Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Con il rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Sommario

Crescita delle piante truncatula Medicago in simbiosi con i batteri azoto-fissatori meliloti Sinorhizobium nei singoli, microcosmi sterili fatto da lastre di laboratorio standard consente l'esame frequente dei sistemi di radici e noduli senza compromettere la sterilità. Le piante possono essere mantenuti in queste camere di crescita fino a 9 settimane.

Abstract

Batteri rhizobial formano simbiotici, noduli azoto-fissatori sulle radici delle piante leguminose host compatibili. Uno dei sistemi modello più ben sviluppati per lo studio di queste interazioni è la pianta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 e la rhizobial batterio Sinorhizobium meliloti 1021. L'imaging ripetuta delle radici delle piante e punteggio della fenotipi simbiotici richiede metodi che non sono distruttive per piante o batteri. I fenotipi simbiotici di alcuni impianti e mutanti batterici si manifestano dopo periodi relativamente brevi di crescita, e non necessitano di osservazione a lungo termine delle interazioni ospite / simbionte. Tuttavia, sottili differenze di efficienza e di nodulo senescenza fenotipi simbiotici che non sono evidenti nelle prime fasi del processo di nodulazione richiedono periodi di crescita relativamente lunghi prima di poter essere segnato. Diversi metodi sono stati sviluppati per la crescita a lungo termine e l'osservazione di questa coppia host / simbionte.Tuttavia, molti di questi metodi richiedono annaffiature ripetuto, che aumenta la possibilità di contaminazione da parte di altri microbi. Altri metodi richiedono uno spazio relativamente grande per la crescita di un gran numero di piante. Il metodo qui descritto, la crescita simbiotica di M. truncatula / S. meliloti in sterili, microcosmi singolo impianto, ha diversi vantaggi. Piante in questi microcosmi sono l'umidità e le sostanze nutrienti sufficienti a garantire che l'irrigazione non è richiesto per un massimo di nove settimane, impedendo la contaminazione incrociata durante l'irrigazione. Questo permette di fenotipi da quantificare che potrebbero essere mancati in sistemi di crescita a breve termine, come i ritardi sottili nello sviluppo del nodulo e all'inizio nodulo senescenza. Inoltre, le radici e noduli nel microcosmo vengono visualizzati facilmente attraverso il coperchio piatto, quindi non è necessario fino radicazione delle piante per l'osservazione.

Introduzione

L'interazione tra la pianta ospite legume Medicago truncatula A17 e il batterio rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 è uno dei sistemi modello più trattabili per lo studio di radice sviluppo nodulo e azotofissatrice simbiosi. I genomi di entrambi i partner simbiotici sono stati sequenziati ^1,2 e vegetali e batteri sono suscettibili di manipolazione genetica ^3,4. Analisi dei fenotipi di vegetali e mutanti batterici richiede la capacità di osservare le fasi di sviluppo del nodulo e per quantificare la produttività simbiotico nel tempo. Qui si descrive un metodo per l'osservazione dello sviluppo radicale nodulo di M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculati con S. meliloti 1021 all'interno dei singoli microcosmi fatti dallo standard, rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piastre di laboratorio profondi (Figura 1A). La ripresa viene esposto e cresce attraverso un portale dentata sul lato della piastra (Figures 1B, 1C e 1E). Radici sono contenuti all'interno dei microcosmi e mantenuti sterili, mentre permette l'osservazione attraverso il coperchio della piastra (Figura 1D). Poiché il tiro è accessibile, la sua crescita non è vincolato e può essere misurata ad intervalli periodici senza compromettere la sterilità della radice. Il metodo di creazione di microcosmi dentellato-targa è stato originariamente sviluppato da Leigh, et ​​al. ⁵ per la coltivazione di piante di erba medica, ma non è stato largamente adottato a dispetto dei suoi numerosi vantaggi rispetto ad altri metodi. Una variante di questo metodo è stato sviluppato anche per l'analisi dell'interazione tra le radici delle piante e micorrize ^6. Abbiamo ora adattato e ottimizzato questo metodo per la crescita di M. piante truncatula. I vantaggi di questo protocollo oltre più comunemente utilizzati metodi sono descritti di seguito.

Ci sono diversi metodi che sono attualmente in uso largo per gli studi nodulazione di M. truncatula inoculolata con S. meliloti ^7. Il metodo più comunemente usato per la preparazione su larga scala di radici nodulated è la crescita in cassoni aeroponic ^7. In questo metodo, le piante sono sospese su una grande nave e radici sono aerati con una miscela di S. meliloti e soluzione nutritiva ^7. Questo metodo è pratico se solo un genotipo di S. meliloti è da testare. Poiché richiede aerosol di elevate concentrazioni di batteri, c'è un'alta probabilità di contaminazione incrociata tra cassoni inoculati con differenti ceppi batterici. Un altro metodo che viene spesso utilizzato per preparare grandi quantità di piante inoculate è la crescita in tini o in vasi di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata che sono infuso con soluzione nutritiva e inoculato con S. meliloti ^7. Questo metodo richiede l'utilizzo di vasche aperte o in vasi, e richiede irrigazione e la ricarica della soluzione nutritiva. Un altro svantaggio di pentole è che le piantedeve essere rimosso da questa matrice di particolato per l'esame delle radici e noduli. Un altro inconveniente di questo metodo è che una vasta area di spazio incubatore è necessaria quando molti differenti S. genotipi meliloti devono essere confrontati, perché una pentola a parte deve essere utilizzato per ogni genotipo batterico. Il "vaso Leonard" è una variante di questo metodo di ^8,9. Un vaso Leonard è composto di due vasi sterilizzati impilati uno sopra l'altro e collegati da uno stoppino. Terreno di coltura viene inserito nel recipiente inferiore ed aspirata attraverso lo stoppino per capillarità in una matrice di crescita di perlite, vermiculite, sabbia o argilla calcinata nel recipiente superiore. La piantina (s) sono posti nella matrice crescita e inoculato con S. meliloti. Questo metodo non richiede irrigazione, ma l'esame delle radici e noduli richiede che la piantina essere rimosso dalla matrice crescita particolato.

Ci sono diversi metodi che consentono un facile esame della roots. Uno di questi è il transparent "sacchetto di crescita" plastica ^7. Uno svantaggio di questo metodo è che l'irrigazione frequente è necessaria poiché solo ≤ 10 ml di terreno liquido è ottimale per la crescita di M. truncatula in sacchetti ^7. Esperimenti Pouch sono di solito limitati a ~ 2 settimane ^7, grazie alla ripartizione dello stoppino di carta all'interno del sacchetto. Altri due metodi comunemente utilizzati sono simili al nostro metodo dal fatto che le piante sono coltivate su agar e le radici sono visibili, ma questi metodi hanno anche svantaggi che la nostra procedura evita. In questi metodi, le piante sono completamente contenute all'interno di 24,5 centimetri x 24,5 cm piastre di agar sigillate intorno alla parte superiore con del nastro adesivo chirurgico poroso o coltivate in tubi di agar-slant tappate con tappi di cotone o tappi di plastica ^7. Entrambi questi metodi consentono un facile esame delle radici e può essere conservato sterile. Tuttavia, i tubi slant agar sono di solito coltivate con solo 20 ml di agar ⁷ e richiedono di acqua e nutrienti addition per la crescita a lungo termine delle piante. Le piante coltivate entro i 24,5 centimetri x 24,5 centimetri di agar microcosmi piastre hanno umidità e sostanze nutritive per la crescita a lungo termine sufficiente, ma il germoglio che cresce rapidamente diventa vincolati all'interno del microcosmo piastra chiusa e il gas etilene possono accumularsi inibendo nodulazione ^7. Nella procedura qui descritta, la ripresa è esposto e cresce liberamente al di fuori del microcosmo che contiene ~ 70 ml di mezzi di comunicazione, permettendo la crescita a lungo termine.

La procedura descritta può essere utile non solo per lo studio di nodulation di piante leguminose, ma anche per lo studio dei fenotipi radici di altre piante di medie dimensioni. La differenza tra questi microcosmi e un tradizionale impianto policarbonato tessuto-cultura vaso è che radici nei microcosmi piastra qui descritti crescono sulla superficie verticale della agar piuttosto che verso il basso in uno strato orizzontale di agar al fondo del vaso. Questo permette la radice da sollevare dalla superficie agar con minima dAmage ai peli radicali e spessore ridotto agar alla superficie della radice, che facilita l'esame dei peli radicali al microscopio.

Protocollo

Eseguito le fasi 1, 2, 4, e 6 in una cappa a flusso laminare sterile è raccomandato.

1. Preparazione di M. truncatula A17 Piantine

Nota: M. truncatula A17 semi utilizzati in questi studi sono prodotti in condizioni di serra raffreddate a ~ 22 ° C, o in una stanza crescita delle piante mantenuta a 22-26 ° C con ~ 150-400 mmol / m ^-2 s ^-1 luce.

1. Versare in piastre germinazione dei semi: Usa 100 millimetri piatti quadrati (15 mm di profondità) e versare autoclavato 1,1-1,2% w / v di agar purificato ¹⁰ ad una profondità di 3-5 mm. Ogni piatto sarà utilizzato per germinare ~ 0,25-0,5 g di seme (equivalente a 63-125 semi / piastra).
   Nota: E 'fondamentale utilizzare impianti coltura cellulare testato, agar purificato per tutti i piatti descritti in questo protocollo. Il venditore e le informazioni il numero di catalogo per l'agar è elencato nella tabella dei reagenti e attrezzature specifiche.
2. Scarify / sterilizzare l'M. truncatula A17 semes: Pesare semi sufficienti per il numero desiderato di piantine. (M. truncatula A17 semi sono ~ 4 mg ciascuna) Luogo semi sterili 125 ml flaconi con le coperture foglio sterili (0,25-0,5 g di semi / boccetta, questo è ~ 63-125 semi) e pipetta 20 ml di concentrato (96%) H ₂ SO ₄ lungo le pareti del pallone.
   Nota: scarificazione Acid sterilizzare i semi. Inoltre, l'acido pipettando lungo le pareti del pallone, esso ri-sterilizzare l'interno del pallone che è venuto a contatto con i semi sterilizzati.
3. Break up ciuffi di sementi con una pipetta di vetro sterile. Agitare ogni boccetta di frequente per 10-12 min. Piccolo, pozzi marroni saranno visibili sui semi. Questi sono piccoli fori nel cappotto di seme ^11.
   Nota: quando si lavora con H ₂ SO ₄ concentrato Indossare occhiali di protezione e guanti.
4. Rimuovere H ₂ SO ₄ e sciacquare i semi: quando almeno il 10% dei semi hanno piccoli pozzi marrone, o 12 min sono passati, a seconda di qualeviene in primo luogo, rimuovere tutti l'acido dai palloni con una pipetta di vetro sterile. (Acido rifiuti posto in un beaker 1-2 L contenente almeno 300 ml di acqua di rubinetto. Ciò diluire l'acido ed evitarne il surriscaldamento.) Inclinare il pallone per raccogliere l'acido residuo in curva del pallone e utilizzare una piccola pipetta di vetro a eliminare tutto l'acido residuo. Se l'acido residua, che reagisce con l'acqua di risciacquo, scaldare i semi e li uccidono.
   1. Risciacquare semi versando rapidamente 100 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone. Il volume in eccesso di acqua diluire l'acido e prevenire il surriscaldamento e sementi danni durante la reazione dell'acido con l'acqua. Versare l'acqua e fiamma sterilizzare il labbro del pallone.
   2. Sciacquare i semi 8-10x con 50 ml di acqua ultrapura sterile. Agitare il pallone durante ogni lavaggio. Il pallone deve essere considerato sterile a questo punto e il labbro del pallone deve essere fiammato prima di ogni risciacquo.
5. Lasciate che i semi assorbono durante la notte: dopo laultimo risciacquo, versare 50 ml di acqua ultrapura sterile in ogni pallone, sostituire la pellicola di copertura sterile su ogni pallone e posto a 4 ° C al buio durante la notte.
6. Luogo semi su piastra germinazione: Dopo semi di locazione assorbono durante la notte, versare l'acqua, sciacquare con 2x ~ 25 ml di acqua ultrapura, quindi aggiungere 20 ml di acqua ultrapura sterile, turbinio per risospendere semi e versare su una piastra di agar germinazione 1,1-1,2% da punto 1.1. Se semi rimangono nel pallone, aggiungere più acqua e versare di nuovo. Distribuire i semi da ogni pallone a una piastra (63-125 semi / piastra).
   1. Agitare la piastra per distribuire i semi. I semi devono essere distribuiti in modo uniforme in una banda di 4-5 cm ad una estremità della piastra. Questo sarà il "top" della piastra. Il "fondo" 5-6 cm dovrebbe essere mantenuto privo di semi (Figura 2A).
   2. Aspirare l'acqua con una pipetta sterile. La piastra a 45 ° per far colare l'acqua rimasta al fondo della piastra. Riposizionare il coperchio sul tilPiastra ted e proteggere dalla luce. Piatti dovrebbe essere consentito di drenare 10-20 min. (Figura 2B).
7. Montato germinazione: Rimuovere tutta l'acqua che si è raccolto nella parte inferiore della piastra inclinata con una pipetta sterile.
   1. Riposizionare il coperchio e sigillare il piatto con parafilm. Indossare guanti e mantenere sterile (Figura 2C).
   2. Stack le piastre di germinazione e poi girare tutti loro fino ad un angolo di 90 °. I semi vengono stesi sulla superficie verticale della agar. Semi completamente imbibiti dovrebbe facilmente aderire al agar. Le radici cresceranno verso il basso (Figura 2D).
   3. Avvolgere la pila di lastre di germinazione in fogli di bloccare la luce e mantenerlo a 25 ° C per 3 giorni.

Nota: Se il provento di germinazione per meno di 3 giorni, le radici possono essere troppo breve per raggiungere l'agar-agar in microcosmi. Se la germinazione procede più di 4 giorni prima del trasferimento a piastre microcosmo, la sopravvivenza delle piantine sarannoessere poveri. Se M. ecotipi truncatula o mutanti con tassi di germinazione più lenti devono essere confrontati, l'ecotipo lentamente germinazione dovrebbe essere consentito di germinare più di 3 giorni.

2. Preparazione dei singoli Microcosmi Piatto

1. Preparare medio ¹² (cfr. tabella 1 per la composizione), consentendo ~ 70 ml di mezzo di Jensen per ogni microcosmo. Preparare in brocche o bottiglie che sono convenienti per un rapido versamento (non più di 1-2 litri per ogni lanciatore) e lasciare un ancoretta magnetica nella brocca durante la sterilizzazione in autoclave.
   1. Dopo medio è raffreddato a ~ 55-65 ° C, sono stati aggiunti integratori, e il pH è stato controllato (cfr. tabella 1), versare nella rotonda diametro 100 millimetri, 15 millimetri piatti fondi. Le lastre devono essere versati ~ 0,9-1 cm di profondità (~ 70 ml / piastra).
   2. Componenti di mezzo di Jensen possono formare un precipitato nuvoloso, quindi è importante per restituire il lanciatore alla piastra magnetica mescolare periodicamente per evitare che i componenti di stabilirsi fuori. Precipitati possono essere vispatibile nel piatto dopo che solidificano, e non influisce sulle prestazioni, purché siano equamente distribuiti tra i piatti.
   3. Impilare piastre durante il getto per evitare la formazione di condensa sui coperchi piastra.
2. Dopo piastre di Jensen solidifica, tacca entrambe le piastre e coperchi con una spatola di pesatura che è stato piegato a U ⁵ (Figura 3A). Riscaldare la curva della spatola con un bruciatore fino al rosso caldo, tacca 5-6 piatti e poi riscaldare di nuovo. Quando il coperchio dentellato è collocata sulla piastra dentata, questo creerà un portale ovale attraverso il quale la ripresa della piantina crescerà (Figura 3B). Se le piastre dentellate devono essere conservati, avvolgere singolarmente con film paraffina ..

3. Preparazione di Sinorhizobium meliloti Culture

Due giorni prima inoculazioni di piante, iniziare culture di tutto S. meliloti ceppi essere inoculate sulle piantine. Culres dovrebbero essere coltivate in LBMC (Luria-Bertani [Miller]) medio ¹³ supplementato con 2.5 MgSO mm _4, 2,5 mM CaCl _2, e antibiotici appropriati (TY medio funziona anche bene). Appena 2-3 ml di ogni cultura saranno sufficienti.

1. Coltivare a 30 ° C con agitazione per 2 giorni fino a quando le cellule sono densi.
2. Per la maggior parte inoculazioni vegetali, la fase di crescita del S. meliloti non è critica. Di solito, in ritardo log o sono utilizzate cellule in fase stazionaria precoce.

4. Posa su M. truncatula Piantine sui singoli Microcosmi

1. Dopo 3 giorni, aprire un piatto di germinazione (preparato nella fase 1) e inondare immediatamente con acqua ultrapura sterile. Dip pinza in etanolo e brevemente fiamma per sterilizzare. Utilizzare pinze sterili per spingere delicatamente le punte delle radici di tutte le piantine sotto l'acqua per evitare l'essiccazione. Radici spazieranno 2-6 cm di lunghezza. La maggioranza sarà 3-4 cm. Selezionare piantine con radici diritte e non evidentedifetti.
2. Controllare i coperchi dei microcosmi medie del Jensen per la formazione di condensa. Flick il coperchio per rimuovere la condensa o sostituirlo con un nuovo coperchio dentellato. Se vi è un eccesso di condensa sul coperchio, la radice piantina può aderire al coperchio e poi muoiono dopo la condensazione asciuga.
3. Utilizzando le pinze, prendere delicatamente una piantina dalla piastra germinazione dai cotiledoni e laici la radice su mezzo il microcosmo di un Jensen. Assicurarsi che la punta della radice è in contatto con l'agar.
4. Rimuovere delicatamente il cappotto di seme se è ancora presente. I cappotti di seme dovrebbero essere sciolti dopo ammollo in acqua per 5-10 min. Stuzzicare delicatamente il cappotto di seme con la pinza fino a quando non cede, e scartare. I cotiledoni e circa 0,5 cm di ripresa devono sporgere fuori dalla U-tacca nella piastra (Figura 4A). Ricollocare accuratamente il coperchio della piastra con l'U-tacca del coperchio sopra la piantina, creando un portale per la piantina (Figura 4B).Set piastre da parte in pile orizzontali fino a quando tutti piantine sono stati immessi sul microcosmi.
5. Utilizzare tutte le piantine da ogni piatto germinazione quello sguardo vitale e hanno una radice diritta. (Se possibile, lasciare un piatto di piantine non aperti da utilizzare in sostituzione di piantine avvizzite poco prima inoculazione.)
6. Dopo aver posato tutte piantine, permettere loro di sedersi sul microcosmi orizzontale di Jensen, mentre la S. sospensioni di inoculo meliloti sono in preparazione.

5. Preparazione di S. meliloti inoculo Sospensioni

1. Controllare S. meliloti culture periodicamente dopo l'inoculazione per essere sicuri che stanno crescendo. Dopo 2 giorni di crescita, il diametro esterno ₆₀₀ deve essere compresa tra 2 e 4.
2. Pipettare 0,5 ml di ogni cultura in una sterile provetta da 1,5 ml e centrifugare a pellet. Rimuovere il surnatante.
3. Lavare le cellule due volte in entrambi 0,85% di acqua sterile di NaCl sterile o ultrapura. Risospendere le cellule in 0,5 ml 0,85% sterile NaCl o acqua ultrapura.
4. Misurare il diametro esterno ₆₀₀ di una diluizione 1/10 di risospeso S. meliloti culture dal punto 5.3. Sulla base di questa lettura, fare una sospensione di ogni cultura in acqua ultrapura sterile a OD ₆₀₀ = 0,05. Se la densità cellulare è troppo alta, nodulation può essere inibito. Fare abbastanza della sospensione diluita in modo che 100 ml possono essere inoculati su ogni piantina. La nuvolosità della OD ₆₀₀ = 0.05 sospensione deve essere appena percettibile ad occhio.

6. Inoculazione e tenuta di Microcosmi

1. Immediatamente prima di vaccinazioni iniziano, verificare la presenza di piantine avvizzite che non sono sopravvissuti al trasferimento di microcosmi medie del Jensen. Sostituire quelle piantine con piantine fresche da lastre di germinazione.
2. Aprire ogni microcosmo e inoculare 100 ml di adeguata S. meliloti sospensione sulla radice piantina. Riposizionare il coperchio e mettere da parte in stac orizzontaleks di 6-10 microcosmi. Per ogni S. ceppo meliloti da confrontare, inoculare almeno 15 piante. Per i ceppi che presentano sottili differenze di produttività simbiotico, inoculare 30-35 piante. Lasciare almeno 10 piante non inoculate come controllo negativo. Inoculare 30-35 piante con S. meliloti 1021 o altra appropriata ceppo selvatico per servire come controllo positivo.
3. Dopo la S. sospensione meliloti ha avuto il tempo di assorbire sulla superficie della radice e il liquido di sospensione ha inzuppato nel agar (almeno 20 min.), avvolgere ogni piatto singolarmente con film paraffina. Piastre devono essere avvolti fino al confine della tacca, ma il film paraffina non devono bloccare la crescita della piantina (Figura 4C).
4. Al momento del confezionamento, eseguire un controllo finale per radici attaccate alla parte interna del coperchio piastra. Per rimuovere le radici attaccate dal coperchio, porre la lastra piana in panchina e toccare o sfogliare il coperchio a bussare alla radice indietro sulla agar surface.
5. Allineare i portali piantine di ciascuna pila di 6-10 piatti. Posare lo stack ad un angolo di 90 ° con le piantine punta verso l'alto (Figura 4D). La vischiosità del film paraffina terrà le piastre in luogo abbastanza a lungo per avvolgere l'intero stack in un foglio, lasciando una striscia di 1-2 cm scartato dove le piantine emergono (Figura 4E). La pellicola protegge le radici dalla luce.
6. Inserire la pellicola avvolta stack in una camera di crescita illuminata o camera di crescita a 21-25 ° C, 60-70% di umidità relativa e 100-175 mmol / m ^-2 s ^-1 luce su un ciclo di buio 16 ore di luce / 8 ore ( Figura 1A). In queste condizioni di crescita, incubazione prolungato a livelli di luce maggiore di 200 pmol / m ^-2 s ^-1 può avere un effetto negativo sulla crescita delle piante.

7. Esame di Root Sistemi e quantitativa di simbiotiche fenotipi

Le piante possono essere mantenuti inmicrocosmi fino a 9 settimane.

1. Numero nodulo può essere quantificata in una serie di punti di sempre da scartare il foglio di ogni risma e contando noduli. Lo sviluppo di noduli sulle piante inoculate con S. meliloti 1021 tipo selvatico sono evidenti da 10-14 giorni dopo l'inoculazione.
2. Produttività simbiotico può anche essere misurata ad ogni tempo misurando la lunghezza delle riprese emergente.
3. Quantificazione finale della produttività simbiotico viene di solito eseguita a 7 settimane dopo l'inoculazione staccando il tiro e la misurazione del peso fresco del germoglio. Questa operazione può essere eseguita più tardi nove settimane se la crescita è più desiderato.

Risultati

La preparazione e inoculazione di questi microcosmi piatto è relativamente semplice rispetto alla maggior parte degli altri metodi descritti nell'introduzione. L'uso di questi microcosmi consente anche la crescita delle piante prolungata (fino a 9 settimane) senza annaffiature o supplementazione dei nutrienti, la manutenzione di radice di sterilità, sia semplice esame delle radici e la protezione di radici dalla luce, la crescita incontrollata di germogli di piante, di facile accesso per le riprese misura della ...

Discussione

Ci sono diversi passaggi del protocollo che sono fondamentali per il successo: 1) La necessità di usare purificato, pianta coltura cellulare testato agar non può essere sottovalutata. Questo non è critica per piantine di erba medica, ma è fondamentale per la crescita di M. truncatula A17. 2) E 'importante germinare piantine su piastre di agar verticali come descritto nella Fase 1. La tecnica ampiamente usata di germinazione piantine su una superficie orizzontale rovesciato in un piatto fondo 15 millimetri <...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sigma	A7921		purificato con agar e testato in coltura cellulare vegetale