Qui descriviamo una procedura per l'immagine di complessi virali in liquido a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a trasmissione.
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Articolo metodologico
In situ TEM di assemblee biologiche in liquido
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Sommario
Abstract
I ricercatori utilizzano regolarmente microscopi elettronici a trasmissione (TM) per esaminare entità biologiche e valutare nuovi materiali. Qui descriviamo un'applicazione aggiuntiva per questi strumenti: la visualizzazione di assemblaggi virali in un ambiente liquido. Questo metodo eccitante e nuovo di visualizzazione delle strutture biologiche utilizza un porta campioni a base microfluidica recentemente sviluppato. Il nostro video articolo dimostra come assemblare e utilizzare un supporto microfluidico per immagini campioni liquidi all'interno di un TEM. In particolare, utilizziamo il rotavirus simiano particelle a doppio strato (DSP) come sistema modello. Descriviamo anche passaggi per rivestire la superficie della camera liquida con biofilm di affinità che lether DLP alla finestra di visualizzazione. Questo ci consente di immaginiare gli assiemi in modo adatto per la determinazione della struttura 3D. Quindi, presentiamo un primo scorcio di particelle subvirali in un ambiente liquido nativo.
Introduzione
Un obiettivo comune di biologi e ingegneri è quello di comprendere il funzionamento interno delle macchine molecolari. I microscopi elettronici a trasmissione (TEM) sono strumenti ideali per visualizzare questi dettagli intricati a risoluzione quasi atomica1-2. Al fine di sostenere il sistema ad alto vuoto di un TEM, i campioni biologici sono tipicamente incorporati in sottili pellicole di ghiacciovitreo 3,zuccheri 4,sali di metallopesante 5o qualche combinazionedi essi 6. Di conseguenza, le immagini di campioni incorporati possono rivelare solo istantanee limitate di processi dinamici.
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Protocollo
1. Preparare i dispositivi di acquisizioneaffinità 16
- Pulire gli E-chips di nitruro di silicio incubandoli in 15 ml di acetone per 2 minuti seguiti da 15 ml di metanolo per 2 min(Figura 1A). Lasciare asciugare i trucioli sotto il flusso d'aria laminare.
- Incubare i trucioli essiccati su una piastra di agitazione riscaldata (senza mescolare) per 1,5 ore a 150 °C, quindi lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Utilizzare siringhe Hamilton per comporre miscele lipidiche in piccoli tubi di vetro per contenere il 25% di cloroformio, 55% DLPC (1,2-dilauroil-fosfoco....
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Risultati
Le immagini rappresentative dei DSP in liquido che utilizzano chip elettronici scaricati in bagliore (Figura 3A) mostrano meno DSP in una determinata area di visualizzazione, presumibilmente a causa della diffusione, rispetto ai DSP arricchiti sui dispositivi Affinity Capture (Figura 3B). L'aggiunta di formato uranil nella camera di imaging migliora il contrasto del campione e quindi la visibilità dei singoli DSP in soluzione(Figura 3C,pannello superiore). Un migliore co.......
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Discussione
Nel nostro lavoro presentato, abbiamo utilizzato l'approccio di acquisizione dell'affinità per tether rotavirus DLL a una piattaforma microfluidica. Ciò ha permesso l'imaging in situ di complessi macromolecolari in un microambiente liquido. L'approccio di cattura è significativo rispetto ad altre tecniche di imaging microfluidico perché localizza campioni biologici nella finestra di imaging per negare grandi problemi diffusivi che sorgono durante la registrazione di immagini in liquido. Tuttavia,.......
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Dichiarazioni
L'autrice, Madeline J. Dukes, è un dipendente della Protochips, Inc.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il Dr. Michael J. Friedlander, direttore del Virginia Tech Carilion Research Institute per aver incoraggiato i nostri sforzi di ricerca. Questo progetto è stato sostenuto da fondi di sviluppo per S.M.M e D.F.K. e in parte dall'iniziativa Nano-Bio dell'Institute for Critical Technology and Applied Science di Virginia Tech.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| E-chip, chip distanziatore | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μ m x 50 μ m finestra |
| E-chip, chip superiore | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μ m x 50 μ m finestra |
| Ni-NTA lipidi | Avanti Polar Lipids | 790404P | Polvere in polvere |
| DLPC (12:0) lipidi | Avanti Polar Lipids | 850335P | Polvere in polvere |
| Palloni volumetrici | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Siringhe Hamilton | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μ l; 1-25 μ l |
| Carta da filtro Whatman #1 | Whatman | 1001 090 | 100 pezzi, 90 mm |
| Piastre di Petri in vetro | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Pipette in vetro Pasteur | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Provette per coltura in vetro | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Metanolo | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Cloroformio | Scienze della microcopia elettronica | 12550 | 100 ml |
| Proteina A con etichetta His, | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q sistema idrico | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Acqua Ultrapura |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Attrezzatura | |||
| Poseidon In situ portacampioni | Protochips, Inc. | FEI | |
| compatibile FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS | FEI Co. | 10 Å/pixel di campionamento a 30.000X | |
| Gatan 655 Stazione di pompaggio a secco | Gatan, Inc. | Punta porta pompa a 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, unità di scarica a bagliore | Ted Pella, Inc. | Modalità di polarità negativa | |
| Piastra di agitazione riscaldata Isotemp | Fisher Scientific | Heat a 150 º C per 1,5 ore |
Riferimenti
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillom....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/50936
