Raccolta e identificazione di elminti dalla fauna selvatica

Sommario

Gli animali selvatici sono comunemente parassitati da una vasta gamma di elminti. I quattro tipi principali di elminti sono "nematodi" (nematodi), "vermi dalla testa spinosa" (acantocefali), "trematodi" (trematodi) e "tenie" (cestodi). Qui descriviamo come gli elminti vengono raccolti da un animale vertebrato e come vengono conservati e identificati tassonomicamente.

Abstract

Gli animali selvatici sono comunemente parassitati da una vasta gamma di elminti. I quattro tipi principali di elminti sono i "nematodi" (nematodi), i "vermi dalla testa spinosa" (acantocefali), i "trematodi" (trematodi) e le "tenie" (cestodi). Il metodo ottimale per raccogliere gli elminti è quello di esaminare un ospite che è morto da meno di 4-6 ore poiché la maggior parte degli elminti sarà ancora viva. Deve essere condotta un'accurata necroscopia ed esaminati tutti gli organi principali. Gli organi vengono lavati su un setaccio da 106 μm sotto l'acqua corrente e il contenuto viene esaminato con uno stereomicroscopio. Tutti gli elminti vengono contati e viene fissato un numero rappresentativo (in etanolo al 70%, formalina tamponata al 10% o acido alcolico-formalina-acetico). Per l'identificazione delle specie, gli elminti vengono eliminati in lattofenolo (nematodi e piccoli acantocefali) o colorati (trematodi, cestodi e grandi acantocefali) utilizzando l'ematossilina di Harris o il carminio di Semichon. Gli elminti sono collegati alle specie esaminando diverse strutture (ad esempio le spicole maschili nei nematodi o il rostellum nei cestodi). I protocolli qui descritti possono essere applicati a qualsiasi animale vertebrato. Richiedono una certa esperienza nel riconoscere i diversi organi ed essere in grado di differenziare gli elminti da altri detriti di tessuto o contenuti intestinali. La raccolta, la conservazione e la colorazione sono tecniche semplici che richiedono attrezzature e reagenti minimi. L'identificazione tassonomica, in particolare delle specie, può richiedere molto tempo e potrebbe richiedere la presentazione di campioni a un esperto o l'analisi del DNA.

Introduzione

I vertebrati sono parassitati da quattro gruppi principali di elminti (vermi). Due dei gruppi, i trematodi, o trematodi, e i cestodi, o tenie, rientrano nel Phylum Platyhelminthes. Gli altri due gruppi sono i nematodi, o nematodi, (Nematoda) e gli acantocefali, o vermi dalla testa spinosa (Acanthocephala). Molti di questi parassiti sono stati documentati come cause di morbilità e mortalità negli uccelli selvatici e nei mammiferi^1,2.

La maggior parte degli elminti ha cicli di vita complessi che coinvolgono più di un ospite^1,2 . Ad esempio, i trematodi hanno uno o due ospiti intermedi (di solito invertebrati) e un ospite finale. Tutte le ostie devono essere disponibili per il completamento del ciclo e quindi per gli elminti adulti che devono essere presenti nelle ostie finali (che sono l'argomento di questo manoscritto). Quindi è importante tenere presente che possono verificarsi fluttuazioni stagionali nella prevalenza e nell'intensità di alcune specie di elminti e il monitoraggio a lungo termine è auspicabile per catturare l'intero elminto di auna di un particolare ospite.

Il metodo ottimale per raccogliere elminti è esaminare un ospite che è stato soppresso. Ciò consente la raccolta degli elminti mentre sono ancora vivi e il loro corretto rilassamento e fissaggio. Il materiale proveniente da ospiti che sono stati morti per più di 24 ore, o che sono stati congelati e scongelati per l'esame, è spesso inferiore e difficile da identificare. I trematodi e i cestodi provenienti da ospiti congelati o formalizzati sono spesso mal contratti e hanno perso strutture cruciali per l'identificazione, come le spine orali sui trematodi o gli uncini sullo scolice delle tenie. Tuttavia, la realtà è che la maggior parte del materiale disponibile dagli ospiti vertebrati in questi giorni è congelato o conservato.

I database contenenti informazioni sulla sequenza del DNA per gli elminti stanno crescendo rapidamente e quindi l'identificazione tassonomica è già possibile per molte specie. Pertanto, gli elminti dovrebbero essere conservati il più possibile per potenziali analisi del DNA. Tuttavia, il DNA di buona qualità non è possibile se i campioni sono fissati in formalina. I metodi qui descritti per la raccolta e l'uccisione degli elminti produrranno materiale adatto per l'estrazione del DNA e le analisi genetiche.

Di seguito, descriviamo metodi dettagliati su come eseguire l'necroscopia dei vertebrati (anfibi, rettili, uccelli e mammiferi; i trematodi monogenei dei pesci non sono inclusi) per la raccolta di elminti, seguiti dalle procedure su come conservarli ed elaborarli per l'identificazione tassonomica.

Protocollo

Gli animali utilizzati nei seguenti esperimenti sono stati trovati morti come vittime della strada.

1. Necroscopia animale e screening degli organi principali per la raccolta di elminti

1. Posizionare l'animale su una superficie piana ed esaminare con una lente d'ingrandimento tutte le aperture esterne, comprese le orecchie, la cavità orale e gli occhi per verificare la presenza di nematodi (rotondi) e trematodi (piatti e non segmentati) (vedi Figura 1).
2. Se lavori con gli uccelli, lava con acqua di rubinetto per inumidire le piume prima della dissezione.
3. Usando una lama affilata o un coltello e con l'aiuto di un paio di pinze da dissezione, praticare un'incisione sulla cavità addominale facendo attenzione a non rompere alcun organo. Per le tartarughe con un carapace duro, usa una sega portatile per tagliare l'osso nell'area del ponte tra gli scudi pettorali e addominali.
4. Aprire la cavità toracica come sopra; per animali di grossa taglia, potrebbero essere necessari tagliaossa o una piccola sega a mano per tagliare le costole.
5. Se si lavora con gli uccelli, esaminare le sacche d'aria in situ prima di rimuovere qualsiasi organo. Se necessario, usa una lente d'ingrandimento.
6. Esaminare entrambe le cavità alla ricerca di nematodi filariali e grandi trematodi.
7. Prima di rimuovere il tratto gastrointestinale dalla cavità addominale, legare un filo vicino all'inizio dell'esofago e un altro alla fine dell'intestino crasso (retto).
8. Separare i seguenti organi toracici in piastre di Petri (o vassoi di vetro se gli organi sono troppo grandi) per l'esame al microscopio stereoscopico (10-30X): cuore e vasi sanguigni principali, trachea e polmoni.
9. Rimuovere il fegato, la cistifellea e i dotti, il pancreas, la milza, i reni e la vescica urinaria ed esaminare come descritto al punto 1.8.
10. Rimuovere l'intero apparato digerente e posizionare ogni sezione in piatti/vassoi di vetro.
11. Dopo che gli organi sono stati rimossi, lavare la cavità corporea con un tubo flessibile o un flacone a spruzzo riempito con soluzione fisiologica allo 0,9% in un setaccio a maglie da 106 μm ed esaminare il contenuto del setaccio con uno stereomicroscopio per la presenza di vermi filariali o trematodi sanguigni.
12. Aprire ogni sezione del tratto digestivo con le forbici, raschiare la mucosa ed esaminare attentamente la presenza di parassiti di grandi dimensioni (>1 cm). Se necessario, usa una lente d'ingrandimento. I proboscici degli acantocefali sono spesso profondamente incorporati nella parete dell'intestino e possono dover essere accuratamente estratti dal tessuto con pinze e/o piccole forbici.
13. Mettere ogni sezione aperta sotto l'acqua corrente e lavare tutto il contenuto in un setaccio da 106 μm come descritto al punto 1.11.
14. Aprire il cuore e i principali vasi sanguigni (polmonare e aorta), la trachea, le vie urinarie e la cistifellea ed esaminare il contenuto allo stesso modo.
15. Taglia e fai a pezzi organi solidi come polmoni, fegato, reni, milza e pancreas usando una lama affilata e una pinza. Lavarli sotto l'acqua corrente in un setaccio da 106 μm come descritto al punto 1.11.
16. Registrare i tipi di parassiti trovati, il numero di ciascun tipo e l'organo o gli organi in cui si trovano. I metodi di fissazione e colorazione sono elencati di seguito.
17. Etichettare le fiale/barattoli posizionando un piccolo pezzo di una semplice scheda scritta a matita (l'inchiostro e le schede a righe "scorreranno" nell'alcol e macchieranno i campioni).

2. Conservazione degli Elminti

1. Per gli elminti che devono essere conservati per studi genetici successivi, metterli direttamente nell'etanolo all'80-90% (senza glicerina). L'etanolo deve essere prodotto diluendo il 95% di etanolo, preferibilmente di grado reagente (Tabella 1). Non permettere mai che questi campioni siano esposti alla formalina, poiché la formalina degrada il DNA in uno stato inutilizzabile.
2. Posizionare i trematodi vivi su un vetrino da microscopio in una goccia di soluzione fisiologica, posizionare un vetrino coprioggetti e passare il vetrino su una fiamma senza far bollire la soluzione salina.
   1. Far cadere il vetrino in una capsula di Petri contenente AFA (alcol-formalina-acido acetico, vedere la Tabella 1) e lasciare che il vetrino galleggiasse via.
   2. Fissare in AFA per uno o più giorni, sciacquare con acqua di rubinetto e trasferire in fiale di vetro da 5 ml (o fiala/barattolo di vetro più grandi a seconda delle dimensioni e della quantità di parassiti) riempite con etanolo al 70% per la conservazione a lungo termine.
3. Fissare i trematodi morti in AFA o formalina tamponata al 10% per 48 ore e quindi trasferire in flaconcino/barattolo riempito con etanolo al 70% per la conservazione a lungo termine.
4. Rilassare i cestodi vivi in una capsula di Petri versandovi sopra dell'acqua quasi bollente e poi trasferirli in una fiala/barattolo riempito con etanolo al 70% per la conservazione a lungo termine.
5. Rilassare gli acantocefali vivi mettendoli in una capsula di Petri per una o più ore in acqua di rubinetto in frigorifero (~4 °C) fino a quando la proboscide non è completamente estroflessa (questo può richiedere fino a 24 ore). Trasferire in flaconcino/barattolo riempito con etanolo al 70% o AFA per la conservazione a lungo termine.
6. Trattare i cestodi e gli acantocefali morti allo stesso modo dei trematodi morti (vedi sopra).
7. Uccidere i nematodi vivi piccoli (<5 mm) o fragili (ad es. tricostrongilidi, capillaridi) in etanolo caldo (quasi bollente) al 70% e conservare in fiala/barattolo riempito con etanolo al 70% con glicerina al 5% (Tabella 1) aggiunta per preservare i vermi in caso di evaporazione.
8. Uccidere (ed eliminare) i nematodi medio-grandi (>5 mm) (ad es. ascaridi, spiruridi, ossiuridi, filaridi) mettendoli in una capsula di Petri con acido acetico glaciale freddo (Tabella 1) e dopo 15 minuti trasferire in una fiala/barattolo riempito con etanolo al 70% e glicerina al 5%. L'acido acetico può essere utilizzato ripetutamente in questo modo.
9. Mettere i nematodi morti direttamente in una fiala/barattolo riempito con il 70% di etanolo e il 5% di glicerina.

3. Identificazione tassonomica degli elminti

1. Preparare l'ematossilina di Harris sciogliendo l'ematossilina in alcool e sciogliendo il solfato di ammonio e alluminio in acqua con calore. Mescolare entrambe le soluzioni e portare a ebollizione.
   1. Aggiungere lo iodato di sodio e far bollire per 2-3 minuti. Filtrare la soluzione (carta da filtro 541) dopo che è tornata a temperatura ambiente.
2. Sovrastirare i trematodi, i cestodi e gli acantocefali lasciandoli in ematossilina di Harris diluita (1:10) o carminio di Semichon per una notte (vedi Tabella 1).
   1. Decolorare con etanolo acido al 70% fino a quando gli organi sono visibili (può richiedere da pochi secondi a oltre un'ora e deve essere attentamente osservato).
   2. Arrestare la decolorazione trasferendo i campioni a etanolo basico al 70% per almeno 30 minuti. Successivamente, disidratarli in una serie di etanoli graduati (80%, 95%, 100%) ed eliminarli in xilene o salicilato di metile.
   3. Montare i campioni su un vetrino da microscopio dopo aver aggiunto una goccia di balsamo del Canada e un vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare per una notte.
3. Eliminare i nematodi e gli acantocefali di piccole e medie dimensioni per 15-30 minuti in montature temporanee di lattofenolo su un vetrino da microscopio con un vetrino coprioggetti.
   1. Utilizzare l'80% di fenolo per un massimo di 60 minuti per grandi nematodi (ascaridi e spiruridi) e acantocefali. Esaminare al microscopio ottico (40-400X) per la valutazione di strutture più piccole (spicole maschili e uncini).
4. Utilizzare i seguenti approcci per l'esame di strutture speciali.
   1. Per i cestodi, tagliare lo scolice e metterlo su un vetrino da microscopio in lattofenolo e "schiacciare" con un vetrino coprioggetti per misurare e contare gli uncini rostellari (vedi Figura 1B).
   2. Per i nematodi, tagliare l'estremità anteriore e montarla su un vetrino da microscopio in alcune gocce di lattofenolo (senza vetrino coprioggetti) o in gelatina glicerica per una montatura permanente (con vetrino coprioggetti) e osservare l'apparato boccale al microscopio ottico (35-400X) (vedi Figura 1D).
   3. Tagliare le code dei grandi nematodi e montarle su un vetrino da microscopio in lattofenolo con vetrino coprioggetti per osservare la morfologia delle papille ventrali e delle spicole dei maschi al microscopio ottico (vedi Figura 1D).
5. Identificare i parassiti nelle specie utilizzando una combinazione di letteratura primaria e riferimenti tassonomici standard come:
   1. Trematodi: Yamaguti (1958, 1971)^3,4 e Gibson et al. ^5-7
   2. Acanthocephalans: Yamaguti⁸
   3. Cestodi: Yamaguti⁹, Schmidt¹⁰ e Khalil et al. ¹¹
   4. Nematodi: Yamaguti¹² e Anderson et al. ¹³

4. Deposito di Elminti nella Collezione Nazionale di Parassiti degli Stati Uniti

1. Deposita esemplari rappresentativi di elminti presso la National Parasite Collection degli Stati Uniti (USNPC). Questo è obbligatorio per la maggior parte delle riviste di parassiti. Dopo la presentazione, a ogni specie di elminti viene assegnato un numero di accesso per l'inclusione nei manoscritti.
2. Includere le seguenti informazioni quando si inviano i campioni: 1) Nome scientifico del parassita; 2) informazioni sull'ospite (specie, coordinate di longitudine/latitudine della posizione geografica); 3) organo trovato nell'ospite; 4) nome di chi ha raccolto gli esemplari e data di raccolta; 5) tipo di fissativo, macchia o mezzi di pulizia/montaggio utilizzati; 6) ubicazione di altre collezioni (numero di museo e numero di accesso) se ulteriori esemplari vengono inviati altrove; e 7) informazioni sulla pubblicazione e sulla rivista. Anche questi dati devono essere inviati insieme ai campioni e in busta separata.
3. Imballare i campioni in contenitori robusti con materiale assorbente antiurto. Fissare con nastro adesivo/Parafilm i tappi a vite sui flaconi di vetro e posizionare ciascun flaconcino in un sacchetto di plastica separato. Avvolgere i vetrini nella carta e metterli in una scatola per vetrini con materiale ammortizzante tra di loro.
4. Spedire gli esemplari e una lettera separata con le informazioni sugli esemplari a: U.S. National Parasite Collection, USDA, ARS, ANRI, Bldg. 1180, BARC-East, 10300 Baltimore Avenue, Beltsville, MD 20705-2350.

Risultati

Utilizzando i metodi descritti in precedenza, è stato condotto un sondaggio sugli elminti dello scorzone mascherato, Sorex cinereus, nella contea di Missoula, Montana, tra il 2007 e il 2011. Un totale di 56 esemplari è stato raccolto tramite trappole a caduta ed esaminato entro 2 ore dalla morte. La prevalenza complessiva di infezione è stata del 96%; soltanto 2 shrew erano privi di parassiti. Sono state identificate quindici specie di elminti, comprese 9 specie di cestodi e 6 specie di nematodi. Una specie appa...

Discussione

È estremamente difficile identificare i parassiti elminti, anche di genere, sulla base di materiale scadente. I cestodi e i trematodi, in particolare, tendono a morire e deteriorarsi abbastanza rapidamente dopo la morte dell'ospite. La tassonomia dei cestodi dipende molto dal numero, dalle dimensioni e dalla forma degli uncini rostellari, che spesso si perdono nel materiale congelato. Lo stesso vale per alcuni trematodi con spine intorno alla ventosa orale, come gli echinostomi e gli eterofiidi, anch'essi frequentemente ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fissante
Alcool-Formalina-Acido acetico (AFA)	Fisher Scientific	A407-1 (etanolo) F75F-1GAL (formaldeide) BP2401500 (acido acetico glaciale)	Etanolo 85% (85 ml) + formaldeide 37% (10 ml) + acido acetico glaciale (5 ml)
Etanolo per l'uccisione e la conservazione a lungo termine	Fisher Scientific	A407-1	Etanolo 100% (70 ml) + acqua distillata (30 ml)
Etanolo per il fissaggio e lo studio del DNA	Fisher Scientific	AC61511-0010	Etanolo 80-90% (80-90 ml) + acqua distillata (20-10 ml), rispettivamente
Formalina tamponata	Fisher Scientific	SF100-4	Formalina 10% (10 ml) + acqua distillata (90 ml)
Glicerina-alcol	Fisher Scientific	A407-1 (etanolo) AC15365-1000 (glicerina)	Etanolo 70% (95 ml) + glicerina (5 ml)
Chiarifica, colorazione e montaggio
Etanolo per la disidratazione durante la colorazione	Fisher Scientific	A407-1	Etanolo 80%, 95%, 100% (80 ml, 95 ml, 100 ml) + acqua distillata (20 ml, 5 ml, 0 ml)
Lattofenolo	Fisher Scientific	R400-27-Fenolo
	Fisher Scientific	A931I-1 (fenolo) A407-1 (etanolo)	Fenolo 100% (80 ml) + etanolo 100% (20 ml)
Harris' Ematossilina	Fisher Scientific	S25347 (ematossilina) A407-1 (etanolo) A567-500 (solfato di alluminio ammonio) S25553 (iodato di sodio)	Ematossilina (5 g) + etanolo 100% (50 ml) + solfato di alluminio ammonio (100 g) + iodato di sodio (0,37 g) + acqua distillata (1.000 ml)
Semichon' s carminio acetico	Fisher Scientific	BP2401500 (acido acetico glaciale) S25236 (carminio) A407-1 (etanolo)	Acido acetico glaciale (100 ml) + carminio (1,5 g) + acqua distillata (100 ml). Scaldare a bagnomaria bollente per 15 minuti e raffreddare. Filtrare per fare la soluzione madre. Mescolare 1:2 con alcol al 70% per la colorazione.
Xylene	Fisher Scientific	X4-4	Utilizzare solo sotto una cappa chimica.
Salicilato di metile	Fisher Scientific	S25437-Etanolo
basico	Fisher Scientific	A407-1 (etanolo) S25159A (idrossido di ammonio concentrato)	Etanolo 70% (100 ml) + idrossido di ammonio (0,1 ml)
Etanolo acido	Fisher Scientific	A407-1 (etanolo) SA9233-100 (acido cloridrico)	Etanolo 70% (99,5 ml) +  acido cloridrico (0,5 ml)
Balsamo del Canada	Fisher Scientific	B10-100	-