Il labirinto d'acqua radiale a otto bracci è progettato per valutare simultaneamente le prestazioni di riferimento e di memoria di lavoro, richiedendo ai soggetti di utilizzare spunti extra-labirinto per localizzare piattaforme di fuga e rimediare alle limitazioni osservate nei progetti di labirinti a braccio radiale a terra.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Uso di un labirinto d'acqua radiale a otto bracci per valutare la memoria di lavoro e di riferimento dopo una lesione cerebrale neonatale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La memoria di lavoro e di riferimento viene comunemente valutata utilizzando il labirinto a braccio radiale terrestre. Tuttavia, questo paradigma richiede un allenamento preliminare, privazione di cibo e può introdurre confusioni di spunti olfattivi. Il labirinto d'acqua radiale a otto bracci è progettato per valutare simultaneamente le prestazioni di riferimento e di memoria di lavoro, richiedendo ai soggetti di utilizzare segnali extra-labirinto per localizzare le piattaforme di fuga e rimediare alle limitazioni osservate nei progetti di labirinti a bracci radiali a terra. In particolare, ai soggetti è richiesto di evitare i bracci precedentemente utilizzati per la fuga durante ogni giorno di test (memoria di lavoro) nonché di evitare i bracci fissi, che non contengono mai piattaforme di fuga (memoria di riferimento). I rientri in bracci che sono già stati utilizzati per la fuga durante una sessione di test (e quindi la piattaforma di fuga è stata rimossa) e i rientri in bracci di memoria di riferimento sono indicativi di deficit di memoria di lavoro. In alternativa, i primi ingressi nei bracci della memoria di riferimento sono indicativi di deficit della memoria di riferimento. Abbiamo utilizzato questo labirinto per confrontare le prestazioni dei ratti con lesioni cerebrali neonatali e controlli fittizi dopo l'induzione di ipossia-ischemia e abbiamo mostrato deficit significativi sia nella memoria di lavoro che in quella di riferimento dopo undici giorni di test. Questo protocollo potrebbe essere facilmente modificato per esaminare molti altri modelli di compromissione dell'apprendimento.
Introduzione
La memoria di lavoro (WM) corrisponde a un dominio cognitivo critico richiesto per la rappresentazione di oggetti o luoghi durante il comportamento diretto all'obiettivo1. In alternativa, la memoria di riferimento (RM) è necessaria per rappresentazioni temporalmente stabili di tali oggetti o luoghi. La memoria di lavoro e di riferimento è stata a lungo valutata nei roditori utilizzando i paradigmi del labirinto a braccio radiale terrestre2,3. Tuttavia, questi compiti richiedono spesso un pre-allenamento, poiché i ratti non sono predisposti alla corsa spontanea nel labirinto. Ciò può aumentare significativamente il tempo necessario per completare un esperimento e può interferire con i progetti longitudinali sensibili al tempo. Altre limitazioni del labirinto a otto bracci a terra includono i requisiti per la privazione del cibo e la difficoltà di controllare i cambiamenti nei segnali olfattivi lasciati sul labirinto dopo ogni prova. Molte di queste limitazioni sono state superate utilizzando il paradigma del labirinto d'acqua di Morris4, tuttavia storicamente questi progetti sono stati limitati a testare la memoria di riferimento e l'apprendimento spaziale (eccezioni5-9). Il labirinto d'acqua radiale a otto bracci è una versione modificata del labirinto terrestre radiale a otto bracci, che è stato utilizzato per valutare sia la memoria di riferimento che la memoria di lavoro nei ratti e nei topi5-7. A differenza dei tradizionali labirinti terrestri, il labirinto d'acqua radiale a otto bracci non richiede privazione di cibo, riduce al minimo i potenziali segnali olfattivi confondenti e utilizza la motivazione dei soggetti per la fuga come mezzo efficace per valutare il lavoro e fare riferimento all'apprendimento e alla memoria contemporaneamente senza la necessità di un pre-allenamento5-7.
Un'applicazione di questo paradigma è quella di testare i deficit della memoria di lavoro a seguito di lesioni cerebrali neonatali. La ricerca sull'uomo ha dimostrato che i neonati prematuri a rischio di lesioni cerebrali mostrano deficit della memoria di lavoro più tardi nella vita10,11. La lesione cerebrale neonatale può essere modellata nei roditori inducendo ipossia/ischemia (HI) all'inizio dello sviluppo postnatale12-15. Ancora più importante, i deficit di apprendimento spaziale e di memoria di lavoro riscontrati nei neonati a rischio sono paralleli nei roditori che utilizzano il labirinto d'acqua a braccio radiale, rendendolo un modello robusto per lo studio di tali menomazioni8,9. Il labirinto d'acqua radiale a otto bracci consente anche la quantificazione simultanea del riferimento e della memoria di lavoro, rendendolo ideale per il confronto di soggetti con e non lesioni cerebrali in modelli sensibili al tempo (ad esempio durante vedove di sviluppo discrete) o per disegni longitudinali controbilanciati.
In questo protocollo, descriviamo le procedure di test utilizzando un labirinto d'acqua radiale a otto bracci (vedi Figura 1) e dati di esempio per ratti con e senza lesione ipossico-ischemica neonatale. L'ipossia-ischemia (HI) è stata indotta il 7° giorno postnatale dopo la cauterizzazione dell'arteria carotide comune destra e 120 minuti di esposizione all'ossigeno all'8%. Questa procedura chirurgica è stata ampiamente utilizzata per modellare la patologia del prematuro e delle lesioni cerebrali neonatali (per i dettagli vedi12,13,16,17). Mostriamo che il paradigma del labirinto d'acqua a braccio radiale rivela deficit nella memoria di riferimento e nelle capacità della memoria di lavoro dopo una lesione neonatale dell'HI. Nel protocollo attuale, la memoria di riferimento viene valutata utilizzando quattro bracci specifici del labirinto d'acqua radiale a otto bracci, che rimangono costanti ai segnali extra del labirinto durante i test. Questi bracci non contengono mai una piattaforma di fuga, quindi gli ingressi dei soggetti in questi bracci riflettono scarse prestazioni della memoria di riferimento e deficit nell'apprendimento a lungo termine. I restanti quattro bracci contengono tutti piattaforme di fuga all'inizio della giornata, tuttavia ogni piattaforma viene rimossa una volta che l'animale entra con successo in un braccio e fugge dall'acqua5-7. Ciò richiede che l'animale ricordi quali bracci ha inserito nelle quattro prove successive, aumentando la richiesta di memoria di lavoro man mano che ogni piattaforma aggiuntiva viene rimossa. La memoria di lavoro viene valutata esaminando i rientri nei bracci precedentemente utilizzati per la fuga entro lo stesso giorno di test o i rientri nei bracci della memoria di riferimento. Inoltre, questo design utilizza spunti extra-labirinto per localizzare le piattaforme di fuga che riflettono l'apprendimento spaziale dipendente dall'ippocampo. Questo metodo per valutare gli errori di memoria di lavoro e di riferimento è stato originariamente utilizzato da Jarrard et al.18 e da allora è stato ampiamente utilizzato per valutare modelli di roditori di disturbi neurologici legati all'invecchiamento, difficoltà di apprendimento e successive manipolazioni ormonali5,6,7,19,20.
L'obiettivo principale di questo paradigma è valutare il riferimento e la memoria di lavoro, quindi, il design del labirinto d'acqua radiale a otto bracci non dovrebbe essere limitato per testare i deficit dovuti a lesioni cerebrali dello sviluppo. Invece, studi precedenti che utilizzano questo paradigma mostrano che una varietà di modelli di roditori può essere valutata per valutare la patologia dell'apprendimento e della memoria in molti contesti sperimentali5,6,7,18,19,20.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal Rhode Island College Institutional Animal Care and Use Committee e aderiscono alla Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Configurazione del labirinto
- Posiziona indizi extra-labirinto chiari, statici e salienti (forme dipinte, mobili o altre caratteristiche fisse della stanza) intorno al labirinto.
Nota: tutti i segnali extra-labirinto devono rimanere nella stessa posizione per tutta la durata dell'esperimento. - Posizionare il mozzo e i bracci del labirinto a braccio radiale in una vasca di plastica (vedere la tabella delle attrezzature per esempio).
Nota: Il labirinto utilizzato in questo protocollo è costituito da otto bracci rimovibili in acciaio inossidabile fissati a otto supporti centrali fissati a una base circolare in acciaio inossidabile verniciata di nero (vedere la Figura 1 per il diagramma e le dimensioni corrispondenti). La vasca di plastica esemplificata nella Figura 1 ha un diametro interno di 122 cm e un'altezza di 60 cm. - Riempi la vasca con acqua riscaldata a temperatura ambiente (22-26 °C)7.
- Posiziona le piattaforme 1 cm sotto la superficie dell'acqua alle estremità di quattro degli otto bracci.
Nota 1: Per ogni soggetto le posizioni della piattaforma sono fisse per la durata del test. Indipendentemente dalla configurazione, è necessario prestare attenzione per evitare il posizionamento delle piattaforme in più di due bracci adiacenti (non più di due piattaforme devono essere posizionate in bracci adiacenti). Non posizionare una piattaforma nel braccio di partenza.
Nota 2: Le piattaforme nascoste devono essere dipinte dello stesso colore dell'inserto del labirinto per mimetizzarsi con lo sfondo del labirinto.
2. Trasferimento delle materie per i test
- Trasferire i soggetti dal vivaio alla sala di prova mantenendo l'ordine di test designato.
Nota: gli animali devono essere collocati in una gabbia opaca per ridurre lo stress predittorio e prevenire la visione dei segnali della sala di prova. - Una volta nella sala prove, posizionare tutte le gabbie opache del gruppo 1 su un banco o un tavolo di sosta mantenendo l'ordine di prova.
Nota: in uno studio di grandi dimensioni (ad es. 30 soggetti) potrebbe essere meglio suddividere i soggetti in gruppi di test (ad es. 3 gruppi di 10 soggetti ciascuno). Questo dipenderà dalle dimensioni della vostra sala prove e dalla fattibilità del trasporto dei soggetti.
3. Protocollo per tablet digitale per la registrazione delle voci del braccio del labirinto
- Aprire un programma di scrittura PDF sulla tavoletta digitale.
- Importa tutti i modelli di registrazione dei dati presalvati per i soggetti del gruppo 1.
Nota: ogni modello di registrazione deve essere presalvato ed etichettato con numeri specifici di soggetto e di prova (ad es. soggetto 1_trial 1, soggetto 1_trial 2, ecc.) con un totale di quattro modelli per ogni soggetto (prove 1-4). Il modello deve avere una rappresentazione vuota del labirinto e delle posizioni della piattaforma, nonché un luogo in cui registrare il numero del soggetto, il numero della prova, il giorno della prova, la piattaforma di fuga utilizzata e la latenza della prova (vedere la Figura 2). - Apri il modello per la prima prova del tuo primo soggetto.
Nota: questo sistema può essere utilizzato anche con modelli cartacei per ricercatori che non hanno accesso a tablet o programmi per prendere appunti basati su tablet.
4. Test del labirinto d'acqua a braccio radiale
- Se gli animali sono alloggiati in coppia, separare i soggetti prima della sessione di test. Trasferire il primo soggetto del test in una gabbia riscaldante opaca separata.
NOTA: La gabbia deve essere riscaldata a 37 °C utilizzando un termoforo per mantenere la temperatura corporea tra le prove di test. - Prima della prima prova di ciascun soggetto, verificare che il numero di identificazione del soggetto corrisponda al numero del soggetto sulla scheda di registrazione dei dati e assicurarsi che le piattaforme siano posizionate correttamente nel labirinto d'acqua a otto bracci.
- Posizionare il soggetto nel braccio di avviamento rivolto verso la parete del labirinto e avviare il timer.
Nota: Questo protocollo è stato progettato per due sperimentatori, uno per registrare i dati e uno per gestire i soggetti. Durante questa collaborazione, la comunicazione tra gli sperimentatori è fondamentale. È essenziale confermare gli orari di inizio, i numeri dei soggetti e il corretto posizionamento della piattaforma prima di ogni prova. - Rimanere fermi durante ogni prova in una posizione designata nella stanza per mantenere la coerenza dei segnali durante ogni prova.
Nota: è necessario prestare attenzione per evitare segnali salienti inviati (ad es. profumi) durante gli esperimenti e gli sperimentatori devono indossare gli stessi indumenti (camici da laboratorio) ogni giorno per mantenere la coerenza dei segnali. - Registrare ogni ingresso in un braccio apponendo un segno sul braccio corrispondente nel modello di registrazione sulla tavoletta digitale.
Nota: Un'entrata si verifica quando le spalle di un soggetto rompono il piano di apertura del braccio. - Attendere un massimo di 120 secondi affinché il soggetto individui una delle quattro piattaforme. Una volta che l'animale raggiunge la piattaforma, ferma il timer, la prova è completa.
Nota: per mantenere la coerenza, si dice che un soggetto ha raggiunto l'obiettivo quando le sue zampe anteriori sono sulla piattaforma. - Se il soggetto non è in grado di localizzare la piattaforma entro 120 secondi, guidalo attentamente verso la piattaforma più vicina e lascialo rimanere sulla piattaforma per 10 secondi prima della rimozione per assicurarti che l'animale sia a conoscenza della posizione di destinazione.
- Solo il primo giorno, lasciare che il soggetto si sieda sulla piattaforma per 10 secondi dopo ciascuna di tutte e quattro le prove in modo che il soggetto possa fare riferimento ai segnali spaziali.
- Dopo il completamento della prova, rimuovere il soggetto dalla piattaforma sollevandolo delicatamente per il corpo.
- Avviare il timer per l'intervallo di prova di 90 secondi.
- Riposizionare il soggetto nella gabbia individuale sopra il cuscinetto di termoregolazione.
- Registrare la piattaforma specifica utilizzata per la fuga cerchiando la posizione corrispondente sul modello di registrazione dei dati.
- Durante questo intervallo rimuovere la piattaforma di fuga utilizzata dal soggetto nella prova precedente.
- Apri il modello per la prova successiva e contrassegna tutte le piattaforme che sono state utilizzate per la fuga dal soggetto, e quindi rimosse durante le prove precedenti, con un X.
Nota: la marcatura di tutte le piattaforme mancanti prima di una prova successiva è fondamentale per definire i tipi di errore (ad es. memoria di riferimento e/o memoria di lavoro corretta). - Prima di iniziare una prova successiva, confermare il numero dell'oggetto, il numero della prova e le posizioni rimanenti della piattaforma.
- Dopo che l'intervallo di prova di 90 secondi è trascorso, posizionare il soggetto nel braccio di partenza rivolto verso la parete del labirinto e avviare il timer per la prova successiva.
- Ripetere questo processo per le prove 2-4, rimuovendo la piattaforma di fuga raggiunta dopo ogni prova e contrassegnando la sagoma in modo appropriato durante e dopo ogni prova (ad esempio, posizionare e X sulle piattaforme rimosse, indicare le braccia entrate e circondare la piattaforma utilizzata per la fuga).
- Una volta completate tutte e quattro le prove per un soggetto, riposizionare le piattaforme di fuga nei bracci appropriati del labirinto e ripetere il processo di test per il soggetto successivo (fasi di test 4.1-4.17).
- Una volta completato il test per il gruppo 1, esportare i fogli di registrazione dei dati in una cartella per quel giorno di test (ad es. Giorno 1) e salvarli in un sistema di archiviazione file.
Nota: i fogli di registrazione dei dati devono essere esportati prima di iniziare il gruppo di test successivo per ridurre al minimo la possibilità di perdita di dati. - Ripetere per ogni gruppo (fasi di test 2.1-4.19).
5. Variabili dipendenti
- Per ogni prova, contare il numero di voci prime e ripetute in qualsiasi braccio che in precedenza disponeva di una piattaforma. Questo sarà indicato da una X sopra la piattaforma sulla scheda di registrazione dei dati. Questi sono gli errori corretti della memoria di lavoro.
Nota: poiché gli errori corretti della memoria di lavoro dipendono dal ricordare la posizione di una piattaforma che è già stata utilizzata per la fuga ed evitare quel braccio, non è possibile avere un errore di correzione della memoria di lavoro al primo tentativo. - Per ogni conteggio di prova è indicato il numero di primi ingressi in qualsiasi braccio che non ha mai contenuto una piattaforma dal foglio di registrazione dei dati. Si tratta di errori di memoria di riferimento.
- Per ogni conteggio di prova, dal foglio di registrazione dei dati è indicato il numero di voci ripetute in qualsiasi braccio che non ha mai contenuto una piattaforma. Si tratta di errori errati della memoria di lavoro.
- Registra la latenza per raggiungere la piattaforma per ogni prova.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Dati campione del nostro laboratorio mostrano un numero significativamente maggiore di errori di memoria di lavoro negli animali HI rispetto ai controlli al giorno undici del test (t = 2.124, p<0.05, (vedi Figura 3A)). Gli animali HI hanno mostrato anche un numero significativamente maggiore di errori di memoria di riferimento rispetto ai soggetti controllo al giorno undicesimo del test (t = 2.303, p<0.05, (vedi Figura 3B)). Gli errori di memoria di lavoro e quelli di riferimento i...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il paradigma del labirinto d'acqua radiale a otto bracci è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio e da altri per valutare le prestazioni della memoria di lavoro e di riferimento nei ratti con e senza lesioni cerebrali neonatali5-7,18-20. Nel paradigma attuale, la rimozione di una piattaforma di fuga dopo ogni prova aumenta la richiesta di memoria di lavoro (i soggetti hanno meno opzioni di fuga) nelle prove successive. Pertanto, nella quarta prova, rimane solo una piattaforma e la richiesta di me...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano William Martin e il dipartimento d'arte del Rhode Island College per l'assistenza nella fabbricazione del labirinto. Vorremmo anche ringraziare gli studenti del Rhode Island College Katrina Feyerherm, Molly La Rue e Nick Lafond per il lavoro svolto su materie sul labirinto d'acqua a otto bracci. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Rhode Island Idea Network for Biomedical Research excellence (RIINBRE) e del NIH National Center for Research Resources (Grant# P20 RR16457-12). Il supporto è stato fornito anche dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute Of Child Health & Human Development del National Institutes of Health con il numero di premio R15HD077544.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vasca in plastica | Gototanks http://www.gototanks.com | ARM-19455 | Le dimensioni possono variare a seconda delle specie testate o delle esigenze dei singoli laboratori. |
| iPad o altro tablet digitale | Apple Inc. | N/A | |
| http://www.apple.com Notability o altre applicazioni per prendere appunti | Gingerlabs | N/A | http://www.gingerlabs.com Scrittore pdf digitale o programma per prendere appunti |
| Timer digitale | Qualsiasi | N/A | |
| Termoforo isotermico Deltaphase | Braintree Scientific | ASS7D | http://www.braintreesci.com/ |
| Stainless labirinto in acciaio | Fabbricato in casa | N/A |
Riferimenti
- Bunge, S. A., Ochsner, K. N., Desmond, J. E., Clover, G. H., Gabrieli, J. D. Prefrontal regions involved in keeping information in and out of mind. Brain. 124 (Pt 10), 2074-2086 (2001).
- Olton, D., Collison, C., Werz, M. Spatial memory and radial-arm maze performance of rats. Learn Motiv. 8, 289-314 (1977).
- Olton, D., Becker, J., Handelmann, G. Hippocampus, space, and memory. Behav. Brain Sci. 2, 313-365 (1979).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
- Hyde, L. A., Hoplight, B. J., Denenberg, V. H. Water version of the radial-arm maze: learning in three inbred strains of mice. Brain Res. 785 (2), 236-244 (1998).
- Hyde, L. A., Sherman, G. F., Hoplight, B. J., Denenberg, V. H. Working memory deficits in BXSB mice with neocortical ectopias. Physiol. Behav. 70 (1-2), 1-5 (2000).
- Hyde, H. A., Hoplight, L. A., Denenberg, B. J., H, V. In two species, females exhibit superior working memory and inferior reference memory on the water radial-arm maze. Physiol. Behav. 70 (3-4), 311-317 (2000).
- Fitch, R. H., Breslawski, H., Rosen, G. D., Chrobak, J. J. Persistent spatial working memory deficits in rats with bilateral cortical microgyria. Behav. Brain Funct. 4, 45(2008).
- Szalkowski, C. E., et al. Persistent spatial working memory deficits in rats following in utero RNAi of Dyx1c1. Genes Brain Behav. 10 (2), 244-252 (2011).
- Conklin, H. M., Salorio, C. F., Slomine, B. S. Working memory performance following pediatric traumatic brain injury. Brain Inj. 22 (11), 847-857 (2008).
- Luu, T. M., Ment, L., Allan, W., Schneider, K., Vohr, B. R. Executive and memory function in adolescents born very preterm. Pediatrics. 127, 639-648 (2011).
- McClure, M. M., Threlkeld, S. W., Fitch, R. H. Auditory processing and learning/memory following erythropoietin administration in neonatally hypoxic-ischemic injured rats. Brain Res. 1132 (1), 203-209 (2006).
- McClure, M. M., Thrlekeld, S. W., Fitch, R. H. The effects of erythropoietin on auditory processing following neonatal hypoxic-ischemic injury. Brain Res. 1132 (1), 203-209 (2007).
- LaPrairie, J. L., Murphy, A. Z. Long-term impact of neonatal injury in male and female rats: Sex differences, mechanisms and clinical implications. Front. Neuroendocrinol. 31 (2), 193-202 (2010).
- Volpe, J. J. Perinatal brain injury: from pathogenesis to neuroprotection. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 7, 56-64 (2001).
- Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. A model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Ann. N. Y. Acad. Sci. 835, 234-249 (1997).
- McClure, M. M., Peiffer, A. M., Rosen, G. D., Fitch, R. H. Auditory processing deficits in rats with neonatal hypoxic-ischemic injury. Int. J. Dev. Neurosci. 23 (4), 351-362 (2005).
- Jarrard, L., Okaichi, H., Steward, O., Goldschmidt, R. On the role of hippocampal connections in the performance of place and cue tasks: comparisons with damage to the hippocampus. Behav. Neurosci. 98, 946-954 (1984).
- Bimonte-Nelson, H. A., et al. Testosterone, but not nonaromatizable dihydrotestosterone, improves working memory and alters nerve growth factor levels in aged male rats. Exp. Neurology. 181, 301-312 (2003).
- Acosta, J. I., Hiroi, R., Camp, B. W., Talboom, J. S., Bimonte-Nelson, H. A. An update on the cognitive impact of clinically-used hormone therapies in the female rat: Models, mazes and mechanisms. Brain Res. 13 (1514), 18-39 (2013).
- O'Keefe, J., Nadel, L. The hippocampus as a cognitive map. , Clarendon Press. Oxford, England. (1978).
- Whishaw, I. Q., Pasztor, T. J. Rats alternate on a dry-land but not swimming-pool (Morris task) place task: implications for spatial processing. Behav. Neurosci. 114 (2), 442-446 (2000).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
