Articolo metodologico

Isolamento di ghiandole multicellulari vitali dal tessuto della pianta carnivora, Nepenthes

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DOI:

10.3791/50993

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22 dicembre 2013

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1Laboratoire Agronomie et Environnement, Université de Lorraine, 2Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3aura optik

In questo articolo

Sommario

Le ghiandole vegetali sono strutture specializzate responsabili della biosintesi e della secrezione di molti composti coinvolti nelle interazioni con l'ambiente biotico. Per consentire lo studio delle loro caratteristiche molecolari e biochimiche, è stata messa a punto una tecnica di micropreparazione meccanica per isolare singole ghiandole metabolicamente attive, qui dalla pianta carnivora Nepenthes.

Abstract

Molte piante possiedono strutture specializzate che sono coinvolte nella produzione e secrezione di specifici composti e proteine a basso peso molecolare. Queste strutture sono quasi sempre localizzate sulle superfici delle piante. Tra questi ci sono i nettari o tricomi ghiandolari. I composti secreti sono spesso impiegati nelle interazioni con l'ambiente biotico, ad esempio come attrattivi per gli impollinatori o deterrenti contro gli erbivori.

Ghiandole uniche sotto diversi aspetti si possono trovare nelle piante carnivore. Nelle cosiddette piante carnivore del genere Nepenthes, le ghiandole bifunzionali all'interno della trappola a caduta da un lato secernono il fluido digestivo, compresi tutti gli enzimi necessari per la digestione delle prede, e dall'altro assorbono i nutrienti rilasciati. Pertanto, queste ghiandole rappresentano un tessuto ideale e specializzato predestinato a studiare i meccanismi molecolari, biochimici e fisiologici sottostanti alla secrezione proteica e all'assorbimento dei nutrienti nelle piante. Inoltre, in generale la biosintesi di composti secondari prodotti da molte piante dotate di strutture ghiandolari potrebbe essere studiata direttamente nelle ghiandole.

Per lavorare su tali strutture specializzate, devono essere isolate in modo efficiente, veloce, metabolicamente attivo e senza contaminazione con altri tessuti. Pertanto, è stata sviluppata e applicata una tecnica di micropreparazione meccanica per studi sul fluido di digestione Nepenthes. Qui viene presentato un protocollo che è stato utilizzato per preparare con successo singole ghiandole bifunzionali dalle trappole di Nepenthes, basato su una piattaforma di microcampionamento meccanizzato. Le ghiandole potrebbero essere isolate e utilizzate direttamente per l'analisi dell'espressione genica mediante tecniche di PCR dopo la preparazione dell'RNA.

Introduzione

Le piante producono una grande varietà di composti con diverse applicazioni industriali e farmaceutiche, che vanno da molecole di basso peso molecolare a polimeri. Tali composti sono spesso prodotti e secreti da strutture altamente specializzate, molte delle quali localizzate sulla superficie delle piante, come i tricomi glandolari o le nettarie, oppure all'interno, come gli idioblasti o i dotti del lattice e della resina, rispettivamente. Tuttavia, si conosce relativamente poco sulla biologia di queste strutture secretorie specializzate, sebbene tutti i tipi di queste ghiandole presentino numerose caratteristiche indicative di un metabolismo attivo. In particolare, le ghiandole delle piante carnivore come Nepenthes possono essere considerate sistemi modello nella biologia cellulare vegetale1.

Le piante carnivore sono oggetto di numerosi studi dal 1875, anno di pubblicazione dell'opera di Charles Darwin 'Le piante insettivore'2Tuttavia, solo negli ultimi anni sono state condotte ricerche a livello molecolare e tuttora le nostre conoscenze sono limitate. Ad esempio, la composizione proteica del fluido digestivo nelle piante carnivore del genere *Nepenthes* Nepenthes non è ancora completamente noto. Solo recentemente sono state identificate diverse proteine idrolitiche e alcuni dei corrispondenti geni3. Nei trappole a caduta di Nepenthes (Figura 1), le ghiandole pluricellulari sono localizzate nella parte interna inferiore dei bricchi. Queste ghiandole producono e secernono enzimi digestivi nel liquido contenuto nel bricco e assorbono i nutrienti disciolti dallo stesso liquido4. Pertanto, queste ghiandole bifunzionali rappresentano un microtessuto unico con una posizione e una funzione centrali nella carnivoria di Nepenthes che merita di essere studiato in dettaglio.

Anatomia della pianta carnivora, dettaglio dell'urna di Nepenthes, studio botanico, meccanismo della trappola, adattamento.
Figura 1. Urna di Nepenthes alata. La parte inferiore dell'urna contiene il liquido digestivo e le ghiandole sulla superficie interna. Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita.

Nelle scienze vegetali, molti approcci sperimentali si basano su "materiale bulk" poiché non viene analizzato un tessuto definito, ma organi interi. Di conseguenza, la loro omogeneizzazione e analisi possono fornire risultati solo diluiti e proporzionali rispetto ai singoli tessuti e cellule5. Per risolvere questo problema, sono state sviluppate e utilizzate con successo tecniche di micropreparazione, come ad esempio la cosiddetta microdissezione laser assistita (LCM), per raccogliere tessuti vegetali specifici e analizzarne i contenuti individuali6. Tuttavia, la LCM è spesso limitata quando si mira a componenti cellulari instabili e/o rapidamente degradabili, come l'RNA. In tal caso, la necessità di una fissazione preliminare del tessuto, che richiede tempo ed è spesso accompagnata da degradazione delle biomolecole, rappresenta uno svantaggio. Inoltre, a causa dell'elevato contenuto idrico di molti tessuti vegetali e della resistenza delle pareti cellulari, la LCM ha spesso fallito nel preparare direttamente tessuti freschi7. Ogni approccio volto a studiare componenti cellulari presenti nelle ghiandole secretorie, dai geni, mRNA e proteine ai composti secondari e alla loro biosintesi, richiede tecniche alternative per la preparazione specifica. Pertanto, sono necessarie tecniche specifiche per isolare singole cellule o persino ghiandole multicellulari che rimangano integre dopo la preparazione.

Viene presentato un metodo che utilizza una piattaforma automatizzata di microcampionamento dotata di visualizzazione microscopica diretta. Questa tecnica è rapida ed efficiente nella preparazione di ghiandole singole provenienti dalle urne delle specie di Nepenthes. Queste ghiandole pluricellulari sono bifunzionali, ovvero sono coinvolte sia nei processi di secrezione che di assorbimento; sono sessili e gli strati cellulari non esposti sono impregnati per formare un endoderma. Le ghiandole intere possono essere isolate senza tessuto adiacente e depositate in modo ben definito in una provetta per PCR. Questa tecnica viene applicata per lo studio di geni specifici nonché dell'espressione genica nei tessuti delle ghiandole.

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Protocollo

1. Preparazione del materiale vegetale

  1. Tutte le specie di Nepenthes sono state coltivate nelle serre dell'MPI per l'ecologia chimica o nell'Orto botanico di Jena, in Germania.
  2. Per la preparazione del tessuto secernente, prelevare una brocca e rimuovere il terzo superiore, compreso il coperchio, il peristoma e la zona scivolosa. La caraffa può essere utilizzata fresca o congelata in azoto liquido e conservata a -80 °C.

2. Microdissezione del tessuto dell'ascidio

  1. La piattaforma di microcampionamento è costituita da uno stereomicroscopio e da un micromanipolatore, che è collegato direttamente al corpo del microscopio ed è azionato da un joystick 3D. Qui, un primo prototipo di aureka è stato utilizzato come documentato (Figura 2A).
  2. Per la dissezione delle ghiandole secretorie dagli ascidi di Nepenthes utilizzare una micropinza e attaccarla al manipolatore (Figure 2A e 2B).
  3. Per l'estrazione dell'RNA, trattare tutti gli strumenti (lame di rasoio, pinzette, micromanipolatore, micropinze, vetrino per oggetti) con RNaseZAP.
  4. Preparare le provette di raccolta aggiungendo 9 μl di acqua priva di nucleasi e 1 μl di inibitore della RNasi in una provetta PCR per l'estrazione dell'RNA. Per la PCR diretta da campioni di tessuto, utilizzare solo acqua priva di nucleasi (10 μl).
    1. Prendi la brocca fresca o congelata e rimuovi un pezzo di tessuto di 1-2 cm2 contenente le ghiandole secretorie usando una lama di rasoio e una pinzetta. Lavare il fazzoletto con acqua; aggiungere lo 0,1% di dietilpirocarbonato (DEPC) se l'RNA verrà estratto.
    2. Fissare il materiale vegetale con nastro biadesivo su un vetrino per oggetti (la superficie coperta dal pressacavo deve essere rivolta verso l'alto, Figure 2C e 2D) e fissare il vetrino con nastro adesivo su un tavolino universale, che deve essere applicato con un tavolo mobile.
    3. Per l'estrazione degli acidi nucleici la preparazione deve essere fatta con ghiaccio. Prendete quindi una scatola piatta di polistirolo, posizionate all'interno il tavolino universale contenente il campione e riempite la scatola di ghiaccio. Successivamente, posizionare la scatola sotto il microscopio.
    4. Per la preparazione il posizionamento delle ghiandole è molto importante. Le ghiandole secretorie sono parzialmente coperte da un cappuccio protettivo (Figura 3) e accessibili solo dalla pinza da un lato. Inoltre, l'angolo del campione rispetto alla pinza deve essere regolato inclinando la tavola del tavolino universale di circa 135°, a seconda della specie di Nepenthes.
    5. La microdissezione viene eseguita sotto controllo visivo. Per l'isolamento delle ghiandole, utilizzare un filtro non UV, per limitare la degradazione di DNA e RNA.
    6. Spostare il micromanipolatore e la pinza tramite il pannello di controllo fino al pressacavo selezionato. Una volta raggiunta la ghiandola, posizionare ciascun braccio della pinza su entrambi i lati della ghiandola. Rimuovere la ghiandola dal tessuto rimanente chiudendo la pinza (Figura 4A).
    7. Dirigere il premistoppa attaccato alla pinza lontano dall'oggetto e al tubo di raccolta. Portare le punte delle pinze a contatto con la soluzione nel tubo (Figura 4B). Il rilascio della ghiandola aprendo la pinza deve essere ben osservato, perché le ghiandole tendono ad attaccarsi alla punta dell'utensile. Il tessuto può essere conservato a -80 °C fino all'estrazione con PCR o RNA.

3. Amplificazione diretta della PCR dal tessuto Nepenthes

  1. Per dimostrare l'efficienza del metodo di preparazione, è possibile eseguire un approccio PCR direttamente dal tessuto ghiandolare senza una fase di estrazione del DNA.
  2. Per l'amplificazione della PCR utilizzare primer gene specifici; qui codificano per la sequenza di una proteina thaumatin-like (TLP) (forward: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', reverse: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAAACAAC-3').
    1. Raccogliere 1-5 ghiandole in una provetta per PCR contenente 10 μl di acqua priva di nucleasi. Per una reazione da 50 μl aggiungere 5 μl di tampone Taq 10x, 1 μl 10 mM di deossinucleosidi trifosfati (dNTP), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) di Taq DNA polimerasi, 1 μl (100 pmol) di ciascun primer e 28,6 μl di acqua priva di nucleasi.
    2. Eseguire le reazioni di PCR in un termociclatore con il seguente programma: denaturazione iniziale a 94 °C per 3 minuti; 35 cicli di denaturazione (94 °C per 30 secondi), ricottura (59 °C per 30 secondi) e prolungamento (72 °C per 1 minuto); e una fase finale di estensione di 10 minuti a 72 °C.
    3. Dimostrare l'amplificazione del prodotto PCR utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio. Utilizzare quindi l'agarosio all'1,5% (p/v) e scioglierlo in 1 tampone TAE (40 mM di base Tris, 20 mM di acido acetico glaciale, 1 mM di EDTA, pH 8). Scaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto. A 100 ml di soluzione di agarosio, aggiungere 1 μl di bromuro di etidio (10 μg/μl) per la visualizzazione a valle. Far funzionare il gel in 1x tampone TAE a 300 V, 115 mA per circa 20 minuti in una camera di elettroforesi. La dimensione corretta dell'amplicone TLP deve essere a 690 bp.

4. Estrazione dell'RNA da piccoli campioni di tessuto e trascrizione inversa

  1. Eseguire i seguenti passaggi sul ghiaccio. Per l'estrazione dell'RNA sono stati utilizzati due metodi di estrazione, un Micro Kit per l'estrazione dell'RNA totale e un kit di isolamento dell'mRNA applicato con biglie magnetiche.
  2. Raccogliere almeno 30 ghiandole secretorie mediante micropreparazione in una provetta PCR contenente 1 μl di inibitore della RNasi e 9 μl di acqua priva di nucleasi. Successivamente lisare il tessuto in un termociclatore per 10 minuti a 75 °C.
  3. Estrazione dell'RNA totale.
    1. Dopo la preparazione, aggiungere 90 μl di soluzione di lisi al campione e incubare per 10 minuti a 75 °C. Successivamente caricare la miscela di reazione sulla colonna (fornita con il kit) e procedere con le fasi di lavaggio come descritto nel manuale del produttore.
    2. Eluire l'RNA due volte con 10 μl di soluzione di eluizione e continuare con il trattamento con DNasi I.
    3. Ai 20 μl di RNA estratto, aggiungere 2 μl di tampone 10x DNasi I e 1 μl di DNasi I (fornito con il kit di estrazione dell'RNA) e incubare 1 ora a 37 °C. Arrestare la reazione aggiungendo 2 μl di reagente di inattivazione DNasi e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Dopo una fase di centrifugazione per 1,5 minuti alla massima velocità, l'RNA può essere trasferito in una provetta fresca priva di RNasi. Determinare la concentrazione di RNA di ciascun campione utilizzando uno spettrofotometro. I campioni devono essere conservati a -80 °C.
  4. Estrazione dell'mRNA mediante biglie magnetiche.
    1. Regolare il volume del campione a 100 μl con il tampone di lisi/legante (fornito nel kit) e incubare per 10 minuti a 75 °C. Aggiungere 20 μl di biglie magnetiche fornite con una sporgenza Oligo (dT)25 e mescolare la reazione per 5 minuti a temperatura ambiente. L'mRNA si lega attraverso la coda di poli(A) alla sporgenza dell'Oligo (dT)25 delle perle.
    2. Eseguire le fasi di lavaggio dell'mRNA legato alle biglie magnetiche seguendo il protocollo del produttore. Le soluzioni possono essere rimosse utilizzando un magnete. Risospendere le perle in 20 μl di tampone Tris-HCl da 10 mM (pH 7,5).
    3. Rimuovere le contaminazioni del DNA genomico trattando il campione con 2U (1 μl) di DNasi (2 μl di tampone DNasi 10x e 17 μl di acqua priva di nucleasi) per 1 ora a 37 °C. Successivamente, la soluzione enzimatica viene rimossa dal magnete e le microsfere vengono risospese in 20 μl di tampone Tris-HCl da 10 mM. Non è possibile misurare la concentrazione di RNA poiché è attaccato alle perline. I campioni devono essere conservati a -80 °C.
  5. Per la trascrizione inversa utilizzare un kit di sintesi del cDNA. Le reazioni sono state eseguite seguendo il protocollo del produttore.
    1. Per la trascrizione inversa dell'RNA totale, aggiungere 1 μl (100 pmol) di primer Oligo (dT)20 o 1 μl (0,4 μg) di esameri casuali, 1 μl di inibitore della RNasi e 1 μl di miscela dNTP da 10 mM a 1 μg di RNA e regolare il volume a 14 μl con acqua priva di nucleasi. Incubare a 65 °C per 5 minuti e successivamente porre i campioni sul ghiaccio. Aggiungere 1 μl di DTT 0,1M, 1 μl di trascrittasi inversa e 4 μl di tampone RT 5x. Le reazioni vengono incubate per 55 minuti a 50 °C, seguite da una fase di inattivazione a 70 °C per 10 minuti. Dopo la trascrizione inversa, i campioni possono essere conservati a -20 °C.
    2. Per l'mRNA legato alle biglie magnetiche, sostituire il tampone Tris-HCl con la prima miscela di reazione (1 μl di inibitore della RNasi, 1 μl di miscela dNTP da 10 mM e 12 μl di acqua priva di nucleasi) e incubare per 5 minuti a 65 °C. A causa della sporgenza Oligo (dT)25 delle perline, non è necessario aggiungere un primer Oligo (dT)20 o esameri casuali ai campioni. Successivamente seguire il protocollo sopra (passaggio 4.5.1).
    3. Misurare la concentrazione di cDNA con uno spettrofotometro. Conservare i campioni a -20 °C.

5. PCR in tempo reale

  1. Per le analisi con Real-time PCR utilizzare l'RNA totale estratto con il Micro Kit e un SYBR Green QPCR Master Mix. Per garantire una quantità uguale di trascritti, regolare la concentrazione di cDNA di ciascun campione allo stesso valore dopo la trascrizione inversa.
  2. Oltre ai campioni, inserire reazioni di controllo. Utilizzare un controllo senza modello per verificare la presenza di contaminanti nei reagenti e per verificare la qualità dei primer. Per verificare l'assenza di DNA genomico eseguire un controllo non-RT. Entrambe le reazioni devono essere negative (nessun segnale di fluorescenza) nella PCR in tempo reale.
  3. Per garantire un livello di trascrizione uguale tra i diversi campioni, utilizzare almeno un gene di riferimento. Qui, sono state utilizzate coppie di primer progettate che codificano per un'actina (avanti: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', inverso: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') e un 18SrRNA (avanti: 5'-CTTGATTCTATGGGGGGTGGTG-3', inverso: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3'). Come gene bersaglio è stato scelto il TLP (forward: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', reverse: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3'). La dimensione di ogni frammento amplificato era di circa 100 bp.
  4. Per una reazione di 25 μl aggiungere 12,5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), 400 nM di ciascun primer e 30 nM del colorante di riferimento passivo ROX (fornito con il kit). Regolare il volume del campione a 25 μl con acqua priva di nucleasi.
  5. Le reazioni sono state eseguite in un termociclatore QPCR con il seguente programma: denaturazione iniziale a 95 °C per 10 minuti per attivare la polimerasi; 40 cicli di denaturazione (95 °C per 30 sec), ricottura (61 °C per 60 sec) ed estensione (72 °C per 1 min); seguita dalla curva di dissociazione (95 °C per 60 sec, 55 °C per 30 sec, 95 °C per 30 sec). La curva di dissociazione è necessaria per determinare l'assenza di dimeri di primer, che può essere rilevata da un picco aggiuntivo.
  6. Determinare l'efficienza (E) di ciascuna reazione PCR utilizzando il metodo di Liu e Saint8. L'efficienza può essere deviata dalla parte lineare della curva di amplificazione. Qui il numero relativo di ampliconi (Rn, A) di un punto di ciclo (CPA) è legato alla quantità di ampliconi (Rn, B) di un altro ciclo (CPB).
  7. Analizza i risultati della PCR in tempo reale con il Relative Expression Software Tool (REST 2009, http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html) o un software simile. Utilizzare il programma per calcolare il rapporto di espressione di un gene in un campione trattato rispetto a un controllo.

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Risultati

Per la preparazione di ghiandole singole a partire dal tessuto delle bottiglie di Nepenthes, è stata sviluppata e applicata una tecnica di microdissezione meccanizzata. La piattaforma di micropreparazione deve essere dotata di micropinzette, fissate al micromanipolatore, che a loro volta sono azionate da un pannello di controllo. Le singole ghiandole, visibili al microscopio, possono essere individuate con le pinzette, che afferrano il tessuto ghiandolare e lo rimuovono meccanicamente (Figura 4A...

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Discussione

Per molto tempo, gli studi sulle strutture secretorie delle piante, in particolare sui tricomi, sono stati eseguiti essenzialmente sull'anatomia ed erano puramente descrittivi. C'è un ampio corpus di pubblicazioni di questo tipo, come riassunto nelle recensioni di9-11. La nostra conoscenza biochimica e molecolare delle strutture secretorie delle piante è ancora limitata, nonostante alcuni lavori iniziali notevoli , ad esempio sui tricomi ghiandolari della menta, che dimostrano che i tricomi ghiandolar...

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il team della serra presso l'MPI-CE presso l'Orto Botanico dell'Università Friedrich Schiller, Jena, per la coltivazione delle piante e Wilhelm Boland e la Max Planck Society per il supporto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RNAqueous-Micro KitLife Technologies GmbH, GermaniaAM1931Isolamento di RNA totale, 50 campioni
Dynabeads mRNA DIRECT Micro KitLife Technologies GmbH, Germania610115 ml Dynabeads Oligo (dT)25
DynaMag-2 magnetLife Technologies GmbH, Germania12321D
SuperScript CellsDirect cDNA Synthesis SystemLife Technologies GmbH, Germania18080-20025 reazioni
RNaseOUTLife Technologies GmbH, Germania10777-019Inibitore della RNASI, 5.000 unità
Esaminatori casuali (0,4 μ g/μ l)QIAGEN GmbH, Germania79236100 μ l
10 mM dNTP Mix, grado di biologia molecolareFermentas GmbH, GermaniaR01921 ml
Taq DNA polimerasi, (ricombinante)Fermentas GmbH, GermaniaEP0402Fornito con 10 tamponi Taq (con KCl o (NH4)2SO4) e 25 mM di MgCl2
TURBO DNaseLife Technologies GmbH, GermaniaAM22381.000 unità
AgaroseCarl Roth GmbH Co. GermaniaT846.3
GeneRuler Scala DNA a bassa gamma, pronto all'usoFermentas GmbH, GermaniaSM119350 μ g
Brilliant II SYBR Green QPCR Master MixAgilent Technologies, Inc., USA600828Kit singolo
RNaseZAPSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermaniaR2020
Lama di rasoioCarl Roth GmbH Co., GermaniaCK08.1
PinzetteCarl Roth GmbH Co., Germania2801.1 / 2855.1
GE Spettrofotometro NanoVueGE Healthcare Europe GmbH, Germania28-9569-62
Mastercycler gradientEppendorf AG, Amburgo, Germania5331 000.010
Mx3000P Sistema di PCR in tempo realeStratagene, USA401403
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis ChamberBiometraDiscontinued
Micromanipolatoreaura optik gmbhaureka aurekaDotato di una micropinza
StereomicroscopioCarl Zeiss Microscopy, Jena, GermaniaSteREO Lumar.V12Dotato di un set di filtri AxioCam
Lumar 01Carl Zeiss, Microscopia, Jena, Germania485001-0000-000Filtro UV
Set di filtri Lumar 09Carl Zeiss, Microscopia, Jena, Germania485009-0000-000filtro non UV

Riferimenti

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