'ACSF ghiacciato nella camera di taglio.
11. Affettare sezioni cerebrali a 400-500 μm utilizzando un'affettatrice vibrante.
12. Trasferire le fette di cervello in una camera di contenimento contenente ACSF ossigenato e incubare a 30 °C per almeno 1 ora prima dell'esperimento.

3. Registrazione fisiologica

1. Dopo il periodo di incubazione, trasferire una fetta in una camera di registrazione su un tavolino da microscopio modificato.
2. Fissare la fetta nella vasca da bagno durante l'esperimento utilizzando alcuni fili di filamenti di nylon attaccati a un supporto per fette di filo di platino.
3. Perfondere costantemente la fetta con ACSF.
4. Tirare le pipette di registrazione a una resistenza del puntale di 3-6 MΩ quando riempite con una soluzione intracellulare contenente quanto segue (in mM): 127 K-gluconato, 3 KCl, 1 MgCl₂, 0,07 CaCl₂, 10 HEPES, 2 Na_2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. La soluzione intracellulare deve avere un pH 7,3, aggiustato con KOH o acido gluconico e l'osmolalità di 280-290 mOsm.
5. Utilizzando una configurazione standard di registrazione di cellule intere visualizzate, posizionare la pipetta di registrazione vicino al neurone da registrare applicando una pressione positiva^22,23.
6. Rilasciare la pressione positiva durante l'applicazione dell'aspirazione per formare la guarnizione Gigaohm.
7. Applicare una breve aspirazione per rompere la membrana e formare la registrazione della configurazione dell'intera cella.
8. Registra le risposte dei neuroni in tensione o in pinza amperometrica.

4. Fotostimolazione a scansione laser

1. Avviare il software e l'hardware di acquisizione dati, descritti nei rapporti precedenti^23-29.
   Nota: Abbiamo utilizzato sia i programmi di acquisizione Tidelwave²⁵ che, più recentemente, Ephus²⁶, scritti in Matlab e sviluppati dal laboratorio di Karel Svboda presso Janelia Farms³⁰. Per una descrizione completa della fotostimolazione a scansione laser in Ephus, vedi Suter et al.²⁶ e la guida passo passo³⁰.
   Nota: la configurazione descritta in questo articolo deriva da quella descritta da Shepherd (2012)²³. Il raggio laser viene guidato tramite un sistema di specchi a fascio aperto fino alla porta superiore del microscopio attraverso la lente dell'obiettivo sulla fetta (Figura 2).
2. Deviare una piccola parte del laser su un fotodiodo con un vetrino coprioggetti per microscopio posizionato nel percorso del laser e utilizzare la corrente in uscita da questo fotodiodo per monitorare l'intensità del laser durante gli esperimenti.
   1. Calibrare l'uscita di corrente del fotodiodo registrata nel software in base alla potenza laser misurata sul piano focale posteriore dell'obiettivo utilizzando un misuratore di potenza durante la configurazione dell'apparecchiatura²³.
3. Controlla la potenza del laser ruotando una rotella a densità neutra variabile. La potenza del laser utilizzata variava tra 25 e 70 mW (sul piano focale posteriore) nei nostri esperimenti.
4. Impostare la lunghezza e la temporizzazione della stimolazione laser modificando i parametri dell'impulso per il laser e l'otturatore. La stimolazione laser è in genere lunga 2 msec.
5. Cattura l'immagine della regione da stimolare utilizzando la funzione "Grab Video".
6. Selezionare la griglia di stimolazione in base alle dimensioni desiderate. In genere utilizziamo un array di stimolazione 16 x 16 con una spaziatura di 80 μm tra righe e colonne adiacenti.
7. Sovrapporre la griglia di mappatura con l'immagine acquisita e regolare l'offset x, y e gradi in base alla posizione e all'orientamento desiderati.
8. Attiva la funzione 'Mappa' per avviare la stimolazione e l'acquisizione dei dati.
9. Dopo l'acquisizione delle risposte evocate dalla fotostimolazione, eseguire l'analisi dei dati mappati utilizzando il programma di analisi delle mappe offline in Tidelwave²⁵ o il programma "MapAnalysis" in Ephus²⁶.

5. Imaging a fette fisse

1. Dopo le registrazioni, trasferire la fetta di cervello al 4% di paraformaldeide (PFA) in 0,01 M PBS (pH7,4) durante la notte a 4 ºC.
2. Trasferire la fetta in saccarosio al 30% in PFA al 4%/0,01 M PBS per una notte a 4 ºC.
3. Tagliare sezioni da 50 μm utilizzando un criostato e raccoglierle in 0,01 M PBS.
4. Sciacquare due volte le sezioni in 0,01 M PBS a temperatura ambiente.
5. Montare le sezioni e il vetrino coprioggetti in un mezzo antisbiadimento appropriato.
6. Trasferire le sezioni al microscopio confocale.
7. Concentrati sul ROI utilizzando la luce bianca.
8. Scegli la lunghezza d'onda, le dimensioni dell'immagine e la ripetizione per l'acquisizione dell'immagine. Per YFP, utilizziamo 514 nm (Ex)/527 nm (Em).

Risultati

La fotostimolazione a scansione laser delle proiezioni tra l'area visiva primaria (V1) e l'area visiva secondaria (V2) nel topo è stata realizzata a seguito di iniezioni di pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 di un topo Balb/C (Figura 3). Il promotore CaMKIIa in questo costrutto virale guida l'espressione specifica della canalrodopsina-EYFP nei neuroni glutammatergici eccitatori^1,15. Dopo la preparazione delle fette per la registrazione fisiologica, è stata osservata l'espressione delle fibre di canalrodopsina-EYFP, cioè l'epifluorescenza dell'EYFP coniugato, passando da V1 a V2 (Figura 3A). Inoltre, sono state osservate anche le fibre corticotalamiche nel nucleo genicolato laterale (LGN) (Figura 3A). Le registrazioni del patch clamp di cellule intere da un neurone in V2 hanno rivelato EPSC suscitate in seguito alla fotostimolazione a scansione laser di fibre che esprimono canalrodopsina-EYFP negli strati inferiori di V2 (Figura 3B).

In un altro esempio, la fotostimolazione a scansione laser delle proiezioni corticotalamiche dallo strato 6 della corteccia somatosensoriale primaria (S1) al nucleo ventroposteriore (VP) è stata realizzata utilizzando questo protocollo. Qui, abbiamo utilizzato un approccio Cre-Lox per mirare specificamente all'espressione della canalrodopsina nei neuroni di strato 6 e nelle proiezioni corticotalamiche di interesse. Esplicitamente, abbiamo iniettato pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA in S1 di B6. Topi Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (Figure 1 e 4). Questo ceppo di topo transgenico esprime la Cre-ricombinasi specificamente nei neuroni corticotalamici dello strato^{6 21}, e quindi risulta nell'espressione di ChR-YFP solo in quei neuroni dopo la trasfezione da parte del costrutto AAV 'floxed'. Dopo la preparazione delle fette, sono state osservate fibre di canalrodopsina-EYFP nei neuroni dello strato 6 e fibre proiettate verso lo strato 4 e VP (Figure 4A e 4B). La registrazione fisiologica da un neurone VPm utilizzando un patch clamp a cellula intera ha rivelato che le EPSC potrebbero essere suscitate in seguito alla fotostimolazione a scansione laser vicino al neurone registrato (Figure 4C e 4D).

La morfologia delle fibre marcate è stata valutata più facilmente a seguito di registrazioni fisiologiche. Qui, abbiamo resezionato (50 μm) preparazioni di fette con espressione di canalrodopsina-EYFP nei neuroni corticotalamici dello strato 6 (Figura 5). Ciò ha rivelato un sottile schema di fibre marcate che attraversano lo strato 6 allo strato 4, dove terminano e si arborizzano ampiamente (Figura 5A). Inoltre, sono state osservate fibre corticotalamiche che entrano nella sostanza bianca attraversando il talamo (Figure 5A e 5B).

Figura 1. Illustrazione schematica dell'espressione mirata della canalrodopsina tramite un approccio Cre-Lox. Topi transgenici che esprimono Cre-ricombinasi nelle popolazioni neuronali di interesse vengono iniettati con un virus "floxed" che codifica per la canalrodopsina fusa con una proteina fluorescente, come YFP. Dopo la trasfezione, solo i neuroni con Cre-ricombinasi esprimeranno il canale rodopsina-EYFP. Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Figura 2. Illustrazione schematica dell'impostazione della fotostimolazione. (A) Schema della configurazione della fotostimolazione a scansione laser. Il raggio laser viene guidato in successione attraverso un sistema a raggio aperto verso un otturatore e un filtro a densità neutra (N.D.). Un vetrino coprioggetti riflette parte del raggio su un fotodiodo collegato a un amplificatore per le misure di potenza del laser. I galvanometri a specchio vengono utilizzati per posizionare il raggio laser attraverso una lente di scansione, che guida il raggio attraverso una porta laterale sulla parte superiore del microscopio. Il fascio viene quindi riflesso verso il basso attraverso la lente dell'obiettivo fino alla preparazione della fetta utilizzando uno specchio dicroico. Per ulteriori dettagli vedi Lam e Sherman²³ e Shepherd²⁹. (B) Esempio del modello della griglia di fotostimolazione per l'esperimento rappresentativo mostrato nella Figura 3. La griglia di stimolazione 16 x 16 è sovrapposta a una fotomicrografia della preparazione della fetta. Una stella rossa indica la posizione di un neurone registrato utilizzando il patch clamp a cellula intera. La posizione del raggio laser è guidata in ciascuna delle 256 posizioni nella griglia di stimolazione dal posizionamento computerizzato dei galvanometri a specchio. Le posizioni laser dei primi 5 siti di stimolazione sono rappresentate in figura. Le risposte del neurone registrato alla fotostimolazione in ciascuno dei siti sono illustrate nella Figura 3. Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Figura 3. Fotostimolazione a scansione laser di proiezioni corticocorticali dalla corteccia visiva primaria (V1) alla corteccia visiva secondaria (V2) nel topo. (A) Immagine epifluorescente della preparazione della fetta che mostra le fibre di canalrodopsina-EYFP da V1 a V2 e nel nucleo genicolato laterale (LGN). L'espressione specifica della canalrodopsina-EYFP nei neuroni glutammatergici eccitatori è guidata da un costrutto virale contenente il promotore CaMKIIa. (B) Correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) suscitate da un neurone in V2 dopo la fotostimolazione a scansione laser. La stella rossa indica il sito di registrazione. Barre di scala: (A) 500 μm, (B) 200 pA, 100 msec. Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Figura 4. Fotostimolazione a scansione laser di proiezioni corticotalamiche dalla corteccia somatosensoriale primaria (S1) al nucleo ventroposteriore (VP) nel topo. (A) Immagine epifluorescente della preparazione della fetta che mostra le fibre di canalrodopsina-EYFP in S1. (B) Immagine epifluorescente di fibre marcate in VP. (C) Correnti postsinaptiche eccitatorie (EPSC) suscitate da un neurone VP in seguito a fotostimolazione a scansione laser. (D) Grafico degli EPSC medi. La stella rossa indica il sito di registrazione. Le tracce boxed in (C) corrispondono ai valori boxed in (D). Barre di scala: (A) 250 μm, (B) 250 μm, (C) 100 pA, 100 msec. Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Figura 5. Imaging dei neuroni di strato 6 che esprimono la canalrodopsina-EYFP nella corteccia somatosensoriale primaria (S1) del topo. (A-B) Neuroni marcati nello strato 6 e fibre che proiettano nello strato 4 e la sostanza bianca. Barre di scala: (A) 250 μm, (B) 250 μm. Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Discussione

Il protocollo descritto descrive in dettaglio un approccio per la valutazione in vitro della topografia funzionale e della fisiologia dei circuiti neuronali, che non si limita all'indagine dei circuiti del prosencefalo, cioè quelli del talamo e della corteccia. Diversi costrutti virali per la trasfezione optogenetica sono stati messi a disposizione della comunità scientifica e sono facilmente ottenibili dal Vector Core dell'UNC. Per una descrizione dei costrutti virali prontamente disponibili, vedere l'UNC Vector Core³¹, la pagina delle risorse di optogenetica presso il Deisseroth Lab della Stanford University³² e il laboratorio di neurobiologia sintetica Boyden presso il MIT³³. Varianti di queste opsine sono state sviluppate da questi laboratori e consentono modalità ad ampio raggio per il controllo dell'eccitabilità neuronale^1,2. L'ottenimento di questi vettori dal nucleo vettoriale UNC richiede un accordo di trasferimento di materiale da parte dei laboratori di origine. In questo protocollo, notiamo che l'aggiunta di polibrene migliora l'efficacia della trasfezione. Inoltre, un'altra variabile che influenza l'espressione è il periodo di recupero post-chirurgico, per il quale notiamo che un periodo di almeno 14 giorni è sufficiente per ottenere un'espressione robusta nelle vie del proencefalo dei topi.

Per la trasfezione mirata di specifici gruppi neuronali, sono state sviluppate diverse linee di topi Cre-transgenici, che possono essere utilizzate in combinazione con costrutti virali a lettura aperta invertita "floxed" che sono stati sviluppati¹¹. Diversi ceppi pertinenti alla ricerca neuroscientifica sono disponibili attraverso i Mutant Mouse Regional Resource Centers³⁴. Atlanti dei pattern di espressione della Cre-ricombinasi in queste linee transgeniche sono offerti attraverso il database GENSAT³⁵. Inoltre, Jackson Labs offre diversi ceppi Cre-transgenici, così come altri che esprimono costitutivamente opsine in specifici gruppi neuronali. Un passaggio fondamentale per l'utilizzo di queste linee di topi è quello di tenere conto del tempo necessario per ottenere e stabilire una colonia riproduttiva, che può variare in base al particolare ceppo di interesse.

Per la fotostimolazione, abbiamo utilizzato e adattato il setup sviluppato dallo Shepherd Lab della Northwestern University, descritto in un recente protocollo²⁹. Sebbene ottimizzata per l'uncaging del glutammato, questa configurazione è adatta anche per la fotostimolazione della canalrodopsina senza modifiche. Questa configurazione consente un controllo spaziale preciso e il posizionamento dei loci di fotostimolazione, che consente una valutazione della topografia funzionale dell'innervazione della canalrodopsina dei neuroni registrati. Sebbene il controllo spaziale sia migliorato con questo metodo di fotostimolazione, è più proibitivo in termini di costi rispetto ai metodi che utilizzano l'illuminazione di campo basata su LED²⁰. Inoltre, la non uniformità del tessuto cerebrale è una limitazione dell'optogenetica, o di qualsiasi tecnica che coinvolga la manipolazione della luce. In pratica, però, è raramente un fattore poiché i risultati sono interpretati per lo più in modo qualitativo. Nel caso in cui sia necessario un confronto più quantitativo tra le regioni del cervello, si può sempre utilizzare la massima intensità luminosa per ottenere risposte "sature".

Inoltre, abbiamo utilizzato sia i programmi software Tidelwave che Ephus scritti in Matlab per il controllo della fotostimolazione a scansione laser e l'acquisizione dei dati^25,26. Tuttavia, si raccomanda a coloro che configurano un sistema simile di utilizzare il più recente software Ephus²⁶, che ha il supporto disponibile attraverso il sito di sviluppo Janelia Farms³⁰. Un passaggio fondamentale è la scelta di quale di questi pacchetti software utilizzare, poiché i loro requisiti hardware differiscono leggermente. Inoltre, i programmi di analisi delle mappe sono adattati ai rispettivi programmi di acquisizione dati.

Molti di questi passaggi possono essere modificati per adattarsi alla particolare configurazione del professionista. Le iniezioni di soluzioni virali possono essere eseguite con meccanismi di somministrazione oltre a una siringa, ad esempio anche le pipette capillari in vetro tirate a punte con diametri di ~40 μm funzionano bene. Per gli interventi chirurgici, è possibile sostituire un supporto per la testa non stereotassico se tali coordinate non sono necessarie per guidare le iniezioni. Inoltre, le composizioni delle ACSF e delle soluzioni intracellulari possono essere modificate a seconda delle particolari esigenze sperimentali, ad esempio sostituendo una soluzione intracellulare di cesio o ad alto contenuto di cloruro per isolare le correnti inibitorie. Inoltre, un'alternativa all'imaging dei pattern di espressione in fette fisse può essere eseguita anche nella fetta viva su un impianto di imaging adatto con un sistema di perfusione a bagno.

In sintesi, questo protocollo consentirà al professionista di caratterizzare la topografia funzionale e la fisiologia sinaptica delle proiezioni in vitro, cosa che potrebbe non essere possibile utilizzando metodi standard, ad es. Caratterizzazione di proiezioni a lungo raggio che non possono essere conservate in una sezione. Il protocollo di trasfezione descritto può essere applicato agli esperimenti optogenetici in vivo ^1-3,12,14, poiché il meccanismo di consegna è lo stesso. Infine, sebbene questo protocollo descriva la trasfezione dei topi, molti dei vettori virali disponibili possono essere utilizzati per trasfettare ed esprimere teoricamente queste opsine in un'ampia gamma di specie di mammiferi, consentendo così una miriade di studi comparativi e specie-specifici^1-3.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polybrene	Santa Cruz Biotech	SC134220
Soluzione di paraformaldeide al 32%	EMS	15714
VECTASHIELD	Vector Labs	H-1400
AAV costrutti virali	UNC Vector Core	NA
Portatesta stereotassico per topo	Stoelting	51730
Iniettore Nanocool	Harvard Apparecchio	703040
Laser UV: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;	DPSS Lasers, Inc	3500
Galvonometri	Cambridge Scanning	6210
specchi	Cambridge Scanning	6m2003S-A
montatura	Cambridge Scanning	6102103L
cavo	Cambridge Scanning	6010-19-120
driver/controller	Cambridge Scanning	67121-1
Otturatore - Rivestimento ZM (compatibile con UV)	Uniblitz	L23-ZM2
	Uniblitz	VMM-D1
	Stanford Research Systems	SR570
6713	National Instruments	777741-01
2110 Break-out Box	National Instruments	777643-01
PCI-MIO-16E-4	National Instruments	777383-01
BNC-2090	National Instruments	777270-01
Cavi	National Instruments	184749-01
MATLAB	Mathworks
TCS SP2	Leica Microsystems