Articolo metodologico

Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come

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DOI:

10.3791/50928

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26 ottobre 2013

 ,  , 
1Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie, Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg, 2Department of Medicinal Chemistry, Faculty of Life Sciences, University of Vienna

In questo articolo

Sommario

In vitro modelli di lesioni cerebrali traumatiche sono state sviluppate per riprodurre in deformazione del cervello in vivo. Lesioni Stretch indotta è stato impiegato per gli astrociti, neuroni, cellule gliali, aortica, e le cellule endoteliali cerebrali. Tuttavia, il nostro sistema utilizza una barriera emato-encefalica (BBB), modello che possiede le proprietà che costituiscono un modello legittimo della BBB di stabilire un modello in vitro TBI.

Abstract

A causa dell'incidente elevata mortalità causata da lesioni cerebrali traumatiche (TBI), metodi che consentano di comprendere meglio i meccanismi di fondo che lo praticano sono utili per il trattamento. Ci sono sia in vivo che in vitro metodi disponibili per questo scopo. In vivo modelli possono mimare trauma cranico effettivo, come avviene durante TBI. Tuttavia, nelle tecniche in vivo non può essere sfruttato per studi a livello fisiologia cellulare. Quindi, metodi in vitro sono più vantaggiose per questo scopo in quanto forniscono un più facile accesso alle celle e l'ambiente extracellulare per la manipolazione.

Il nostro protocollo presenta un modello in vitro di lesioni distensione usando TBI in cellule endoteliali microvascolari cerebrali. Esso utilizza la pressione applicata alle cellule coltivate in pozzetti a fondo flessibile. La pressione applicata può essere facilmente controllata e può produrre lesioni che varia da bassa a grave. Il murinomicrovascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) generati nel nostro laboratorio è un modello molto adatto per la barriera emato-encefalica (BBB), fornendo così un vantaggio per altri sistemi che utilizzano una tecnica simile. Inoltre, grazie alla semplicità del metodo, nelle configurazioni sono facilmente duplicati. Così, questo modello può essere utilizzato nello studio dei meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella TBI presso la BBB.

Introduzione

Lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Circa 10 milioni di persone sono colpite ogni anno da TBI rendendolo un importante problema sanitario e medico 1. A causa di questo, diversi in vivo e in vitro di trauma cranico sono stati stabiliti e sviluppato per studiare i meccanismi di 2,3,4. Una migliore comprensione del trauma cranico può contribuire a migliorare il trattamento del paziente e diminuire la mortalità associata, morbilità e costi.

Molti modelli per lesioni cerebrali che utilizzano sia in vivo che in vitro esistono metodi. Modelli in vivo potrebbe imitare l'evento reale della lesione alla testa. Tuttavia, a causa della complessità della situazione in vivo, accessibilità al tessuto di interesse diventa limitato 2. Nella comprensione della risposta fisiologica delle singole celle come conseguenza della ferita inflitta, è importante che le cellule sono isolate dagli effetti sistemici chepuò inibire o alterare la loro risposta individuale 5. Per questo motivo, modelli cellulari di trauma forniscono utili vantaggi rispetto modelli animali poiché l'ambiente meccanico delle cellule può essere controllato con precisione 6.

Sistemi in vitro che impiegano l'uso di carico meccanico alle cellule o tessuti di determinare alterazioni indotte da tale metodo di lesione sono stati sviluppati. Ad esempio, è stato stabilito un metodo per studiare l'effetto di danno meccanico alle cellule di astrociti, neuroni, cellule gliali e cellule endoteliali aortiche 7,8,9. Il modello in vitro trauma stabilito per lo studio dei roditori e reattività astrociti umani 10 impiegato un dispositivo di controllo della pressione identico a quello che usiamo per il nostro modello. Lo stesso metodo è stato applicato per indurre lesioni attraverso tratto in topo cervello microvasi cellule endoteliali (bEnd3) 11 e neuroni corticali 12,13 nonché, endoth cerebralecellule Elial da suinetti neonati 14. Il dispositivo deforma il fondo della cultura ben producendo pertanto un grave stiramento meccanico 10. Essa infligge lesioni upon cellule coltivate mediante l'applicazione di pressione aria sopra le celle. Questa pressione può deviare la membrana su cui le cellule crescono, allungando così le celle. Vari gradi di stiramento (cioè "basso" moderato "o" grave ") può essere raggiunto impostando la durata dell'impulso di pressione dell'aria e l'intensità di conseguenza. Questo metodo di lesioni all'allungamento indotto è stato correlato con lesione traumatica in vivo 7. Inoltre , questo metodo consente di lesioni per il preciso controllo dell'ambiente extracellulare e può essere facilmente riprodotta.

Anche se un approccio simile è stato utilizzato per molti altri tipi di cellule del cervello, comprese bEnd3, il nostro modello è di un vantaggio in quanto fa uso del cervello microvascolari cellule endoteliali murine (CEND) generatonel nostro laboratorio. Questa linea cellulare è un modello molto adatto della barriera emato-encefalica (BBB). Colture cellulari in vitro utilizzati come modelli BBB deve possedere caratteristiche tali da consentire loro di servire come schermo di permeabilità. Un criterio importante per un modello in vitro di cellule di essere un predittore di BBB permeabilità è che dovrebbe possedere un'architettura cellulare fisiologicamente realistico 15. Anche se bEnd3 celle visualizzano distintivo mandrino-come morfologia squamose nella cultura 16, esibiscono un comportamento irregolare morfogenetica in vitro in cui si formano cavità simili a cisti piuttosto che le normali strutture tubolari in fibrina gel 17. Inoltre, quando le cellule sono state iniettate in topi embrionali e neonatale, hanno indotto in rapida crescita dei tumori letali per topi embrionali, ma non nei topi neonati e giovani. Si propone quindi che uno o più processi che regolano il normale crescita endoteliale, la migrazione e la differenziazione sono stati alterati o elimied in questa linea cellulare 18. D'altra parte, morfologiche, valutazione immunocitochimica di misure di flusso endoteliali ed espressione marcatore BBB, bioelettrica, e paracellular dimostrano che il nostro modello BBB CEND è infatti un modello adatto della BBB 19.

Endotelio cerebrale in vivo è caratterizzato da una permeabilità estremamente stretta con trans-endoteliale resistenza elettrica (TEER) compresi tra 2,000-5,000 Qcm 2. Per gli studi di cervello microcircolo proprietà barriera ai prodotti farmaceutici, devono essere considerati restrittività paracellulare e tenuta delle cellule. Nella maggior parte dei capillari del cervello cellule endoteliali (BCEC), questo non è conservato come cellule mostra TEER vanno 50-100 Qcm 2 20. Il cervello endoteliale linea bEnd3 cellulare immortalata genera valori TEER non superiori a 60 Qcm 2 15. In contrasto con la differenziazione delle cellule CEND con terreno contenente siero ridotto visualizzazioneValori che vanno TEER 300-500 Qcm 2 19,21.

Ad oggi, in modelli in vitro di lesioni tratto in cellule endoteliali cerebrali coltivate sono scarse. Quindi, un modello in vitro per il trauma per infortunio tratto utilizzando cellule endoteliali cerebrali che agiscono come modello della BBB potrebbe rivelarsi utile. In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro che possono mimare l'impatto effettivo che le cellule del cervello, in particolare il cervello cellule endoteliali microvascolari del BBB, ricevono durante TBI. Il vantaggio principale di questo modello è che la quantità di lesione applicata alle celle nonché l'ambiente extracellulare può essere facilmente controllato in maniera precisa, che consenta un facile riproducibilità sperimentale di set-up.

Protocollo

1. Semina delle cellule endoteliali in pozzetti

  1. Coltivare microvascolari cerebrali cellule endoteliali murine (CEND) in beuta T75 cultura, cambiando il medium (DMEM contenente 10% FCS, 50 U / ml di penicillina / streptomicina, 1% di L-glutammina) due volte a settimana, fino al raggiungimento confluenza. (Per la generazione e immortalization del cervello cellule endoteliali microvascolari, vedere Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.).
  2. Lavare le cellule con tampone fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e trypsinize le cellule con 2 ml di soluzione di tripsina-EDTA caldo.
  3. Incubare le cellule a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando lo strato di cellule è disperso.
  4. Aggiungere 8 ml di terreno di coltura nelle cellule. Toccare il pallone più volte per staccare le cellule.
  5. Visualizzare le cellule sotto il microscopio per garantire il completo distacco dal pallone.
  6. Pipetta medie con le cellule staccate su e giù. Agitare il pallone per mescolare il suspensi cellaon.
  7. Prendere 20 microlitri della sospensione cellulare, messo in un emocitometro e contare il numero di cellule.
  8. Determinare la densità cellulare e sementi 20.000 cellule / cm 2 nel pozzo.
  9. Trasferire la sospensione cellulare in collagen1 prerivestita 6 pozzetti con fondo flessibile piastre di coltura (57,75 centimetri 2) in un volume totale di 3 ml / pozzetto. Ogni bene ha una superficie di 9,62 centimetri 2.
  10. Crescere le cellule a 37 ° C per una settimana fino confluenti. Cambia il terreno di coltura due volte a settimana.

2. Differenziamento Cellulare Prima Infortunio Stretch indotta

  1. Cambiare il mezzo di coltura delle cellule con terreno di differenziamento (DMEM contenente 1% di siero-messo a nudo siero fetale di vitello (ssFCS), 50 U / ml di penicillina / streptomicina).
  2. Incubare le cellule a 37 ° C per 24 hr.

3. Infortunio Stretch indotta delle cellule endoteliali

  1. Accendere il dispositivo di controllo danno cellulare.
  2. Impostare il ritardo di 50 msec.
  3. Impostare il regolatore di pressione a 15 psi e premere il grilletto un paio di volte fino a quando la pressione di picco registrato diventa stabile.
  4. Impostare il regolatore di pressione al valore desiderato. Utilizzare la Tabella 1 come guida per generare vari gradi di lesioni stirata.
  5. Posizionare la piastra di coltura flessibile a fondo da 6 pozzetti (57,75 centimetri 2) nel supporto del vassoio. Assicurarsi che il selettore sia impostato bene alle dimensioni ben corretto (cioè gran bene).
  6. Posizionare l'adattatore saldamente sopra il pozzo. Tenere saldamente la spina in posizione con una mano mentre l'altra mano spinge il grilletto.
  7. Registrare la pressione di picco generata.
  8. Mettere immediatamente la piastra posteriore nella 37 ° C incubatore per il tempo desiderato o utilizzare immediatamente per riuscire esperimenti o di valutazione.

4. Valutazione della Stretch lesioni da Dye assorbimento Assay

  1. Subito dopo le cellule erano stracidato (passo 3.7), aggiungere 30 ml di un mg / ml soluzione della viabilità macchia 1 che agisce come un marcatore di citotossicità (per favore consultate la tabella dei materiali e delle attrezzature) al mezzo di coltura cellulare (Nota: 10 microlitri della soluzione colorante è da utilizzare per ogni ml di mezzo di coltura cellulare).
  2. Dopo l'aggiunta del colorante alle cellule, visualizzare immediatamente sotto un microscopio a fluorescenza.

5. Valutazione della Stretch lesioni da lattato deidrogenasi (LDH) uscita

  1. Subito dopo l'allungamento delle cellule (passo 3.7), rimuovere 200 pl di mezzo di coltura cellulare dal pozzo. Fare lo stesso per ogni punto di tempo post-infortunio si desidera includere nella vostra indagine di rilascio di LDH (cioè ad esempio 30 minuti, 1 ora, 2 ore, ecc.)
  2. Centrifugare il mezzo di coltura cellulare alla massima impostazione di una microcentrifuga per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Rimuovere il surnatante e utilizzare questo per i passi successivi.
  3. Una volta che have finito passo 5.1 e hanno preso i necessari campioni che vorreste avere da vari punti di tempo che si desidera indagare, lisare le cellule utilizzando la soluzione di lisi incluso nel LDH test kit (vedi tabella supplementare dei materiali e delle attrezzature).
  4. Mettere 100 ml di terreno di coltura inclusa nel saggio kitto ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti fornito nel kit.
  5. Mettere 100 ml di mezzo di coltura cellulare esente da cellule in due pozzetti paralleli di una piastra a 96 pozzetti incluso nel kit di analisi.
  6. Incubare la piastra a 37 ° C per 30 min.
  7. Leggere l'assorbanza a 492 nm.

Risultati

Cellule coltivate su collagene I fase solida piastre di coltura fondo 6 pozzetti flessibili (57,75 centimetri 2) sono stati sottoposti a vari gradi di lesioni tratto utilizzano il dispositivo barella cella. Dopo sottoponendo le cellule al danno, essi sono stati esaminati al microscopio per gli effetti di lesioni all'allungamento indotto a morfologia cellulare. È stato osservato che una maggiore grado di allungamento è stata applicata alle celle potrebbe essere rilevato anche un maggior grado di distorsione cella (Figura 1). Come mostrato in figura 1A, cellule di controllo che non sono stati sottoposti a lesione appaiono come cellule endoteliali cerebrovascolari forma regolare (CEND) senza indicazione di gonfiore cella o distorsione. Quando è stato applicato lesioni tratto (Figure 1B-D), deformazione poteva essere osservato al microscopio ottico. Dopo l'allungamento delle cellule gravemente con una pressione di picco tra 3,5-4,5 psi, le cellule CEND apparsi nettamente retratto, gonfie e deformate con non spazi intercellulari capaci. Inoltre, l'assorbimento di vitalità macchia (concentrazione finale 100 nM) anche aumentato il grado di lesione allungamento è stato aumentato (Figura 2). La vitalità macchia usato è un colorante impermeant alle cellule sane che diventa permeanti quando l'integrità della membrana plasmatica delle cellule è compromessa. Il colorante è stato escluso dalla maggior parte delle cellule di controllo, quindi, solo alcune delle cellule sono state colorate (Figura 2A) rispetto alle cellule allungate (figure 2B-D). Altre cellule fluoresced verde con un aumentato grado di lesione tratto.

Come marcatore biochimico di danno, il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) enzima è stato inoltre esaminato in base alle istruzioni del produttore. Figura 3 mostra che una lesione tratto cella crescente causato l'aumento di rilascio di LDH.

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Figura 1. Esame al microscopio ottico di cellule normali vs feriti. (A) normale distenderla monostrato di cellule confluenti istightly imballato e allungata. Quando le cellule sono state tese applicando un impulso di pressione di picco di 1,8-2,0 psi (cioè basso allungamento) appaiono meno compatto, spazi indicati da frecce (B). Quando le cellule sono state moderatamente lesa con un picco di impulso di pressione 2.5-3.0, alcuni di loro è apparso gonfio e deformato (C). Le cellule diventano retratti con grave tratto di 3,5-4,5 psi, come indicato dalla freccia (D). Ingrandimento 100X. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 2. Fluorescence esame al microscopio delle cellule normali vs feriti cellule trattate con vitalità 2h macchia dopo l'infortunio A: controllo di cellule unstretched BD: cellule allungate (B - basso, C - moderato, D - grave).... Ingrandimento 100X. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 3. Lattato deidrogenasi (LDH) enzima rilascio nel surnatante dopo la lesione tratto. LDH rilasciata nel mezzo di coltura è stata misurata a vari intervalli di tempo dopo stiramento lesione indotta. LDH è stata espressa come percentuale del totale rilasciabile LDH (LDH in Media Plus cellule). I valori sono ± SEM. Il n per ogni punto di tempo è 5, tranne per il 0 hr valore sottoposto a grave tratto dove n = 3. Rilascio di LDH da celle che sono state sottoposte a basso e moderato stirata non differisce significativamente da quella dei controlli unstretched e una dall'altra. Celle che sono state gravemente allungati rilasciato una quantità significativamente maggiore di LDH rispetto a tutti gli altri campioni, ad eccezione del campione moderatamente allungato, su 1 ora. (P <0.05, ANOVA Un fattore, metodo di Holm-Sidak). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Tabella 1. Guida per la generazione di vari gradi di lesioni tratto.

Regolatore di pressione Picco di pressione Grado di lesione
15 psi 1,2-1,5 psi
20-25 psi 1,8-2,0 psi Basso
30-35 psi 2,5-3,0 psi Moderato
40-50 psi 3,5-4,5 psi Grave
60 psi 4,8-6,0 psi > Grave

Discussione

Gli effetti di lesioni meccaniche in vitro sono stati studiati e sono stati stabiliti metodi per astrociti, neuroni, cellule gliali e cellule endoteliali aortiche 8, 9, 22. Vi è, tuttavia, a tutt'oggi ancora noto modello in vitro di lesioni tratto in cellule endoteliali coltivate cerebrali. Modelli cellulari di trauma forniscono importanti vantaggi rispetto ai modelli animali poiché l'ambiente meccanico delle cellule può essere controllato con precisione 6. Quindi, un modello in vitro per il trauma per infortunio tratto utilizzando cellule endoteliali cerebrali che agiscono come modello della barriera emato-encefalica (BBB), come quello che il nostro protocollo di regali possono rivelarsi utili.

Questo protocollo fa uso di cellule CEND, un modello BBB stabilito nel nostro laboratorio. Dal ripartizione BBB è spesso documentato in pazienti con trauma cranico e trauma cranico è spesso legata alla rottura della BBB, che può portare a formazione di edema 23, 24, il metodo di presented qui possono specificamente essere utilizzato nella realizzazione di studi BBB in relazione al trauma cranico.

In questo modello, è importante prendersi cura di quanta grado di lesione stirata viene applicata alle celle. In quanto le cellule rimangono ferite in ogni caso, e con qualunque quantità di pressione viene applicata, il grado di danno che può influenzare le cellule endoteliali differiscono molto notevolmente da altri tipi di cellule. Cellule endoteliali aortiche sono più resistenti di allungare infortunio di astrociti o cellule gliali miste 9. Inoltre, riparano più rapidamente dopo lesione rispetto agli altri tipi di cellule. Pertanto, per cervello cellule endoteliali, cellule, particolarmente cend maggiore quantità di lesione stirata è necessaria per produrre un alto grado di lesione. Si potrebbe raggiungere il grado desiderato di lesione applicando la pressione corrispondente indicato nella tabella 1. Per le cellule CEND, tuttavia, lesioni gravi è preferito a causa della loro resistenza allo sforzo. I test condotti hanno dimostrato LDHche come aumenta il grado di stirata, più LDH è secreta nel supernatante. Al contrario, le cellule che sono stati dati una bassa quantità di lesioni prodotte tratto LDH in una quantità simile alle cellule di controllo. Come menzionato nel protocollo, si deve fare attenzione che la quantità appropriata di terreno è usato in quanto un aumento o una diminuzione della quantità di mezzo può provocare a differenze nella pressione di picco applicata ai pozzetti. Per esempio, un pozzetto contenente 5 ml di liquido registra una pressione di picco nella media 4,0 psi mentre un pozzetto vuoto registra una media di 3,8 psi quando viene applicata pressione 45 psi. Pertanto, è meglio per spingere il grilletto più volte nel corso di un controllo bene per assicurare che la pressione di picco che viene generato corrisponde alla quantità desiderata.

Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato una vitalità macchia per determinare l'effetto di allungamento alla permeabilità della membrana cellulare. L'ottica delle piastre di coltura flessibile a fondo abbiamo utilizzato ci permette di VIew le cellule colorate direttamente sotto il microscopio. Tuttavia, quando si vuole condurre studi immunolabelling direttamente dopo la stiro-infortunio, possono sorgere difficoltà. In primo luogo, la dimensione e lo spessore della piastra possono rappresentare un problema con alcune piattaforme di osservazione al microscopio. In secondo luogo, l'ottica della membrana flessibile del pozzo possono essere un ostacolo per cancellare la visualizzazione.

Nonostante i limiti suddetti, tuttavia, la procedura descritta può essere utilizzata come modello in vitro di lesioni meccaniche della BBB. Lesione cerebrale traumatica (TBI) implica due componenti, vale a dire, l'ischemia e il trauma. Ischemia può verificarsi come una lesione secondaria seguente TBI in casi in cui si abbia una grave perdita di sangue con conseguente bassa pressione sanguigna o come risultato di rigonfiamento cerebrale limitare l'apporto di ossigeno al cervello. E 'considerato come un ritardato, danno non meccanico rappresentazione di processi patologici consecutivi avviati al momento della lesione 25. Il verificarsi di una ipossiagrave trauma cranico opo è comune 26. Ossigeno deprivazione di glucosio (OGD) è il metodo attualmente utilizzato per modellare l'ischemia in vitro. Così, sottoponendo le cellule a OGD come un insulto secondario alle cellule dopo stiramento può imitare l'incidenza di TBI seguito da ischemia. Quindi, per migliorare il nostro attuale modello in vitro di TBI e modello il più vicino possibile ad un TBI reale come avviene in vivo, in futuro ci sarà anche impiegare OGD in combinazione con lesioni stirata.

Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) con il numero di sovvenzione FO 315/4- e del Programma dell'Unione Europea Settimo programma quadro (FP7/2007-2013) Convenzione di sovvenzione n HEALTH-F2-2009-241.778 a CF.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cell Injury Controller IIProgettazione e fabbricazione personalizzate, Virginia, USA&nbsp;
Piastra di coltura Bioflex - Collagene di tipo IFlexcell, Dunn LabortechnikBF - 3001C 
Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796 
Siero fetale di vitello (FCS)PAA LaboratoriesA15110-1333concentrazione finale 10%, inattivato a caldo (30 min a 56 ° C)
L-glutamminaBiochrom AGK0282Conservazione: ≤ -15 ° C
MEM VitaminBiochrom AGK0373Conservazione: ≤ -15 ° C
Na-piruvatoBiochrom AGL0473 
Aminoacidi non essenziali (NEA)Biochrom AGK0293Conservazione a 4 gradi; C
Penicilina/StreptomicinaBiochrom AGA2212Conservazione: ≤ -15 ° C
Siero fetale di vitello, spogliato del carbone (ssFCS)Life Technologies12676-011 
Soluzione di tripsina-EDTAPAA LaboratoriesL11-004Conservazione: ≤ -15 ° C
Image-iT DEAD GreenLife TechnologiesI10291Conservazione: ≤ -15 ° C, protetto dalla luce
Kit di rilevamento di citotossicità PLUS (LDH) Roche4744926001Stoccaggio: ≤ -15 gradi E

Riferimenti

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