Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

I cellulosomi sono grandi complessi multienzimatici visualizzati sulla superficie di batteri cellulolitici anaerobi (ad es. C. thermocellum) che si sono evoluti per depolimerizzare in modo efficiente la lignocellulosa della parete cellulare vegetale in oligosaccaridi solubili¹. Un attributo centrale dei cellulosomi è l'interazione coesina-dockerina ad alta affinità. Nel paradigma più importante, un modulo di docherina altamente conservato di 60-75 aminoacidi di tipo I è visualizzato all'estremità C-terminale dei vari enzimi batterici. Il modulo dockerin dirige l'assemblaggio di combinazioni sinergiche di enzimi sulla proteina scaffold non catalitica ("scaffoldin"), che comprende una poliproteina di domini di coesina specifici per il modulo dockerin di tipo I. A livelli più elevati, l'architettura cellulosomiale può diventare molto complessa, incorporando coppie alternative di coesina e dockerin (ad esempio tipo II, tipo III) che ancorano le strutture alla superficie cellulare e consentono l'assemblaggio di strutture ramificate contenenti più impalcature². I vari tipi di coesina-dockerina, pur avendo strutture correlate, mostrano specificità di legame differenziali che sopprimono la reattività crociata con impalcature non intenzionali o componenti di altre specie batteriche produttrici di cellulosoma. Mentre gli approcci bioinformatici hanno identificato con successo migliaia di componenti cellulosomiali unici a livello genetico, sono note relativamente poche strutture proteiche e i meccanismi al lavoro nella determinazione della specificità coesina-dockerina rimangono un'area attiva della ricerca di biologia strutturale.

Dall'invenzione del microscopio a forza atomica (AFM) da parte di Binnig et al.³, varie modalità operative AFM sono state sviluppate e continuamente migliorate, tra cui l'imaging senza contatto, l'imaging in modalità di oscillazione⁴ e la spettroscopia di forza a singola molecola (SMFS)^5,6. La SMFS si è evoluta in una tecnica ampiamente utilizzata per sondare direttamente le singole proteine^7-11, gli acidi nucleici^12-15 e i polimeri sintetici^16-19. In un tipico esperimento SMFS per studiare il legame recettore-ligando^20,21, una punta a sbalzo AFM viene modificata con uno dei partner di legame, mentre una superficie di vetro piatta viene modificata con il partner di legame complementare. Il cantilever modificato viene portato a contatto con la superficie permettendo ai partner di legarsi. La base del cantilever viene quindi ritirata a velocità costante e la forza viene misurata utilizzando il metodo di deflessione ottica della leva. Le tracce di dati forza-distanza risultanti mostrano picchi simili a denti di sega se il legame è stato stabilito. Nei casi in cui i partner di legame sono fusi a più domini proteici, ogni picco nella traccia forza-distanza può essere correlato al dispiegamento di un singolo dominio proteico o sottodominio ripiegato, mentre l'ultimo picco corrisponde alla rottura dell'interfaccia di legame proteico. Le posizioni specifiche degli elementi resistenti alla forza possono essere utilizzate come impronta digitale per identificare i vari domini proteici di interesse. Questo metodo può essere utilizzato per interrogare importanti amminoacidi coinvolti nel ripiegamento e nella stabilizzazione delle proteine. In letteratura sono stati riportati molti modelli per trattare il comportamento caratteristico di estensione della forza osservato negli esperimenti SMFS. I modelli più comunemente usati includono la catena a giunzione libera (FJC) modello²², la catena a vite senza fine (WLC) modello^18,23-25 e la catena a rotazione libera (FRC) modello^25,26.

Nel nostro precedente lavoro¹¹, abbiamo utilizzato la spettroscopia di forza a singola molecola per studiare l'interazione dei moduli di coesina e dockerina. Qui, presentiamo un protocollo sperimentale per la funzionalizzazione di superfici in vetro e cantilever con costrutti proteici enzima-dockerina e CBM-coesina. Presentiamo anche un protocollo SMFS basato su AFM che include procedure di acquisizione e analisi dei dati. Il protocollo descritto può essere facilmente generalizzato ad altri sistemi molecolari e dovrebbe rivelarsi particolarmente utile per i ricercatori interessati a coppie di ligandi recettoriali ad alta affinità.

Uno schema della geometria di trazione utilizzata in questo lavoro per sondare l'interazione coesina-dockerin è mostrato nella Figura 1A. Il protocollo di immobilizzazione delle proteine qui riportato per la funzionalizzazione a sbalzo e in vetro di copertura è una versione modificata della procedura pubblicata in precedenza²⁷. Le proteine sono state espresse da vettori plasmidici in E. coli utilizzando metodi convenzionali. Le proteine sono state progettate con un gruppo tiolico accessibile al solvente, che è stato utilizzato in combinazione con la chimica maleimmidica per legare la proteina tramite un legame tioetere stabile alla superficie del vetro di copertura e al cantilever. I residui di cisteina ingegnerizzati in entrambe le proteine di fusione CBM-coesina e xilanasi-dockerin erano localizzati verso il lato N-terminale delle proteine, lontano dall'interfaccia di legame coesina-dockerina¹¹. Una panoramica dettagliata del legame chimico impiegato nell'immobilizzazione delle proteine è mostrata nella Figura 1B.

1. Preparazione del campione

1. Buffer
   1. Preparare soluzione salina tamponata Tris integrata con calcio (TBS): 25 mM TRIS, 75 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,2
   2. Preparare il tampone borato di sodio: 50 mM Na₂B₄O₇, pH 8,5
      Il diagramma di flusso del processo che mostra le fasi di preparazione del campione è mostrato nella Figura 2.
      Quando si maneggiano i cantilever e i vetri di copertura, si consiglia una pinzetta autobloccante.
2. Aminosilan del vetro di copertura (circa 1,5 ore)
   1. Posizionare il vetro di copertura (24 mm di diametro, 0,5 mm di spessore) in un supporto in PTFE.
   2. Vetro di copertura sonicato in etanolo 1:1: acqua ultrapura (v/v) per 15 min.
   3. Sciacquare il vetro di copertura con acqua ultrapura.
   4. Mettere il vetro di copertura in una soluzione piranha (1:1 H₂SO₄ (concentrato) : H₂O₂ (30%) (v/v)) per 30 minuti, quindi risciacquare accuratamente con acqua ultrapura. Asciugare il vetro di copertura sotto un getto delicato di N₂. Attenzione: la soluzione di piranha è estremamente corrosiva. È necessaria una protezione per gli occhi e la pelle.
   5. Immergere il vetro di copertura in etanolo 45:5:1 : acqua ultrapura : 3-amminopropil dimetil etossisilano (v/v). Porre su uno shaker a RT per 60 min (circa 50 giri/min).
   6. Immergere il vetro di copertura in sequenza in etanolo e acqua ultrapura (2 volte ciascuno). Asciugare il vetro di copertura sotto un getto delicato di N₂.
   7. Cuocere il vetro di copertura in forno (80 °C per 30 min).
   8. I vetrini silanizzati possono essere conservati sotto argon per un massimo di 6 settimane.
3. Aminosilan dei cantilever (circa 1,5 ore)
   NOTA: Il protocollo presentato per la funzionalizzazione della punta è appropriato per le punte a sbalzo in silicio.
   1. Posizionare i cantilever su un vetrino pulito. Trattare con ozono UV per 15 min.
   2. Immergere i cantilever per 3 minuti in etanolo 1:1: 3-amminopropil dimetil etossisilano (v/v) con una quantità catalitica (0,25%, (v/v)) di acqua ultrapura.
   3. Sciacquare i cantilever con una leggera agitazione in sequenza per 60 secondi in becher di toluene, etanolo e acqua ultrapura. Asciugare accuratamente i cantilever su carta da filtro tra un risciacquo e l'altro.
   4. Posizionare le leve su un vetrino pulito e cuocere (80 °C per 30 min).
4. Riduzione del disolfuro proteico (circa 3 ore)
   Tutte le soluzioni devono essere preparate in modo da ottenere circa 30 μl di proteina diluita per cantilever e 20 μl di proteina diluita per vetro di copertura. Le soluzioni proteiche devono essere miscelate con il gel riducente disolfuro di Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) in un rapporto di 1:2 (v/v).
   1. Preparare aliquote di microsfere di riduzione del disolfuro di TCEP in microprovette. Si consiglia di tagliare i puntali delle micropipette con le forbici per allargare il diametro del foro durante il pipettaggio del liquame di perline TCEP.
   2. Sciacquare l'impasto liquido di perle TCEP con 1 ml di tampone TBS e centrifugare a 850 rcf per 3 minuti.
   3. Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante con una micropipetta.
   4. Ripetere i passaggi 1.4.2-1.4.3 2x.
   5. Applicare una soluzione proteica concentrata (1-10 mg/ml) sulle perle di TCEP (proteina 1:2: impasto di perle di TCEP (v/v)) e mescolare delicatamente mescolando con la punta della micropipetta. Evitare l'introduzione di bolle d'aria.
   6. Mettere la miscela di liquame di perle di proteine/TCEP su un rotatore per 2,5 ore.
5. PEGilazione di vetri di copertura e cantilever (circa 1,5 ore)
   1. Prima della modifica con i linker NHS-PEG-maleimmide, immergere i cantilever aminosilanizzati e coprire i vetri in tampone borato di sodio (pH 8,5) per 45 minuti per deprotonare i gruppi amminici primari sulla superficie.
   2. Assicurarsi che la polvere di NHS-PEG-maleimmide sia riscaldata fino a RT prima di aprire il tappo e pesare la quantità appropriata per una soluzione da 25 mM. La maleimmide NHS-PEG non utilizzata deve essere conservata sotto argon a -20 °C. Sono necessari circa 30 μl di soluzione polimerica per cantilever e 90 μl per 2 vetri di copertura (inseriti insieme).
   3. Dopo aver pesato i 5 kDa di NHS-PEG-maleimmide, aggiungere il tampone borato di sodio e il vortex per ottenere una soluzione da 25 mM.
      Nota: la soluzione deve essere utilizzata il più rapidamente possibile a causa dell'emivita estremamente breve dell'NHS a pH 8,5. Il vortice e il trasferimento del liquido sui cantilever/vetri di copertura devono essere completati entro 1-2 minuti.
   4. Incubare i cantilever in goccioline da 30 μl di soluzione NHS-PEG-maleimmide in una piastra di Petri. Per i vetri di copertura, posizionare 90 μl di soluzione NHS-PEG-maleimmide su un singolo vetro di copertura e aggiungere un secondo vetro di copertura sopra creando un sandwich di vetro di copertura con la soluzione NHS-PEG-maleimmide al centro.
   5. Incubare i cantilever/vetri di copertura con la soluzione NHS-PEG-maleimmide in un'atmosfera satura d'acqua a RT per 1 ora.
6. Coniugazione delle proteine (circa 2 ore)
   Critico: Ridurre al minimo l'esposizione all'aria dei cantilever PEGilati e dei vetri di copertura.
   1. Centrifugare TCEP-bead/soluzioni proteiche ridotte a 100 rcf per 1 minuto e raccogliere il surnatante.
   2. Diluire la soluzione proteica con TBS. Puntare a una concentrazione proteica durante la coniugazione superficiale in un intervallo di 0,5-2 mg/ml. Mettere da parte le soluzioni proteiche ridotte e diluite per alcuni minuti mentre si risciacquano i cantilever e coprire i bicchieri.
   3. Sciacquare i cantilever e coprire i bicchieri in tre bicchieri sequenziali di acqua ultrapura.
   4. Rimuovere con cautela il liquido residuo dai bicchieri di copertura toccando con cura i bordi di una carta da filtro sotto un getto delicato di N₂. Rimuovere con cautela il liquido residuo dai cantilever toccando una carta da filtro. Applicare immediatamente la soluzione proteica diluita.
   5. Montare i vetri di copertura in un supporto per campioni appropriato compatibile con lo strumento AFM.
   6. Incubare i vetri di copertura PEGilati e i cantilever con le rispettive soluzioni proteiche diluite a RT per 1-2 ore.
   7. Sciacquare i cantilever in tre becher sequenziali con TBS per rimuovere le proteine non legate. Pipettare, risciacquare i bicchieri di copertura almeno 10 volte.
   8. Conservare i cantilever e coprire i bicchieri sotto TBS prima della misurazione.

2. Acquisizione dati

In questo lavoro, è stato utilizzato un AFM²⁸ costruito su misura controllato da un controller AFM MFP-3D di Asylum Research con software Igor Pro scritto su misura. La deflessione a sbalzo viene misurata con il metodo di deflessione del fascio ottico²⁹. I protocolli di preparazione del campione e di analisi dei dati qui forniti sono applicabili indipendentemente dall'esatto modello AFM utilizzato. Tuttavia, il modello AFM dovrebbe essere adatto per la misurazione in liquidi e supportare un intervallo di velocità accessibile sul piezo z di circa 200-5.000 nm/sec.

1. Montare il cantilever funzionalizzato e la superficie in vetro sull'AFM. Durante l'intera procedura, la superficie deve rimanere coperta con tampone. Quando si monta il cantilever, ridurre al minimo l'esposizione all'aria. Dopo la corretta regolazione del raggio laser, lasciare che il sistema si equilibri per almeno 30 minuti per ridurre eventuali effetti di deriva e regolare nuovamente se necessario.
2. Registrare uno spettro di rumore termico con il cantilever lontano dalla superficie, cioè in assenza di effetti di smorzamento.
3. Utilizzare un metodo minimamente invasivo come l'approccio acustico per trovare la superficie senza danneggiare la punta a sbalzo prima della misurazione. Se possibile, avvicinati manualmente alla superficie con il cantilever e usa le cuffie per ascoltare il rumore termico sull'uscita di deflessione grezza dal controller AFM. Non appena il cantilever si avvicina alla superficie, si sente un netto cambiamento nel suono.
   Nota: la punta a sbalzo dovrebbe ora trovarsi entro 2-5 μm dalla superficie. La natura del cambiamento del suono dipende dal cantilever utilizzato. La frequenza di risonanza del cantilever utilizzato in questo lavoro è di circa 25 kHz in acqua, al di sopra della gamma udibile umana. A causa degli effetti di smorzamento vicino alla superficie, la risonanza viene spostata verso frequenze più basse portando la risonanza a sbalzo nella gamma udibile. Quindi, si percepisce un apparente aumento della frequenza e dell'intensità del suono.
   Nei casi in cui non è disponibile un'uscita audio del segnale di deflessione, è possibile avvicinarsi alla superficie con lo z-piezo mentre è abilitato un feedback attivo sul segnale di deflessione. Non appena il segnale di deflessione aumenta di una quantità definita a causa dell'impronta della superficie, l'avvicinamento viene interrotto.
4. Determinare la sensibilità della leva ottica inversa (InvOLS) che rappresenta la distanza di spostamento della punta (in nm) per segnale di deflessione in volt. Fallo rientrando la superficie con la punta a sbalzo. Si consiglia una tensione di setpoint di deflessione corrispondente a uno spostamento della punta a sbalzo di circa 3 nm.
5. Determinare la costante elastica del cantilever adattando una semplice funzione di risposta dell'oscillatore armonico allo spettro del rumore termico, secondo il teorema di equipartizione^30,31.
6. Inizializza una routine sperimentale. Per questo lavoro, è stato utilizzato il seguente set di parametri di misurazione: velocità di avvicinamento: 3.000 nm/sec; forza di indentazione: 180 pN; tempo di permanenza in superficie: 10 msec; velocità di ritrazione: 0,2, 0,7, 2,0, 5,0 μm/sec con frequenze di campionamento rispettivamente di 2.000, 5.000, 15.000, 20.000 Hz; Distanza di ritrazione: 500 nm.
   Nota: la frequenza di campionamento non deve essere impostata su un valore superiore a 10 punti/nm per evitare un sovracampionamento e mantenere ragionevoli le dimensioni dei dati.
7. Dopo ogni traccia forza-distanza, azionare gli stadi piezoelettrici x e y per esporre una nuova posizione della superficie al cantilever in ogni curva forza-distanza. Questa tecnica campiona un'area più ampia della superficie del vetro di copertura durante le misurazioni a lungo termine.
8. Utilizzare l'azzeramento periodico dello stadio di deflessione (cioè la posizione del fotodiodo) e l'altezza del telaio piezoelettrico z durante le misurazioni a lungo termine nel caso in cui il segnale di deflessione si allontani dal raggio d'azione o si perda il contatto con la superficie.
9. Al termine della misurazione, eseguire un'altra misurazione InvOLS con una forza di indentazione significativamente più elevata rispetto a quella utilizzata prima delle misurazioni per ottenere un valore InvOLS più preciso.
10. Registra un altro spettro di rumore termico lontano dalla superficie. Determinare la costante della molla al termine dell'esecuzione sperimentale.

3. Analisi dei dati

Il diagramma di flusso nella Figura 3 illustra il processo di analisi dei dati. Esegui tutte le manipolazioni dei dati utilizzando un pacchetto software appropriato come Igor Pro o MATLAB. Per prima cosa converti il segnale grezzo dal rilevatore in unità di forza e correggi l'offset e la deriva. Successivamente, utilizzare modelli di elasticità dei biopolimeri per localizzare le barriere energetiche nei percorsi di dispiegamento e identificare i sottodomini proteici. Infine, si ottengono i parametri cinetici ed energetici dell'interazione recettore-ligando.

1. Conversione di unità e correzioni dei dati
   1. Moltiplicare il segnale di deflessione grezzo (volt) per l'InvOLS (nm/volt) e la costante elastica (pN/nm) per convertire la tensione del rivelatore in unità di forza.
   2. Sfalsare i dati in modo tale che il cantilever scaricato abbia un valore di forza pari a zero pN facendo prima la media dei valori di forza dall'ultimo 10% della traccia forza-distanza (acquisita più lontano dalla superficie) e quindi sottraendo la media da tutti i valori di forza nella traccia dei dati.
   3. Sfalsare ogni traccia nella direzione x in modo tale che la prima intercettazione con l'asse delle distanze avvenga a una distanza di 0 nm.
   4. L'InvOLS dipende dalla posizione del punto laser sul cantilever. Anche piccole quantità di deriva nel sistema di lettura ottica possono causare notevoli cambiamenti nell'InvOLS quando l'ingombro del cantilever è paragonabile alla dimensione dello spot laser. Correggere questo problema analizzando il rumore sul segnale di deflessione a forza zero. Supponendo condizioni ambientali costanti, il rumore sul segnale di deflessione è direttamente proporzionale all'InvOLS.
      1. Misurare il valore di deflessione quadratica media (RMS) del percorso (livello di rumore sotto la forza zero) dell'ultimo 10% di ogni traccia forza-distanza.
      2. Tracciare il rumore rispetto al numero della curva e applicare un adattamento appropriato. Tipicamente un adattamento esponenziale sotto forma di funzionerà meglio, dove N è il rumore, ni è il numero della curva e N0 e k sono parametri di adattamento. Un adattamento lineare può anche essere appropriato per determinati set di dati.
      3. Determinare un fattore di scala (SF) per ogni curva:
         
         Equazione 1:
         
         dove, ni è il numero della curva, nf è il numero della curva finale e C è un offset.
      4. Quindi, dividere tutti i valori di forza in ogni singola curva per il fattore di scala. Questa procedura scala ogni curva in base al rapporto tra il valore di rumore RMS della curva corrente e il valore di rumore RMS della traccia finale acquisita immediatamente prima della misurazione InvOLS.
      5. Eseguire una correzione della deflessione per trasformare l'asse della distanza (z) in estensione molecolare (z*). Ciò tiene conto della flessione del cantilever sotto forza che accorcia la distanza tra la punta del cantilever e il campione rispetto al valore riportato dalla posizione del sensore piezoelettrico z.
         
         Equazione 2:
         
         Dove z è la posizione misurata del sensore z, F la forza che agisce sul cantilever e k la costante della molla.
2. Analisi della lunghezza del contorno
   La lunghezza del contorno di una proteina è la lunghezza massima allungata della catena polipeptidica. Lo stato di ripiegamento di una proteina si riferisce alla sua geometria e alla distanza da un capo all'altro determinata dalla struttura secondaria e terziaria. La lunghezza del contorno di una proteina è direttamente correlata al suo stato di ripiegamento^9,25,32. La posizione di rotture specifiche nelle tracce di forza-estensione varia ampiamente a causa della polidispersione dei linker PEG, nonché di parametri esterni come la temperatura, le proprietà tampone e i tassi di carico. Ciò complica l'analisi diretta dei dati, ma può essere superato trasformando i dati di estensione della forza in uno spazio di lunghezza del contorno. Questa tecnica consente di calcolare la media su enormi set di dati e consente di utilizzare il riconoscimento automatico dei modelli per identificare gli eventi di sviluppo caratteristici. È quindi possibile ordinare le singole tracce di forza a seconda del tipo di interazione esibita. La seguente procedura²⁵ descritta in precedenza viene utilizzata per trasformare i dati di estensione della forza nello spazio della lunghezza del contorno.
   1. Risolvendo il modello WLC (equazione 3)²³ per la lunghezza del contorno L a una lunghezza di persistenza fissa p si ottiene l'equazione 4, che fornisce la lunghezza del contorno L(x,u). Qui, x è la distanza e u=F*p/kBT, dove kB è la costante di Boltzmann e T è la temperatura. Possono essere prese in considerazione solo soluzioni reali. Ulteriori vincoli sono x, F>0, L>0, x>0;
      
      Equazione 3:
      
      
      Equazione 4:
      
      dove,
      
   2. Traccia i punti dati trasformati in un grafico forza rispetto alla lunghezza del contorno. Applicare una soglia di forza di circa 10 pN per escludere il rumore. Le interazioni non specifiche possono essere escluse applicando un filtro di lunghezza passa-lungo. Assembla un istogramma delle lunghezze dei contorni.
   3. Correlare³³ gli istogrammi ottenuti con un istogramma modello e sfalsare lungo l'asse x per correggere la polidispersione PEG. Utilizzare i valori di correlazione risultanti per misurare la somiglianza delle singole tracce di dati. In questo modo, le tracce di dati possono essere ordinate in classi predefinite per semplificare ulteriori analisi.
   4. Utilizzare una tecnica simile per trovare caratteristiche ripetute in una singola traccia mediante autocorrelazione, ad esempio per lo sviluppo di più domini Ig.
   5. Ordinare manualmente le tracce per analizzare altri eventi in corso.
3. Analisi della velocità di caricamento
   Estrarre informazioni cinetiche ed energetiche sulla dissociazione recettore-ligando applicando modelli appropriati allo spettro delle forze, ovvero il grafico forza di rottura rispetto a ln (velocità di caricamento).
   1. Per una data velocità di trazione, determinare la forza di rottura e la velocità di carico per gli eventi di rottura di interesse:
      1. Eseguire un adattamento della linea a una traccia forza-tempo in prossimità dell'evento di rottura di interesse. Determinare la velocità di carico dalla pendenza dell'adattamento della linea al picco. Ripetere questa procedura per ogni traccia che mostra l'evento di rottura di interesse.
      2. Determinare la forza di rottura più probabile applicando un adattamento gaussiano a un istogramma delle forze di rottura. Sono possibili funzioni di adattamento alternative.
      3. Determina la velocità di carico più probabile.
   2. Ripetere i passaggi 3.3.3.1 - 3.3.3.3 per tutte le velocità di trazione.
   3. Tracciare le forze di rottura più probabili rispetto al logaritmo naturale delle velocità di carico più probabili per ottenere lo spettro delle forze.
   4. Applicare un modello teorico adatto allo spettro delle forze per estrarre parametri cinetici ed energetici (Figura 4C). In molti casi, il modello lineare di Bell-Evans^20,34 può essere utilizzato e produrrà buone stime per koff, il tasso di dissociazione in assenza di forza, e Dx, la distanza dallo stato di transizione lungo la coordinata di reazione, come mostrato nell'equazione 5.
      
      Equazione 5:
      

Abbiamo utilizzato la procedura descritta per studiare una coppia coesina-dockerina di tipo I da C. thermocellum. Dopo il successo del legame della coppia coesina-dockerina, le tracce di distanza della forza registrate hanno mostrato modelli di picco caratteristici. Una traccia tipica è mostrata nella Figura 4a. Ogni picco nella traccia rappresenta il dispiegamento di un sottodominio proteico con l'ultimo picco corrispondente alla dissociazione del complesso recettore-ligando.

Per il complesso CBM-coesina-dockerin-xilanasi studiato in questo lavoro, l'aumento iniziale di forza corrisponde all'allungamento delle molecole linker PEG. La serie successiva di un massimo di tre cali di forza discendente riflette lo sviluppo del dominio xilanasi. Il picco finale rappresenta la rottura dell'interfaccia di legame coesina-dockerina.

Tutte le tracce forza-distanza registrate sono state trasformate in uno spazio di lunghezza forza-contorno. L'istogramma della posizione della barriera risultante è mostrato nella Figura 4B. I dati mostrano un incremento della lunghezza del contorno di circa 89 nm. Il dominio della xilanasi è costituito da 378 amminoacidi, 260 dei quali si trovano C-terminale dal residuo di cisteina ingegnerizzato. Dalla struttura cristallina, si presume che la lunghezza ripiegata del dominio sia di 6 nm. Inoltre, assumendo una lunghezza per amminoacido allungato di 0,365 nm35, l'incremento misurato di 89 nm può essere assegnato in modo inequivocabile al dispiegamento del dominio xilanasi. Ciò è coerente con i risultati precedentemente pubblicati11.

Per sondare il panorama energetico dell'interazione coesina-dockerina, abbiamo analizzato un totale di 186 tracce di dati ottenute con quattro diverse velocità di trazione (0,2, 0,7, 2,0 e 5,0 μm/sec). Lo spettro di forza risultante è mostrato nella Figura 4C. Adattando l'equazione (5) ai dati si ottengono valori per koff e Dx di 3,13 x10-5/sec e 0,70 nm, rispettivamente. Questi valori sono in buon accordo con i risultati precedentemente pubblicati11.

Figura 1. Schema dell'immobilizzazione della biomolecola. (A) Le proteine di fusione xilanasi-dockerina sono attaccate al vetrino tramite linker PEG. Il cantilever è modificato in modo simile con una proteina coesina fusa a un modulo di legame della cellulosa (CBM). (B) Rappresentazione del legame chimico impiegato nella funzionalizzazione del vetro di copertura e del cantilever. Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Figura 2. Diagramma di flusso del processo che mostra le fasi di preparazione del campione seguite dall'acquisizione e dall'analisi dei dati.Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Figura 3. Diagramma del flusso di lavoro dell'analisi dei dati che mostra le fasi di elaborazione coinvolte nella conversione dei segnali grezzi del rivelatore in tracce di estensione della forza. Queste tracce vengono ulteriormente analizzate per ottenere informazioni sul legame recettore-ligando. I risultati finali forniscono parametri energetici e cinetici relativi a domini specifici. Clicca qui per ingrandire l'immagine.

Figura 4. Dati di spettroscopia di forza di una singola molecola su coesina-dockerina. (A) Tipica traccia di dispiegamento che mostra l'allungamento del linker PEG, il dispiegamento della xilanasi e la rottura dell'interfaccia di legame coesina-dockerina. (B) Istogramma della lunghezza del contorno assemblato da 314 tracce di distanza di forza che mostrano posizioni di barriera energetica lungo la lunghezza del contorno. (C) Spettro dinamico delle forze ottenuto da 186 tracce di forza-estensione. I grandi cerchi blu rappresentano la forza di rottura più probabile a una data velocità di carico. La linea continua rappresenta i minimi quadrati che si adattano all'equazione 5. Le popolazioni degli eventi di rottura sono mostrate sullo sfondo. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard ottenuta dagli accoppiamenti gaussiani. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.