Articolo metodologico

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

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DOI:

10.3791/50950

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20 dicembre 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I cellulosomi sono complessi multienzimatici progettati per digerire la cellulosa. La SMFS basata su AFM è stata utilizzata per studiare le proprietà meccaniche e la configurazione di ripiegamento degli assemblaggi proteici associati al cellulosoma. Presentiamo un flusso di lavoro completo per l'immobilizzazione delle proteine, l'acquisizione e l'analisi dei dati per studiare le interazioni dei singoli complessi recettore-ligando coinvolti nell'assemblaggio del cellulosoma.

Abstract

I cellulosomi sono complessi multienzimatici discreti utilizzati da un sottoinsieme di batteri e funghi anaerobi per digerire substrati lignocellulosici. L'assemblaggio degli enzimi sulla proteina scaffold non catalitica è diretto dalle interazioni tra una famiglia di coppie recettore-ligando correlate che comprendono moduli interagenti di coesina e dockerina. Il legame estremamente forte tra i moduli coesina e dockerin si traduce in costanti di dissociazione nell'intervallo da picomolare a nanomolare, che può ostacolare misure accurate fuori velocità con i metodi di massa convenzionali. La spettroscopia di forza a singola molecola (SMFS) con il microscopio a forza atomica misura la risposta delle singole biomolecole alla forza e, a differenza di altri metodi di manipolazione a singola molecola (ad esempio le pinzette ottiche), è ottimale per lo studio delle interazioni recettore-ligando ad alta affinità grazie alla sua capacità di sondare il regime ad alta forza (>120 pN). Qui presentiamo il nostro protocollo completo per lo studio degli assemblaggi di proteine cellulosomiali a livello di singola molecola. Utilizzando una topologia proteica derivata dal cellulosoma nativo, abbiamo lavorato con proteine di fusione enzima-dockerina e modulo di legame dei carboidrati (CBM-coesina), ciascuna con un gruppo tiolico libero accessibile in un residuo di cisteina ingegnerizzato. Presentiamo il nostro protocollo di immobilizzazione superficiale sito-specifico, insieme alla nostra procedura di misurazione e analisi dei dati per ottenere parametri di legame dettagliati per il complesso ad alta affinità. Dimostriamo come quantificare le forze di dispiegamento di un singolo sottodominio, le forze di rottura complesse, gli off-rate cinetici e le larghezze potenziali del pozzo di legame. Viene ulteriormente descritta l'applicazione di successo di questi metodi nella caratterizzazione dell'interazione coesina-dockerina responsabile dell'assemblaggio di complessi cellulolitici multidominio.

Introduzione

I cellulosomi sono grandi complessi multienzimatici visualizzati sulla superficie di batteri cellulolitici anaerobi (ad es. C. thermocellum) che si sono evoluti per depolimerizzare in modo efficiente la lignocellulosa della parete cellulare vegetale in oligosaccaridi solubili1. Un attributo centrale dei cellulosomi è l'interazione coesina-dockerina ad alta affinità. Nel paradigma più importante, un modulo di docherina altamente conservato di 60-75 aminoacidi di tipo I è visualizzato all'estremità C-terminale dei vari enzimi batterici. Il modulo dockerin dirige l'assemblaggio di combinazioni sinergiche di enzimi sulla proteina scaffold non catalitica ("scaffoldin"), che comprende una poliproteina di domini di coesina specifici per il modulo dockerin di tipo I. A livelli più elevati, l'architettura cellulosomiale può diventare molto complessa, incorporando coppie alternative di coesina e dockerin (ad esempio tipo II, tipo III) che ancorano le strutture alla superficie cellulare e consentono l'assemblaggio di strutture ramificate contenenti più impalcature2. I vari tipi di coesina-dockerina, pur avendo strutture correlate, mostrano specificità di legame differenziali che sopprimono la reattività crociata con impalcature non intenzionali o componenti di altre specie batteriche produttrici di cellulosoma. Mentre gli approcci bioinformatici hanno identificato con successo migliaia di componenti cellulosomiali unici a livello genetico, sono note relativamente poche strutture proteiche e i meccanismi al lavoro nella determinazione della specificità coesina-dockerina rimangono un'area attiva della ricerca di biologia strutturale.

Dall'invenzione del microscopio a forza atomica (AFM) da parte di Binnig et al.3, varie modalità operative AFM sono state sviluppate e continuamente migliorate, tra cui l'imaging senza contatto, l'imaging in modalità di oscillazione4 e la spettroscopia di forza a singola molecola (SMFS)5,6. La SMFS si è evoluta in una tecnica ampiamente utilizzata per sondare direttamente le singole proteine7-11, gli acidi nucleici12-15 e i polimeri sintetici16-19. In un tipico esperimento SMFS per studiare il legame recettore-ligando20,21, una punta a sbalzo AFM viene modificata con uno dei partner di legame, mentre una superficie di vetro piatta viene modificata con il partner di legame complementare. Il cantilever modificato viene portato a contatto con la superficie permettendo ai partner di legarsi. La base del cantilever viene quindi ritirata a velocità costante e la forza viene misurata utilizzando il metodo di deflessione ottica della leva. Le tracce di dati forza-distanza risultanti mostrano picchi simili a denti di sega se il legame è stato stabilito. Nei casi in cui i partner di legame sono fusi a più domini proteici, ogni picco nella traccia forza-distanza può essere correlato al dispiegamento di un singolo dominio proteico o sottodominio ripiegato, mentre l'ultimo picco corrisponde alla rottura dell'interfaccia di legame proteico. Le posizioni specifiche degli elementi resistenti alla forza possono essere utilizzate come impronta digitale per identificare i vari domini proteici di interesse. Questo metodo può essere utilizzato per interrogare importanti amminoacidi coinvolti nel ripiegamento e nella stabilizzazione delle proteine. In letteratura sono stati riportati molti modelli per trattare il comportamento caratteristico di estensione della forza osservato negli esperimenti SMFS. I modelli più comunemente usati includono la catena a giunzione libera (FJC) modello22, la catena a vite senza fine (WLC) modello18,23-25 e la catena a rotazione libera (FRC) modello25,26.

Nel nostro precedente lavoro11, abbiamo utilizzato la spettroscopia di forza a singola molecola per studiare l'interazione dei moduli di coesina e dockerina. Qui, presentiamo un protocollo sperimentale per la funzionalizzazione di superfici in vetro e cantilever con costrutti proteici enzima-dockerina e CBM-coesina. Presentiamo anche un protocollo SMFS basato su AFM che include procedure di acquisizione e analisi dei dati. Il protocollo descritto può essere facilmente generalizzato ad altri sistemi molecolari e dovrebbe rivelarsi particolarmente utile per i ricercatori interessati a coppie di ligandi recettoriali ad alta affinità.

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Protocollo

Uno schema della geometria di trazione utilizzata in questo studio per analizzare l'interazione coesina-dockerina è mostrato in Figura 1A. Il protocollo di immobilizzazione delle proteine riportato qui per la funzionalizzazione della mensola e del vetrino è una versione modificata della procedura pubblicata in precedenza27. Le proteine sono state espresse da vettori plasmidici in E. coli utilizzando metodi convenzionali. Le proteine sono state progettate con un gruppo tiolo accessibile al solvente, che è stato utilizzato in combinazione con la chimica del maleimide per ancorare la proteina alla superficie del vetrino e della mensola tramite un legame tioetere stabile. I residui di cisteina ingegnerizzati sia nelle proteine di fusione CBM-coesina che xilanasi-dockerina si trovavano sul lato N-terminale delle proteine, lontano dall'interfaccia di legame coesina-dockerina11. Una panoramica dettagliata dei legami chimici impiegati nell'immobilizzazione delle proteine è mostrata in Figura 1B.

1. Preparazione del campione

  1. Buffer
    1. Preparare tampone Tris salino con calcio (TBS): 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7.2
    2. Preparare tampone borato di sodio: 50 mM Na2B4O7, pH 8.5
      Il diagramma di flusso che mostra i passaggi della preparazione del campione è riportato in Figura 2.
      Durante la manipolazione di levette e coprivetri, si raccomandano pinzette autobloccanti.
  2. Aminosilanizzazione del coprivetro (circa 1,5 ore)
    1. Posizionare il coprivetro (diametro 24 mm, spessore 0,5 mm) in un supporto in PTFE.
    2. Sonicare il coprivetro in etanolo : acqua ultrapura 1:1 (v/v) per 15 min.
    3. Risciacquare il coprivetro con acqua ultrapura.
    4. Immergere il coprivetro in soluzione piranha (1:1 H2SO4 (concentrato) : H2O2 (30%) (v/v)) per 30 min, quindi risciacquare accuratamente con acqua ultrapura. Asciugare il coprivetro sotto un flusso delicato di N2. Attenzione: la soluzione piranha è estremamente corrosiva. È obbligatorio l'uso di protezioni per occhi e pelle.
    5. Immergere il coprivetro in una miscela 45:5:1 etanolo : acqua ultrapura : 3-aminopropil dimetil etossil silano (v/v). Posizionare su agitatore a temperatura ambiente per 60 min (circa 50 giri/min).
    6. Immergere il coprivetro in sequenza in etanolo e acqua ultrapura (2 volte ciascuno). Asciugare il coprivetro sotto un flusso delicato di N2.
    7. Incubare il coprivetro in forno (80 °C per 30 min).
    8. I coprivetri silanizzati possono essere conservati sotto argon per un massimo di 6 settimane.
  3. Aminosilanizzazione delle levette (circa 1,5 ore)
    NOTA: Il protocollo descritto per la funzionalizzazione delle punte è adatto a punte di levette in silicio.
    1. Posizionare le levette su un vetrino pulito. Trattare con UV-ozono per 15 min.
    2. Immergere le levette per 3 min in una miscela 1:1 etanolo : 3-aminopropil dimetil etossil silano (v/v) con una quantità catalitica (0,25%, v/v) di acqua ultrapura.
    3. Risciacquare le levette con agitazione delicata in sequenza per 60 sec in becker contenenti toluene, etanolo e acqua ultrapura. Asciugare con attenzione le levette su carta da filtro tra un risciacquo e l'altro.
    4. Posizionare le levette su un vetrino pulito e incubare in forno (80 °C per 30 min).
  4. Riduzione dei disolfuri proteici (circa 3 ore)
    Tutte le soluzioni devono essere preparate per ottenere circa 30 µl di proteina diluita per levetta e 20 µl di proteina diluita per coprivetro. Le soluzioni proteiche devono essere miscelate con il gel riducente Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) in rapporto 1:2 (v/v).
    1. Preparare aliquote di perle riducenti TCEP in microprovette. Si raccomanda di tagliare le punte delle micropipette con forbici per allargare il diametro dell'apertura durante il travaso della sospensione di perle TCEP.
    2. Risciacquare la sospensione di perle TCEP con 1 ml di tampone TBS e centrifugare a 850 rcf per 3 min.
    3. Rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante con una micropipetta.
    4. Ripetere i passaggi 1.4.2-1.4.3 due volte.
    5. Applicare la soluzione proteica concentrata (1-10 mg/ml) sulle perle TCEP (rapporto 1:2 proteina : sospensione di perle TCEP (v/v)) e miscelare delicatamente agitando con la punta della micropipetta. Evitare di introdurre bolle d'aria.
    6. Incubare la miscela di sospensione proteina/perle TCEP su un agitatore rotante per 2,5 ore.
  5. PEGilazione di coprivetri e levette (circa 1,5 ore)
    1. Prima della modifica con i linker NHS-PEG-maleimide, immergere le levette e i coprivetri aminosilanizzati in tampone borato di sodio (pH 8,5) per 45 min per deprotonare i gruppi amminici primari sulla superficie.
    2. Assicurarsi che la polvere di NHS-PEG-maleimide sia stata portata a temperatura ambiente prima di aprire il contenitore e pesare la quantità necessaria per una soluzione 25 mM. Il NHS-PEG-maleimide non utilizzato deve essere conservato sotto argon a -20 °C. Sono necessari circa 30 µl di soluzione polimerica per levetta e 90 µl per 2 coprivetri (accoppiati insieme).
    3. Dopo aver pesato il NHS-PEG-maleimide da 5 kDa, aggiungere tampone borato di sodio e vortexare per ottenere una soluzione 25 mM.
      Nota: La soluzione deve essere utilizzata il più rapidamente possibile a causa della vita media estremamente breve del gruppo NHS a pH 8,5. Le operazioni di vortex e di trasferimento del liquido sulle levette/coprivetri devono essere completate entro 1-2 min.
    4. Incubare le levette in gocce da 30 µl di soluzione NHS-PEG-maleimide in una piastra di Petri. Per i coprivetri, posizionare 90 µl di soluzione NHS-PEG-maleimide su un singolo coprivetro e aggiungere un secondo coprivetro in sovrapposizione, creando un sandwich di coprivetri con la soluzione NHS-PEG-maleimide al centro.
    5. Incubare le levette e i coprivetri con la soluzione NHS-PEG-maleimide in un'atmosfera satura di vapore acqueo a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Coniugazione proteica (circa 2 ore)
    Fondamentale: Minimizzare l'esposizione delle levette e dei coprivetri PEGilati all'aria.
    1. Centrifugare le soluzioni di proteina ridotta con perle TCEP a 100 rcf per 1 min e raccogliere il soprannatante.
    2. Diluire la soluzione proteica con TBS. L'obiettivo è ottenere una concentrazione proteica durante la coniugazione superficiale compresa tra 0,5-2 mg/ml. Mettere da parte le soluzioni proteiche ridotte e diluite per alcuni minuti mentre si risciacquano levette e coprivetri.
    3. Risciacquare levette e coprivetri in tre becker consecutivi contenenti acqua ultrapura.
    4. Rimuovere con attenzione il liquido residuo dai coprivetri toccandone delicatamente i bordi con carta da filtro sotto un flusso delicato di N2. Rimuovere con attenzione il liquido residuo dalle levette toccandole con carta da filtro. Applicare immediatamente la soluzione proteica diluita.
    5. Montare i coprivetri in un portacampioni adeguato compatibile con lo strumento AFM.
    6. Incubare i coprivetri e le levette PEGilati con le rispettive soluzioni proteiche diluite a temperatura ambiente per 1-2 ore.
    7. Risciacquare le levette in tre becker consecutivi con TBS per rimuovere le proteine non legate. Risciacquare i coprivetri con pipetta almeno 10 volte.
    8. Conservare levette e coprivetri in TBS prima delle misurazioni.

2. Acquisizione dei dati

In questo lavoro, è stato utilizzato un AFM su misura28 controllato da un controller MFP-3D AFM di Asylum Research con un software Igor Pro scritto appositamente. La deflessione della mensola è misurata mediante il metodo di deflessione del fascio ottico29. I protocolli forniti per la preparazione del campione e l'analisi dei dati sono applicabili indipendentemente dal modello esatto di AFM utilizzato. Tuttavia, il modello di AFM deve essere adatto per effettuare misurazioni in liquidi e supportare un intervallo di velocità accessibile sul piezoelettrico z di circa 200-5.000 nm/sec.

  1. Montare la mensola funzionalizzata e la superficie di vetro sul microscopio a forza atomica (AFM). Durante l'intero procedimento, la superficie deve rimanere ricoperta di tampone. Quando si monta la mensola, minimizzare l'esposizione all'aria. Dopo un corretto allineamento del fascio laser, lasciare che il sistema raggiunga l'equilibrio per almeno 30 minuti per ridurre gli effetti di deriva e riallineare se necessario.
  2. Registrare uno spettro di rumore termico con la mensola posizionata lontano dalla superficie, ovvero in assenza di effetti di smorzamento.
  3. Utilizzare un metodo poco invasivo, come l'approccio acustico, per individuare la superficie senza danneggiare la punta della mensola prima della misurazione. Se possibile, avvicinare manualmente la mensola alla superficie e utilizzare delle cuffie per ascoltare il rumore termico sul segnale di deflessione grezzo proveniente dal controllore AFM. Non appena la mensola si avvicina alla superficie, è udibile un cambiamento distinto nel suono.
    Nota: La punta della mensola dovrebbe ora trovarsi a una distanza di 2-5 µm dalla superficie. La natura del cambiamento del suono dipende dalla mensola utilizzata. La frequenza di risonanza della mensola usata in questo studio è di circa 25 kHz in acqua, al di sopra della gamma udibile dall'uomo. A causa degli effetti di smorzamento vicino alla superficie, la risonanza si sposta verso frequenze più basse, portando la risonanza della mensola nell'intervallo udibile. Di conseguenza, si percepisce un aumento apparente di frequenza e intensità del suono.
    Nel caso in cui non sia disponibile un'uscita audio del segnale di deflessione, la superficie può essere avvicinata tramite il piezoelettrico in direzione z mentre è attivo un feedback sul segnale di deflessione. Non appena il segnale di deflessione aumenta di una quantità definita a causa dell'indentazione della superficie, l'avvicinamento viene interrotto.
  4. Determinare la sensibilità inversa del leva ottica (InvOLS), che rappresenta la distanza di spostamento della punta (in nm) per volt di segnale di deflessione. Per farlo, effettuare un'indentazione sulla superficie con la punta della mensola. Si raccomanda un valore di set point di deflessione corrispondente a uno spostamento della punta della mensola di circa 3 nm.
  5. Determinare la costante elastica della mensola adattando una funzione di risposta di oscillatore armonico semplice allo spettro di rumore termico, secondo il teorema di equipartizione30,31.
  6. Inizializzare una procedura sperimentale. Per questo studio, è stato utilizzato il seguente insieme di parametri di misurazione: velocità di avvicinamento: 3.000 nm/sec; forza di indentazione: 180 pN; tempo di permanenza sulla superficie: 10 msec; velocità di ritrazione: 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 µm/sec con frequenze di campionamento rispettivamente di 2.000, 5.000, 15.000, 20.000 Hz; distanza di ritrazione: 500 nm.
    Nota: La frequenza di campionamento non dovrebbe essere impostata superiore a 10 punti/nm per evitare sovracampionamento e mantenere dimensioni dei dati ragionevoli.
  7. Dopo ogni tracciato forza-distanza, attivare gli stadi piezoelettrici in direzione x e y per esporre una nuova posizione della superficie alla mensola in ciascuna curva forza-distanza. Questa tecnica permette di campionare un'area più ampia della superficie del vetrino durante misurazioni a lungo termine.
  8. Utilizzare una riazzerazione periodica dello stadio di deflessione (ovvero posizione del fotodiodo) e dell'altezza del telaio piezoelettrico in direzione z durante misurazioni a lungo termine, nel caso in cui il segnale di deflessione vada fuori scala o si perda il contatto con la superficie.
  9. Al termine della serie di misurazioni, eseguire un'altra misurazione di InvOLS con una forza di indentazione significativamente maggiore rispetto a quella utilizzata prima delle misurazioni, al fine di ottenere un valore di InvOLS più preciso.
  10. Registrare un ulteriore spettro di rumore termico lontano dalla superficie. Determinare la costante elastica al termine della sessione sperimentale.

3. Analisi dei dati

Il diagramma di flusso in Figura 3 illustra il processo di analisi dei dati. Eseguire tutte le manipolazioni dei dati utilizzando un pacchetto software appropriato, come Igor Pro o MATLAB. Convertire innanzitutto il segnale grezzo proveniente dal rivelatore in unità di forza e correggere l'offset e la deriva. Successivamente, utilizzare modelli di elasticità dei biopolimeri per localizzare le barriere energetiche nei percorsi di svolgimento e identificare i sottodomini proteici. Infine, si ottengono i parametri cinetici ed energetici dell'interazione recettore-legante.

  1. Conversione delle unità e correzioni dei dati
    1. Moltiplicare il segnale di deflessione grezzo (volt) per l'InvOLS (nm/volt) e per la costante elastica (pN/nm) per convertire la tensione del rilevatore in unità di forza.
    2. Correggere i dati in modo che la forza misurata sul cantilever scarico sia pari a zero pN, calcolando prima la media dei valori di forza corrispondenti all'ultimo 10% della traccia forza-distanza (acquisita più lontano dalla superficie) e sottraendo successivamente tale media da tutti i valori di forza nella traccia.
    3. Correggere ogni traccia lungo l'asse x in modo che il primo punto di intersezione con l'asse della distanza avvenga a una distanza di 0 nm.
    4. L'InvOLS dipende dalla posizione del punto laser sul cantilever. Anche piccole deriva del sistema di lettura ottica possono causare variazioni evidenti dell'InvOLS quando l'area del cantilever è comparabile alle dimensioni del punto laser. Correggere questo effetto analizzando il rumore del segnale di deflessione a forza nulla. Assumendo condizioni ambientali costanti, il rumore sul segnale di deflessione è direttamente proporzionale all'InvOLS.
      1. Misurare il valore quadratico medio (RMS) della deflessione (livello di rumore a forza nulla) dell'ultimo 10% di ogni traccia forza-distanza.
      2. Tracciare il grafico del rumore in funzione del numero della curva e applicare un'adeguata curva di interpolazione. Tipicamente, un'interpolazione esponenziale della forma Formula di decadimento esponenziale, N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i), rappresentazione matematica. funziona meglio, dove N è il rumore, ni è il numero della curva, e N0 e k sono parametri di adattamento. Un'interpolazione lineare può essere appropriata anche per alcuni insiemi di dati.
      3. Determinare un fattore di scala (SF) per ogni curva:

        Equazione 1:
        equazione di equilibrio statico; (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C); formula matematica
        dove ni è il numero della curva, nf è il numero dell'ultima curva, e C è un valore di offset.
      4. Dividere successivamente tutti i valori di forza di ogni singola curva per il fattore di scala. Questa procedura scala ogni curva in base al rapporto tra il valore RMS del rumore della curva corrente e il valore RMS del rumore dell'ultima traccia acquisita immediatamente prima della misura dell'InvOLS.
      5. Eseguire una correzione della deflessione per trasformare l'asse della distanza (z) in estensione molecolare (z*). Questo tiene conto della flessione del cantilever sotto carico, che riduce la distanza tra la punta del cantilever e il campione rispetto al valore riportato dalla posizione del sensore z-piezo.

        Equazione 2:
        equazione di equilibrio statico, z* = z - F/k, formula; calcoli fisici, analisi della forza
        Dove z è la posizione misurata del sensore z, F è la forza agente sul cantilever e k è la costante elastica.
  2. Analisi della lunghezza di contorno
    La lunghezza di contorno di una proteina è la massima lunghezza estesa della catena polipeptidica. Lo stato di ripiegamento di una proteina si riferisce alla sua geometria e alla distanza tra le estremità, determinata dalla struttura secondaria e terziaria. La lunghezza di contorno di una proteina è direttamente correlata al suo stato di ripiegamento9,25,32. La posizione di specifiche rottura nelle tracce forza-estensione varia ampiamente a causa della polidisperità dei linker PEG, nonché di parametri esterni come temperatura, proprietà del tampone e velocità di carico. Ciò complica l'analisi diretta dei dati, ma può essere superato trasformando i dati forza-estensione nello spazio della lunghezza di contorno. Questa tecnica consente di effettuare medie su grandi insiemi di dati e permette l'uso del riconoscimento automatico di schemi per identificare eventi caratteristici di svolgimento. È quindi possibile classificare singole tracce di forza in base al tipo di interazione osservata. La seguente procedura precedentemente descritta25 viene utilizzata per trasformare i dati forza-estensione nello spazio della lunghezza di contorno.
    1. Risolvere il modello WLC (Equazione 3)23 per la lunghezza di contorno L a lunghezza di persistenza fissa p porta all'Equazione 4, che fornisce la lunghezza di contorno L(x,u). Qui, x è la distanza e u=F*p/kBT, dove kB è la costante di Boltzmann e T è la temperatura. Possono essere considerate solo soluzioni reali. Vincoli aggiuntivi sono x, F>0, L>0, x>0;

      Equazione 3:
      Formula forza-estensione, F(x,L), equazione di fisica polimerica, illustra l'elasticità entropica.

      Equazione 4:
      Equilibrio statico, L(x,u), formula complessa, diagramma didattico, interpretazione espressione analitica.
      dove,
      Equazione della funzione polinomiale \( g(u) \), analisi matematica, calcolo simbolico.
    2. Tracciare i punti dati trasformati in un grafico forza contro lunghezza di contorno. Applicare una soglia di forza di circa 10 pN per escludere il rumore. Le interazioni non specifiche possono essere escluse applicando un filtro passa-alto sulla lunghezza. Costruire un istogramma delle lunghezze di contorno.
    3. Effettuare una cross-correlazione33 degli istogrammi ottenuti con un istogramma modello e spostare lungo l'asse x per correggere la polidisperità del PEG. Utilizzare i valori di correlazione risultanti per misurare la somiglianza tra tracce di dati individuali. In questo modo, le tracce di dati possono essere suddivise in classi predefinite per semplificare ulteriori analisi.
    4. Utilizzare una tecnica simile per individuare caratteristiche ripetute in una singola traccia mediante autocorrelazione, ad es. per lo svolgimento multiplo di domini Ig.
    5. Classificare manualmente le tracce per analizzare altri eventi di svolgimento.
  3. Analisi del tasso di carico
    Estrarre informazioni cinetiche ed energetiche sulla dissociazione recettore-legante applicando modelli adeguati allo spettro di forza, cioè il grafico forza di rottura contro ln(tasso di carico).
    1. Per una data velocità di trazione, determinare la forza di rottura e il tasso di carico per gli eventi di rottura di interesse:
      1. Eseguire un'interpolazione lineare su una traccia forza-tempo nelle vicinanze dell'evento di rottura di interesse. Determinare il tasso di carico dalla pendenza dell'interpolazione lineare al picco. Ripetere questa procedura per ogni traccia che mostra l'evento di rottura di interesse.
      2. Determinare la forza di rottura più probabile applicando un'interpolazione gaussiana a un istogramma delle forze di rottura. Sono possibili funzioni di interpolazione alternative.
      3. Determinare il tasso di carico più probabile.
    2. Ripetere i passaggi 3.3.3.1 - 3.3.3.3 per tutte le velocità di trazione.
    3. Tracciare le forze di rottura più probabili in funzione del logaritmo naturale dei tassi di carico più probabili per ottenere lo spettro di forza.
    4. Applicare un modello teorico adeguato allo spettro di forza per estrarre parametri cinetici ed energetici (Figura 4C). In molti casi, può essere utilizzato il modello lineare di Bell-Evans20,34, che fornisce buone stime per koff, il tasso di dissociazione in assenza di forza, e Dx, la distanza dallo stato di transizione lungo la coordinata di reazione, come mostrato nell'Equazione 5.

      Equazione 5:
      equazione statica della forza ⟨F⟩, k_B T/Δx, analisi della formula per esperimenti di fluttuazione termica

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Risultati

Abbiamo utilizzato la procedura descritta per studiare una coppia coesina-dockerina di tipo I proveniente da C. thermocellum. Dopo il legame riuscito tra la coppia coesina-dockerina, i tracciati forza-distanza registrati hanno mostrato schemi caratteristici di picchi. Un tracciato tipico è mostrato in Figura 4a. Ogni picco nel tracciato rappresenta lo svolgimento di un singolo sottodominio proteico, con l'ultimo picco che corrisponde alla dissociazione del complesso recettore-legante.

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Discussione

Per ottenere dati significativi dagli esperimenti di spettroscopia di forza di una singola molecola, è fondamentale ottenere geometrie di trazione ben definite e riproducibili. Il protocollo qui utilizzato si traduce nell'immobilizzazione sito-specifica di complessi proteici in una geometria di trazione definita.

I cantilever utilizzati in questo studio sono stati scelti per la loro sensibilità alla forza e l'elevata frequenza di risonanza in acqua. Inoltre, la piccola curvatura della punta di...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il finanziamento di una sovvenzione avanzata del Consiglio Europeo della Ricerca a Hermann Gaub. Michael A. Nash ringrazia con gratitudine il finanziamento da parte di Society in Science - The Branco Weiss Fellowship program. Gli autori ringraziano Edward A. Bayer, Yoav Barak e Daniel B. Fried del Weizmann Institute of Science per aver generosamente fornito le proteine utilizzate in questo studio. Gli autori ringraziano Hermann E. Gaub, Elias M. Puchner e Stefan W. Stahl per le utili discussioni.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-Aminopropil dimetil etossisilanoABCR GmbHAB110423
5 kDa NHS-PEG-maleimmideRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP Gel riducente del disolfuroThermo Scientific, Pierce77712www.thermoscientific.com/pierce
Tris(idrossimetil)aminometano
BioLever mini cantilever in nitruro di silicioOlympusBL-AC40TS-C2Lotti morbidi
XYZ Attuatori piezoelettriciPhysik Instrumente GmbH
Infrarossi " ampio spettro" Laser IRSuperlum
MFP-3D AFM ControllerRicerca Asilo
Igor Pro 6.31WavemetricsAcquisizione e analisi dati
: Cloruro
sodio, Cloruro
pHmetro
Borato
Pinzette
CopriocchialiThermo Scientific, Menzel-Glä ser24 mm di diametro, 0,5 mm di spessore
PTFE portacampionisu misura
Bagno
Purezza analiticadell'etanolo
Acido solforico (concentrato)purezza analitica
Perossido di idrogeno (30%)purezza analitica
Agitatore orbitale
Toluenepurezza analitica Carta
da filtro
Vetrini Microprovette
Micropipette
Centrifugaadatta per microprovette
Rotatore
di Petri
Bicchieri
Microscopio
: didi calcio, , di sodiosonicatorePiastre ottico

Riferimenti

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