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Articolo metodologico

Generazione di Linfonodo grassi Pad Chimere per lo studio del linfonodo stromale origine cellulare

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DOI:

10.3791/50952

⸱

16 dicembre 2013

 , 
1School of Immunity and Infection, IBR-MRC Centre for Immune Regulation, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 2Centre for Cardiovascular Sciences, University of Edinburgh

In questo articolo

Sommario

Viene descritta la generazione di chimere di linfonodi/cuscinetti adiposi per lo studio dell'origine delle cellule stromali dei linfonodi. Il metodo prevede l'isolamento dei linfonodi da topi neonati e cuscinetti adiposi embrionali, la generazione di cuscinetti linfonodali chimerici e il loro trasferimento sotto la capsula renale di un topo ospite.

Abstract

Lo stroma è un componente chiave della struttura e della funzione dei linfonodi. Tuttavia, si sa poco sulla sua origine, sull'esatta composizione cellulare e sui meccanismi che ne regolano la formazione. I linfonodi sono sempre incapsulati nel tessuto adiposo e abbiamo recentemente dimostrato l'importanza di questa relazione per la formazione dello stroma linfonodale. Le cellule precursori degli adipociti migrano nel linfonodo durante il suo sviluppo e, dopo l'attivazione del recettore della linfotossina-b, spengono l'adipogenesi e si differenziano in cellule stromali linfoidi (Bénézech et al.14). Sulla base del potenziale stromale linfoide del tessuto adiposo, presentiamo un metodo che utilizza una chimera linfonodale/cuscinetto adiposo che consente il tracciamento del lignaggio dei precursori delle cellule stromali dei linfonodi. Mostriamo come isolare i linfonodi neonati e il tessuto adiposo embrionale EYFP+ e creare una chimera di cuscinetto adiposo LN/EYFP+. Dopo il trasferimento sotto la capsula renale di un topo ospite, il linfonodo incorpora le cellule precursori del tessuto adiposo locale e termina la sua formazione. L'analisi della progenie delle cellule adipose EYFP+ nei linfonodi risultanti può essere eseguita mediante analisi citofluorimetrica di linfonodi digeriti enzimaticamente o mediante analisi in immunofluorescenza di criosezioni linfonodali. Utilizzando cuscinetti adiposi di diversi modelli murini knockout, questo metodo fornirà un modo efficiente per analizzare l'origine delle diverse popolazioni di cellule stromali dei linfonodi.

Introduzione

I linfonodi (LN) sono organi chiave del sistema immunitario situati in siti strategici del corpo, lungo la rete vascolare linfatica. Consentono la filtrazione di antigeni e agenti patogeni e forniscono un sito per la presentazione dell'antigene ai linfociti e l'induzione di risposte immunitarie adattative. Lo stroma, che costituisce la struttura di base del LN e orchestra il movimento dei diversi partecipanti ematopoietici della risposta immunitaria adattativa, è centrale per la funzione di questi organi. Diverse popolazioni di cellule stromali forniscono spunti essenziali e specifici per i movimenti, la localizzazione, la sopravvivenza, la proliferazione e la maturazione della componente ematopoietica del sistema immunitario1-3. Le cellule stromali LN adulte si dividono in tre categorie: le cellule endoteliali del sangue, le cellule endoteliali linfatiche e i fibroblasti. Queste tre categorie comprendono popolazioni eterogenee. Le popolazioni fibroblastiche contengono cellule reticolari fibroblastiche (FRC), cellule dendritiche follicolari (FDC), cellule reticolari marginali (MRC), mentre i fibroblasti che formano la capsula, il midollo e altre cellule che non sono ancora identificate1-5. Le origini e i meccanismi che regolano la maturazione delle diverse popolazioni di cellule stromali LN non sono chiari e l'assenza di marcatori specifici che permettano la mappatura del destino di specifiche popolazioni di cellule stromali LN rende il loro studio particolarmente difficile. Tuttavia, una piena comprensione dell'ontogenesi delle cellule stromali dei LN è necessaria per la comprensione delle risposte immunitarie adattative, dei meccanismi che contribuiscono alla tolleranza ed è alla base dello sviluppo dei LN artificiali.

Finora, lo studio dell'origine e dello sviluppo delle cellule stromali LN è stato per lo più limitato alla valutazione diretta dello sviluppo di LN in embrioni e neonati in topi wild type e diversi ceppi di topi knockout6-9. Questi approcci sono limitati dalla letalità embrionale e perinatale di alcuni ceppi murini portatori di delezioni in geni importanti per lo sviluppo dei LN. Inoltre, alcuni dei geni essenziali per lo sviluppo del tessuto linfoide sono coinvolti in un'ampia gamma di processi biologici, come nel caso di RANK10-11 o NF-κB212. Per affrontare questi problemi, sono stati eseguiti l'isolamento e il trapianto di LN embrionali sotto la capsula renale di un topo ospite12-13. Questa tecnica consente, ad esempio, il trasferimento di LN embrionali geneticamente modificati in un ambiente di tipo selvatico per valutare lo sviluppo degli organi e il reclutamento e l'organizzazione delle cellule ospiti. Tuttavia, la crescita del LN embrionale innestato sotto la capsula renale di un ospite adulto è compromessa, limitando così l'uso di questa tecnica.

LN e i depositi di grasso sono anatomicamente strettamente associati e si sviluppano simultaneamente durante l'embriogenesi. Recentemente abbiamo dimostrato che l'associazione LN/tessuto adiposo gioca un ruolo cruciale nella fornitura di progenitori delle cellule stromali per i LN. In particolare, la segnalazione attraverso l'LTβR controlla il destino delle cellule precursori degli adipociti bloccando l'adipogenesi e promuovendo invece la maturazione verso un fenotipo14 di cellule stromali LN. Qui descriviamo un metodo basato sulla generazione di chimere LN-fat pad che consentono il tracciamento di cellule derivate dal tessuto adiposo nel LN in via di sviluppo. Questo metodo sarà utile per determinare il contributo dei tessuti adiposi a diverse popolazioni di cellule stromali LN e, combinato con l'uso di tessuti provenienti da ceppi di topi geneticamente modificati, consentirà una migliore comprensione dei meccanismi che controllano il differenziamento dei diversi sottogruppi di cellule stromali LN.

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Protocollo

I topi sono stati allevati e mantenuti in condizioni SPF nell'Unità di Servizio Biomedico dell'Università di Birmingham secondo i regolamenti del Ministero degli Interni del Regno Unito e del comitato etico locale. Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono coperte da una licenza di progetto approvata sia dal comitato etico locale che dal Ministero degli Interni.

1. Isolamento dei LN neonati

  1. Sacrificare i topi appena nati mediante lussazione cervicale.
  2. Sezionare la testa e aprire il corpo con le forbici dalla parte superiore della regione toracica alla parte inferiore della regione addominale e rimuovere con cura tutti i visceri (cuore, polmoni, fegato, intestino, reni, vescica) dalla cavità addominale.
  3. Trasferire il corpo in una piastra di Petri da 90 mm contenente terreni RF10 (terreni RPMI1640 integrati con il 10% di siero fetale bovino, 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina e 2 mM di L-glutammina). Da questa fase in poi, i tessuti saranno mantenuti in condizioni sterili e maneggiati in una cappa di coltura tissutale.
  4. Trasferire il corpo in una nuova piastra Petri da 90 mm contenente RF10.
  5. Al microscopio da dissezione, staccare con cura il peritoneo dalla pelle nella regione inguinale. Il LN inguinale è situato all'intersezione di tre vasi sanguigni nel cuscinetto adiposo.
  6. Rimuovere con cautela il LN. Assicurarsi che tutto il tessuto adiposo sia stato rimosso. Trasferire il LN in una piastra di Petri da 50 mm contenente il supporto RF10. Mantenere i fazzoletti sul ghiaccio mentre si continua con la procedura.

2. Isolamento dei cuscinetti adiposi E18.5

  1. Per generare embrioni di topo al giorno 18,5 di gestazione (E18,5), impostare gravidanze a tempo posizionando una femmina e un maschio di topo per gabbia durante la notte. Separare i topi al mattino e verificare la presenza di tappi vaginali (giorno gestazionale E0.5).
    1. Eutanasia delle femmine tappate al giorno 18,5 di gravidanza mediante lussazione cervicale.
    2. Rimuovere gli embrioni e metterli in una capsula di Petri da 90 mm contenente RF10.
  2. Da questa fase in poi, i tessuti devono essere manipolati utilizzando una tecnica sterile nella cappa di coltura tissutale. Al microscopio da dissezione, sezionare la testa, aprire gli embrioni con le forbici dalla regione toracica al fondo della regione addominale e rimuovere con cura tutti i visceri (cuore, polmoni, fegato, intestino, reni, vescica) dalla cavità corporea.
  3. Pulisci il corpo da tutti i tessuti viscerali rimanenti e lavalo in PBS per eliminare tutte le tracce di sangue che potrebbero rendere più difficile la dissezione.
  4. Trasferire i corpi puliti in una capsula di Petri fresca da 90 mm contenente RF10.
  5. Staccare con cautela il peritoneo dalla pelle nella regione inguinale. Il LN inguinale è situato all'intersezione di tre vasi sanguigni nel cuscinetto adiposo.
  6. Rimuovere con cautela il LN ed eliminarlo. È molto importante rimuovere completamente il LN per assicurarsi che il cuscinetto adiposo utilizzato per le chimere non sia contaminato da cellule stromali linfoidi.
  7. Rimuovere il cuscinetto adiposo inguinale e trasferirlo in una piastra di Petri da 50 mm contenente terreni RF10. Mantenere i fazzoletti sul ghiaccio mentre si continua con la procedura.

3. Generazione del LN-fat Pad Chimera

  1. Preparare il sistema di coltura di organi in vitro 15.
    1. Preparazione delle spugne e dei filtri: questa operazione può essere eseguita in anticipo e le spugne e i filtri possono essere conservati sterili in una capsula di Petri nella cappa di coltura.
      1. Tagliare il Vulkan Underwrap in 1-1,5 cm2 pezzi
      2. Lessare le spugne per 2 ore in acqua distillata.
      3. Lasciare asciugare le spugne per un paio d'ore nella cappa di coltura cellulare.
      4. Far bollire i filtri per 20 min.
      5. Lasciare asciugare i filtri per un paio d'ore nella cappa di coltura cellulare.
    2. Preparare terreni DMEM integrati con il 10% di siero fetale bovino, 10 mM HEPES, 1x MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 50 mM di 2-Mercaptoetanolo, 100 U/ml di penicillina, 100 mg/ml di streptomicina e 2 mM di L-glutammina.
    3. Aggiungere 2 ml di terreno in una capsula di Petri da 50 mm.
    4. Disporre una spugna sul fondo della capsula di Petri. Bagnare entrambi i lati della spugna immergendoli nel supporto.
    5. Posiziona un filtro sopra la spugna. Il filtro è posizionato all'interfaccia liquido-aria.
  2. Al microscopio da dissezione, riassociare attentamente un LN neonato con un cuscinetto adiposo embrionale.
  3. Posizionare la chimera LN-fat pad sopra il filtro.
  4. Trasferite la capsula di Petri in una scatola di plastica rettangolare con un paio di fori sul coperchio e contenente acqua sul fondo per garantire l'umidità.
  5. Sigilla il coperchio della scatola con del nastro adesivo. Lasciare aperti i due fori del coperchio.
  6. Trasferire la scatola in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con CO2 al 5%. Lasciare equilibrare la scatola per 2 ore, prima di sigillare i fori del coperchio con del nastro adesivo.
  7. Incubare i tessuti per almeno 2 giorni per consentire al LN di attaccarsi al cuscinetto adiposo ed essere trasferibile sotto la capsula renale.

4. Trasferimento della chimera LN-fat pad sotto la capsula renale dei topi ospiti

  1. Raccogli le chimere LN-fat pad dal filtro e trasferiscile sotto la capsula renale dei topi ospiti. Il metodo di trasferimento della capsula renale è già stato descritto 16.

5. Isolamento dei LN trasferiti

  1. Dopo 3-4 settimane sotto la capsula renale, le chimere LN-fat pads sono pronte per essere raccolte. Sopprimere i topi ospiti utilizzando una guida approvata.
  2. Rimuovere il rene dai topi ospiti.
  3. Al microscopio da dissezione, isolare la chimera LN-fat pad e sezionare il LN.

6. Digestione enzimatica dei LN trasferiti per l'analisi citofluorimetrica

  1. Praticare un'incisione nel LN con piccole forbici per permettere agli enzimi di penetrare nell'organo e facilitare la digestione.
  2. Inserire un LN in 1,5 ml di Eppendorf contenente 600 μl di tampone di digestione (RPMI 1% FCS, 2,5 mg/ml di collagenasi D, 100 μg/ml di DNasi I).
  3. Incubare per 30 minuti a 37 °C su un blocco termico agitante. Pipettare su e giù per facilitare la dissociazione dei tessuti ogni 10 minuti.
  4. Aggiungere 6 μl di EDTA 0,5 M alla provetta e pipettare su e giù per terminare la dissociazione dei tessuti.
  5. Centrifugare per 5 min a 490 x g.
  6. Risospendere il pellet cellulare nella soluzione colorante (PBS, 0,1% BSA, 5% siero di ratto e 5% siero di topo) contenente la combinazione di anticorpi primari.
  7. Incubare per 30 minuti con ghiaccio.
  8. Lavare due volte in PBS
  9. Incubare con anticorpi secondari per 20 minuti, se necessario.
  10. Lavare 2 volte in PBS.
  11. Analisi su citometro a flusso.

7. Analisi dei LN trasferiti mediante immunofluorescenza

  1. Fissazione per la conservazione dell'EYFP durante il processo di congelamento e criosezione: Porre il LN in una soluzione di PBS, 4% PFA e 10% saccarosio e lasciare agire per 3-4 ore.
  2. Metti una singola piccola goccia di composto O.C.T. freddo su un pezzetto di carta stagnola. Evitare le bolle d'aria. Posizionare con cura il LN senza alcun liquido al centro della goccia.
  3. Congelare l'organo posizionando il foglio di alluminio sul ghiaccio secco.
  4. Tagliare sezioni da 8-10 μm su vetrini adesivi extra utilizzando un criostato. Lasciare asciugare i vetrini per 2 ore prima di riporli a -20 °C.
  5. Le procedure di colorazione possono variare in base agli anticorpi primari utilizzati e possono essere ottimizzate dal protocollo seguente. Colorare le sezioni con una soluzione colorante (PBS, 1% BSA) contenente la combinazione di anticorpi primari.
  6. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata.
  7. Lavare due volte in PBS per 5 minuti
  8. Incubare con anticorpi secondari per 1 ora.
  9. Lavare due volte in PBS per 5 min.
  10. Montare le guide in supporti di montaggio contenenti DAPI.
  11. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza o confocale.

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Risultati

Tre settimane dopo il trapianto, la chimera LN/grasso viene recuperata dal rene. La chimera ora è molto simile a un linfonodo normale nel suo grasso, e il linfonodo è visibile al centro del tessuto adiposo (Figura 1). Se il linfonodo non può essere identificato, è possibile che sia stato perso durante il trapianto sul rene. Quando si valuta il ruolo di geni potenzialmente importanti nello sviluppo del linfonodo, i linfonodi recuperati possono rimanere molto piccoli e più difficili da trovare. Questo acca...

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Discussione

In questo articolo abbiamo presentato un metodo per saggiare e quantificare il contributo delle cellule progenitrici del tessuto adiposo ai LN in via di sviluppo e due tecniche che permettono l'analisi della loro progenie. La dissezione dei cuscinetti adiposi embrionali e dei LN neonati è delicata e richiede abilità manuali acquisite con molta pratica prima della generazione dell'effettiva chimera LN-cuscinetto adiposo. Per controllare la qualità delle dissezioni, è possibile eseguire l'analisi citofluorimetrica sui cusc...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati al personale dell'Unità di Servizi Biomedici dell'Università di Birmingham per essersi preso cura delle nostre colonie animali. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto integrato dell'UE INFLACARE to JC nell'ambito del 7° PQ.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-MercaptoetanoloSigmaM3148
50 mm Sterilin Petri Dish AppletonWoods SC265
90 mm Sterilin Petri DishAppleton WoodsSC260
Vetrini adesiviSurgipath00202
Anti-mouse CD31 eFluor 450eBioscience48-0311
Anti-mouse CD4 Alexa 647eBioscience51-0041
Anti-topo CD45 PerCP-Cy5.5eBioscience45-0451
Anti-topo IgM Rodamina RedStratech715-296-020-JIR
Anti-topo Podoplanina PE/Cy7Biolegend127411
Anti-topo Podoplanina purificatoeBioscience14-5381
Collagenasi DRoche
DMEM MediumSigmaD5671
DNase ISigmaDN25-1G
Dumont #5 Pinza Inox BiologieFST11252-20Pinza extra fine per dissezioni embrionali e neonatali
Soluzione EDTA 0,5 MSigmaE7889
ERTR-7Biogenesis
Siero fetale bovinoSigmaF9665
Forbici a iride fine temprate dritte 11 cmFST14090-11Forbici piccole per dissezione
Soluzione HEPESSigmaH0887
Filtri a membrana isopora 0,8 μ m ATTPMilliporeATTPO 1300
L-Glutammina soluzioneSigmaG7513
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)SigmaM7145
O.C.T. CompostoTissue-Tek4583
Penicillina-StreptomicinaSigmaP4458
Scatola di plastica con coperchioWatkins e DoncasterE6052Scatola per sandwich per in vitro coltura di organi. Praticare due fori nel coperchio per consentire lo scambio di gas nell'incubatore CO2.
RPMI 1640 MediumSigmaR0883
Spugne Vulkan UnderwrapStereomicroscopio Patterson Medical004383
LeicaLEICA MZ95Microscopio da dissezione con zoom
ThermomixerEppendorf5436
Vectashield Mezzo di montaggio con DAPIVector LaboratoriesH-1200
11088858001

Riferimenti

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  17. Krautler, N. J., et al. Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors. Cell. 150, 194-206 (2012).

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