Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

Summary

Viene descritta la generazione di chimere di linfonodi/cuscinetti adiposi per lo studio dell'origine delle cellule stromali dei linfonodi. Il metodo prevede l'isolamento dei linfonodi da topi neonati e cuscinetti adiposi embrionali, la generazione di cuscinetti linfonodali chimerici e il loro trasferimento sotto la capsula renale di un topo ospite.

Abstract

Lo stroma è un componente chiave della struttura e della funzione dei linfonodi. Tuttavia, si sa poco sulla sua origine, sull'esatta composizione cellulare e sui meccanismi che ne regolano la formazione. I linfonodi sono sempre incapsulati nel tessuto adiposo e abbiamo recentemente dimostrato l'importanza di questa relazione per la formazione dello stroma linfonodale. Le cellule precursori degli adipociti migrano nel linfonodo durante il suo sviluppo e, dopo l'attivazione del recettore della linfotossina-b, spengono l'adipogenesi e si differenziano in cellule stromali linfoidi (Bénézech et al.¹⁴). Sulla base del potenziale stromale linfoide del tessuto adiposo, presentiamo un metodo che utilizza una chimera linfonodale/cuscinetto adiposo che consente il tracciamento del lignaggio dei precursori delle cellule stromali dei linfonodi. Mostriamo come isolare i linfonodi neonati e il tessuto adiposo embrionale EYFP⁺ e creare una chimera di cuscinetto adiposo LN/EYFP⁺. Dopo il trasferimento sotto la capsula renale di un topo ospite, il linfonodo incorpora le cellule precursori del tessuto adiposo locale e termina la sua formazione. L'analisi della progenie delle cellule adipose EYFP⁺ nei linfonodi risultanti può essere eseguita mediante analisi citofluorimetrica di linfonodi digeriti enzimaticamente o mediante analisi in immunofluorescenza di criosezioni linfonodali. Utilizzando cuscinetti adiposi di diversi modelli murini knockout, questo metodo fornirà un modo efficiente per analizzare l'origine delle diverse popolazioni di cellule stromali dei linfonodi.

Introduction

I linfonodi (LN) sono organi chiave del sistema immunitario situati in siti strategici del corpo, lungo la rete vascolare linfatica. Consentono la filtrazione di antigeni e agenti patogeni e forniscono un sito per la presentazione dell'antigene ai linfociti e l'induzione di risposte immunitarie adattative. Lo stroma, che costituisce la struttura di base del LN e orchestra il movimento dei diversi partecipanti ematopoietici della risposta immunitaria adattativa, è centrale per la funzione di questi organi. Diverse popolazioni di cellule stromali forniscono spunti essenziali e specifici per i movimenti, la localizzazione, la sopravvivenza, la proliferazione e la maturaz....

Protocol

I topi sono stati allevati e mantenuti in condizioni SPF nell'Unità di Servizio Biomedico dell'Università di Birmingham secondo i regolamenti del Ministero degli Interni del Regno Unito e del comitato etico locale. Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono coperte da una licenza di progetto approvata sia dal comitato etico locale che dal Ministero degli Interni.

1. Isolamento dei LN neonati

1. Sacrificare i topi appena nati mediante lussazione cervicale.
2. Sezionare la testa e aprire il corpo con le forbici dalla parte superiore della regione toracica alla parte inferiore della regione addominale e rimuovere co....

Results

Tre settimane dopo il trapianto, la LN/chimera del cuscinetto adiposo viene recuperata dal rene. La chimera è ora molto simile a un normale LN nel proprio cuscinetto adiposo e il LN è visibile al centro del tessuto adiposo (Figura 1). Se il LN non può essere identificato, è possibile che sia stato perso durante il trapianto sul rene. Quando si valuta il ruolo di geni potenzialmente importanti nello sviluppo dei LN, i LN recuperati possono rimanere molto piccoli e più difficili da trovare. Questo è il cas.......

Discussion

In questo articolo abbiamo presentato un metodo per saggiare e quantificare il contributo delle cellule progenitrici del tessuto adiposo ai LN in via di sviluppo e due tecniche che permettono l'analisi della loro progenie. La dissezione dei cuscinetti adiposi embrionali e dei LN neonati è delicata e richiede abilità manuali acquisite con molta pratica prima della generazione dell'effettiva chimera LN-cuscinetto adiposo. Per controllare la qualità delle dissezioni, è possibile eseguire l'analisi citofluorimetrica sui cusc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanolo	Sigma	M3148
50 mm Sterilin Petri Dish Appleton		Woods SC265
90 mm Sterilin Petri Dish	Appleton Woods	SC260
Vetrini adesivi	Surgipath	00202
Anti-mouse CD31 eFluor 450	eBioscience	48-0311
Anti-mouse CD4 Alexa 647	eBioscience	51-0041
Anti-topo CD45 PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-0451
Anti-topo IgM Rodamina Red	Stratech	715-296-020-JIR
Anti-topo Podoplanina PE/Cy7	Biolegend	127411
Anti-topo Podoplanina purificato	eBioscience	14-5381
Collagenasi D	Roche
DMEM Medium	Sigma	D5671
DNase I	Sigma	DN25-1G
Dumont #5 Pinza Inox Biologie	FST	11252-20	Pinza extra fine per dissezioni embrionali e neonatali
Soluzione EDTA 0,5 M	Sigma	E7889
ERTR-7	Biogenesis
Siero fetale bovino	Sigma	F9665
Forbici a iride fine temprate dritte 11 cm	FST	14090-11	Forbici piccole per dissezione
Soluzione HEPES	Sigma	H0887
Filtri a membrana isopora 0,8 μ m ATTP	Millipore	ATTPO 1300
L-Glutammina soluzione	Sigma	G7513
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)	Sigma	M7145
O.C.T. Composto	Tissue-Tek	4583
Penicillina-Streptomicina	Sigma	P4458
Scatola di plastica con coperchio	Watkins e Doncaster	E6052	Scatola per sandwich per in vitro coltura di organi. Praticare due fori nel coperchio per consentire lo scambio di gas nell'incubatore CO2.
RPMI 1640 Medium	Sigma	R0883
Spugne Vulkan Underwrap	Stereomicroscopio Patterson Medical	004383
	Leica	LEICA MZ95	Microscopio da dissezione con zoom
Thermomixer	Eppendorf	5436
Vectashield Mezzo di montaggio con DAPI	Vector Laboratories	H-1200