Research Article
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In questo articolo viene presentato un metodo per l'isolamento degli esosomi dal sangue intero e un'ulteriore analisi mediante tracciamento di nanoparticelle utilizzando uno strumento semiautomatico. La tecnologia presentata fornisce un metodo estremamente sensibile per la visualizzazione e l'analisi delle particelle in sospensione liquida.
Sebbene l'importanza biologica degli esosomi abbia recentemente guadagnato una crescente attenzione scientifica e clinica, molto è ancora sconosciuto sui loro percorsi complessi, la loro biodisponibilità e le loro diverse funzioni in salute e malattia. Il lavoro attuale si concentra sulla presenza e il comportamento degli esosomi (sia in vitro che in vivo) nel contesto di diversi disturbi umani, in particolare nei campi dell'oncologia, della ginecologia e della cardiologia.
Sfortunatamente, non esiste né un consenso riguardo a un gold standard per l'isolamento degli esosomi, né c'è un accordo su un tale metodo per la loro analisi quantitativa. Poiché esistono molti metodi per la purificazione degli esosomi e anche molte possibilità per la loro analisi quantitativa e qualitativa, è difficile determinare una combinazione di metodi per l'approccio ideale.
Qui, dimostriamo l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), un metodo semi-automatico per la caratterizzazione degli esosomi dopo l'isolamento dal plasma umano mediante ultracentrifugazione. I risultati presentati mostrano che questo approccio per l'isolamento, così come la determinazione del numero medio e della dimensione degli esosomi, fornisce dati riproducibili e validi, come confermato da altri metodi, come la microscopia elettronica a scansione (SEM).
L'esatta funzione di exosomes circolanti rimasto sconosciuto per un lungo periodo di tempo. Anche ora il meccanismo percorso completo di esosomi non è del tutto chiaro. Dal esosomi portano antigeni, proteine e RNA (mRNA e miRNA), che li riferisce alla loro cella genitori di origine, la loro funzione come trasmettitori di segnalazione cellula-cellula è principalmente stata data la priorità.
Molti metodi differenti sono stati descritti in letteratura per l'isolamento e la determinazione quantitativa di esosomi 1,2. Tuttavia, nessun consenso su un 'gold standard' è stato raggiunto. Nel frattempo la maggioranza degli scienziati attivi nel campo della ricerca exosome concordano che un metodo coerente di isolamento è altamente giustificato per raggiungere un grado di comparabilità tra i diversi rapporti e studi più elevato.
Fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) è lo strumento più comune e diffusa per l'analisi exosome 3. FACS ha benEFIT che, tramite l'etichettatura di fluorescenza, le cellule di diversa provenienza possono essere confrontati in un solo passo. I principali svantaggi di FACS sono che questo metodo non è abbastanza sensibile per identificare le particelle inferiori a 0,5 micron 4, considerando exosomes sono generalmente compresi tra 30-120 nm di diametro 5, ancor meno per misurare le loro dimensioni.
Microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono altri strumenti per l'analisi della dimensione delle particelle e la morfologia di esosomi. Tuttavia, sia SEM e TEM hanno lo svantaggio che la preparazione dei campioni è, entrambi i metodi coinvolgono fasi intensità di lavoro che richiede tempo e ciascuno ha un certo rischio di generazione manufatto. Né metodo è adatto per un'elevata produttività e caratterizzazione di diverse migliaia di singole particelle di un campione. Inoltre, un'analisi quantitativa per clinica routine in cui i campioni devono spesso essere analizzati simultaneamente o almeno in un periodo molto breve èdifficile da eseguire. Tecniche di nuova generazione permettono ora di analizzare esosomi senza un intenso lavoro preparatorio prima (SEM esempio, ambientale). Queste tecniche moderne sono ancora piuttosto scomodo per l'analisi di grandi volumi contenenti sospensioni esosomi per determinare il loro numero medio e distribuzione delle dimensioni 6.
Un altro metodo molto sensibile per la visualizzazione e l'analisi di esosomi è-nanoparticelle tracciamento analisi (NTA). Questo metodo sfrutta due diversi principi di fisica. In primo luogo, le particelle vengono rilevati dalla luce dispersa quando vengono irradiate con un raggio laser. Il secondo fenomeno è noto come moto browniano, secondo cui la diffusione di particelle differenti in una sospensione liquida è inversamente proporzionale alle loro dimensioni. In quest'ultimo caso il movimento dipende anche dalla temperatura e dalla viscosità del liquido. Tuttavia, questo tasso è direttamente correlata alla dimensione delle particelle ed è utilizzato da NTA. Utilizzando morbidoanalisi basata-ware, immagini digitali di luce diffusa da singole particelle sono registrati. Piazzole di punti luce sparsi e la loro velocità di movimento forniscono dati che facilitano la determinazione del conteggio particellare totale e distribuzione delle dimensioni. Questa tecnica è particolarmente potente per analizzare particelle con un diametro medio inferiore a 100 nm.
Le dimensioni e la concentrazione misurazioni vengono effettuate con il ZetaView browniano e elettroforesi Motion Video Analysis microscopio. Si tratta di un banco di top nanoparticella strumento di analisi semi-automatico per campioni liquidi (di seguito denominato strumento di monitoraggio di particelle). Consiste dell'analizzatore particle tracking e un computer portatile con il software utilizzato per l'analisi dei dati. Campioni biologici eterogenei sono adatti per questo metodo come sospensioni più omogenei di particelle inorganiche. Un microscopio laser scattering con una videocamera viene utilizzata per il rilevamento di particelle e per la observation del loro movimento. Mentre l'asse orizzontale e microscopio è concentrata nel canale cella riempita con una sospensione contenente esosomi, il raggio laser è orientato verticalmente. Le particelle irradiate dalla dispersione laser la luce, che viene registrata meno di 90 ° da una videocamera digitale attraverso il microscopio (Figura 1). L'intensità della luce diffusa consente l'osservazione di particelle più grandi di 60 nm di diametro. In una tale impostazione di luminosità di una particella non è l'unica indicazione della dimensione delle particelle. Quando viene applicato alcun campo elettrico, il movimento delle particelle segue solo moto browniano e può servire come indicatore per il calcolo delle dimensioni delle particelle. Tuttavia, lo strumento è in grado di applicare un campo elettrico attraverso il canale della cella. Quando sono sottoposti a questo campo, il potenziale, polarità e livello di ionica-carica delle exosomes sospesi diventano ulteriori determinanti della direzione del loro movimento. Velocità e direzione risultato in un mo elettroforeticobilità istogramma.
Mentre trovare un metodo ottimale per analizzare exosomes isolato è un problema, un altro sta nella effettiva isolamento di exosomes di diversi mezzi, come sangue, ascite, urina, latte, liquido amniotico o supporto cellulare. Sono stati descritti finora metodi diversi, che si basano su ultracentrifugazione 1, reagenti di separazione industriali (come Exoquick) 7, sfere magnetiche per l'antigene che impiegano la separazione 8 o ultrafiltrazione passi 9.
In questo protocollo dimostriamo l'intero processo di isolamento exosome via ultracentrifugazione e mostrare come analizzare il exosome conseguente sospensione contenente attraverso lo strumento di monitoraggio delle particelle. Sono fornite considerazioni specifiche per l'analisi delle medie plasma o coltura cellulare umana esosomi derivati.
NOTA: Gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati approvati dal Consiglio etico istituzionale dell'Università di Dusseldorf.
1. Exosome Preparazione
2. Procedura di avvio del Particle strumento di monitoraggio
3. Misurazione del campione
4. Interpretazione dei risultati
Il campione utilizzato per questa dimostrazione mostra un ambiente ottimale per la misura con una sensibilità del 85%, prima della massima pendenza della curva di sensibilità (Figura 2). La luminosità, il min / max valori sono stati scelti come raccomandato nel protocollo. Una concentrazione di 5,3 particelle / ml x 10 6 è stata misurata, mentre la dimensione media delle particelle era 0,149 micron, la maggior parte erano 0,137 micron.
I valori ricevuti dopo la misurazione possono essere salvati in un report con un formato di file .pdf o come .txt per l'esportazione in un database. Il grafico può essere regolata a piacere, come descritto nel protocollo (sezione 4). La sequenza video viene inoltre memorizzato e può essere utilizzato per più tardi off-line rianalisi. Tuttavia, in tale analisi off-line, le impostazioni pre-acquisizione della fotocamera non possono essere modificate con effetto retroattivo.
Per trovare le impostazioni dei parametri ottimali per una misura, noi qui descriviamo the ottimizzazione delle impostazioni dello strumento sulla esempio di un formato di polistirene standard 100 nm. L'influenza di due parametri, sensibilità e min / max dimensioni sull'immagine video e granulometria distribuzione è discusso in dettaglio. Tutti gli altri parametri sono riassunti in Tabella 1.
Una impressione visiva dell'impatto della sensibilità (da 50 a 94) sulle immagini analogiche e digitali è visualizzato in Figura 3. Le informazioni quantitative derivate dalle immagini è presentato nella Figura 4, in base alle impostazioni della Tabella 1, Dimensione min = 5 e Max Size = 200. Un tipico rapporto del numero di particelle rilevate vs sensibilità è mostrato in Figura 4A. Tra 50 e 90, il numero di particelle rilevate aumentato con sensibilità e aumentato drammaticamente per sensibilità> 90. È stato trovato un intervallo ottimale di sensibilità tra 66 e 86 (A). Granulometrie ottenuti con difimpostazioni di sensibilità ferenti sono illustrati nella Figura 4B. Le distribuzioni granulometriche rappresentano la media di tre misurazioni individuali. Per troppo bassa sensibilità (sensibilità = 62, curva rossa) sono stati analizzati solo poche particelle causando statistiche piuttosto poveri. Il numero di particelle analizzati aumentata con sensibilità e raggiunto un ottimale tra 70 (curva gialla) e 86 (curva tan). Aumentando ulteriormente il vantaggio sensibilità ad un deterioramento della distribuzione granulometrica con il numero di particelle che cadono e distribuzione dimensionale spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità = 94, curva blu). La figura 4C mostra l'andamento del diametro x50 basato sul numero (50% particelle sono più piccole di questo diametro) in funzione della sensibilità. Nell'intervallo beige, l'RSD delle dimensioni delle particelle è inferiore all'8% e corrisponde all'intervallo ottimale in A. Le regioni rosse indicano RSD> 8% a causa di statistiche poveri (sensibilità troppo bassa) o ampia distributi con spostamento verso dimensioni più piccole (sensibilità troppo alta).
Le impostazioni di Dimensione min e Max Size sono filtri applicati alle immagini digitali, al fine di rimuovere le particelle di dimensioni inferiori a pronti Dimensione min e più grandi di Max Size. Grazie alla capacità di diffondere la luce, una particella crea un punto di una certa dimensione in una immagine digitale. La dimensione dello spot è misurato come numero di pixel (px). Quando una particella diffonde la luce molto bene (ad esempio, particelle> 200 nm o inerti), la dimensione del punto è abbastanza grande, ad esempio,> 500 px. La dimensione del punto è piuttosto piccola (ad esempio, <10 px) per le piccole particelle (ad esempio, <20 nm) a seconda del materiale particellare. Dimensioni Spot (px), non può essere scambiato con granulometria (nm), in quanto non sono identici e non vi è alcun rapporto diretto tra queste due variabili. Un'ottimizzazione di Min e Max Size permette all'utente di filtrare gli oggetti indesiderati come agglomerati (Dimensione massima) o piccolooggetti come rumore di fondo (Dimensione min). L'influenza di Min / Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle di dimensioni standard 100 nm è mostrato in Figura 4D (sensibilità = 82). Quando l'intervallo è impostato su piccoli formati in loco (ad esempio, min = 1, max = 52; curva arancione), il numero di particelle analizzate si riduce e il diametro x50 basato numero è leggermente spostata verso dimensioni più piccole. Un ambiente per le macchie più grandi (min = 40, max = 1.000; curva rossa) si traduce in una vasta distribuzione granulometrica spostata verso formati più grandi. Al fine di ottenere la parità di numero totale di particelle, i confini di intervallo delle distribuzioni sia arancione e rosso sono stati adeguati in base 80 particelle. La distribuzione con le impostazioni ottimali (min = 5, max = 200; curva tan) è composto da 360 particelle.
Una serie di esperimenti sono stati eseguiti con successo esosomi isolato mediante ultracentrifugazione e misurati da NTA utilizzando il sistema presentato. I dati risultanti erano altamentecoerente e confermato un elevato livello di riproducibilità. Altri metodi di isolamento dovrebbe mostrare risultati simili. Tuttavia, la fase di diluizione è stato identificato come un passo particolarmente critico e il suo impatto sul numero totale calcolato di particelle deve essere rivalutato.
Figura 1. Schema del setup della NTA. L'asse microscopio / video e laser sono orientati ortogonalmente tra loro, attraversano la sezione trasversale canale della cella. Luce diffusa dalle particelle viene visualizzato nella finestra "live-view" del software. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Impatto di sensibilità da analogico e digitale delle immagini. Visualizzazione di particelle sullo schermo live view viene visualizzato per sensibilità tra 50 e 94 sia analogica (riga in alto) und vista digitali (fila in basso). Quando la sensibilità è troppo bassa, solo poche particelle vengono rilevati (a sinistra). Alla sensibilità ottimale le particelle appaiono come singoli punti e isolati gli uni dagli altri (al centro). A un relativamente elevati particelle sensibilità si fondono portando ad una scarsa qualità dell'immagine (a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Influenza delle impostazioni di dimensione max sensibilità min e per un campione di controllo di 100 nm polistirolo particelle (A) Trama di sensibilità in funzione del numero rilevato di particelle.; l'intervallo ottimale è 66-86, prima della massima pendenza della curva. Distribuzioni (B) dimensione delle particelle ottenute con diverse impostazioni di sensibilità (62-94); grafici per troppo bassa (62) o troppo alto (94) sensibilità non catturano la distribuzione delle dimensioni delle particelle per il campione di controllo polistirene 100 nm. (C) Numero basato diametro x50 contro sensibilità; l'errore di x50 nell'intervallo beige è inferiore a 8%, intervallo ottimale è da 66 a 86. (D) Effetto Min e Max Size sulla distribuzione delle dimensioni delle particelle; parametri ottimali (min = 5 e max = 200) catturano la distribuzione corretta per il campione di controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Parametri pre-acquisizione | |
| Sensibilità | variabile |
| Otturatore | 40 |
| Frame rate | 30 fps |
| Risoluzione | Ciaogh |
| Cicli | 10 |
| Più Acquisizioni | 3 |
| Posizione | 1 |
| Parametri post-acquisizione | |
| Min Luminosità | 30 |
| Max Size | variabile |
| Min Size | variabile |
Tabella 1. Sintesi dei parametri pre e post-acquisizione per l'impostazione dello strumento di monitoraggio delle particelle.
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi istituzionali del Dipartimento di Chirurgia Cardiovascolare, Facoltà di Medicina, HHU. I costi di pubblicazione di questo studio sono stati forniti da Particle MetrixGmbH.
In questo articolo viene presentato un metodo per l'isolamento degli esosomi dal sangue intero e un'ulteriore analisi mediante tracciamento di nanoparticelle utilizzando uno strumento semiautomatico. La tecnologia presentata fornisce un metodo estremamente sensibile per la visualizzazione e l'analisi delle particelle in sospensione liquida.
Gli autori ringraziano Christina Ballázs, Hug Aubin e Jörn Hülsmann per la lettura critica del manoscritto e l'eccellente assistenza editoriale. Inoltre, gli autori ringraziano Gisela Mueller per l'assistenza tecnica. Gli autori ringraziano Particle Metrix GmbH per aver fornito i fondi che coprono i costi di pubblicazione.
| Provetta per citrato | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Acqua distillata | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Provetta Falcon | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15 ml |
| Provetta per ultracentrifugazione | Beckman | 357448 | Provetta per microfuga Poliallomero 1,5 ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solidi-Latex |
| Siringa per soluzione di allineamento (filtro) | Braun | 4617053V | Siringada 5 ml |
| (ZetaView) | Braun | 4606051V | Agoda 5 ml |
| BD | 305180 | BD Filtro per aghi di riempimento smussato | |
| Sartorius Stedim | 16555 | Filtro per siringa, idrofilo, 450 &; m | |
| Ultracentrifuga | Beckman | L8-M | Rotore: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Tipo 101 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 5804R | Rotore: A-4-44 |
