Articolo metodologico

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

DOI:

10.3791/51005

⸱

30 gennaio 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Abstract

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Isolamento di microglia dal tessuto del sistema nervoso centrale è un potente strumento di indagine utilizzato per studiare biologia microglia ex vivo. Il presente metodo dettaglia un procedimento per l'isolamento di microglia da cortecce neonatali murini mediante agitazione meccanica con un agitatore rotante. Questo isolamento microglia metodo rendimenti microglia corticali purissime che presentano caratteristiche morfologiche e funzionali indicative di microglia quiescenti in condizioni non patologiche normali in vivo. Questa procedura preserva anche la immunofenotipo microglia e funzionalità biochimica come dimostra l'induzione di modificazioni morfologiche, traslocazione nucleare della subunità p65 di NF-kB (p65), e la secrezione della citochina proinfiammatoria segno distintivo, fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α ), su lipopolisaccaride (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam) sfide. Pertanto, l'attuale procedura di isolamento conserva l'immunofenotipo sia quiescente e attivamicroglia vato, fornendo un metodo sperimentale di investigare microglia biologia ex vivo condizioni.

Introduzione

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Cellule microgliali, i macrofagi sorveglianza del parenchima SNC, comprendono circa il 12% della popolazione totale di cellule del cervello dei mammiferi adulti. Microglia sono derivati ​​dal sacco vitellino mieloidi precursori delle cellule e variano in densità cellulare e morfologia in diverse regioni cytoarchitectural all'interno del SNC adulto 1-5. In un cervello adulto sano, microglia sono piccoli, ramificati o polari cellule con raffinati processi dinamici. In contrasto con macrofagi morfologia periferico, microglia dimostrano una quiescente, basso profilo fenotipo in cervelli sani che possono apparire come l'inattività cellulare, tuttavia, vivo studi di imaging in dimostrano che i processi microgliali si estendono in modo dinamico e ritraggono per monitorare il loro microambiente in un modo che ricorda " campionamento e rilevamento "6,7.

Microglia sono altamente e differenzialmente sensibili alle alterazioni ambientali e patofisiologici nel cervello, commutazioneda una surveillant a un effettrici stati, rispettivamente statali comunemente considerato come il loro riposo e attivato. Questo interruttore di attivazione può essere mediata da un blocco del recettori di membrana pattern recognition (PRR), come i recettori toll-like (TLR), che rispondono a modelli molecolari associati ai patogeni (PAMP), lipoproteine ​​vale a dire-batteriche e virali derivati , acidi nucleici, carboidrati e 8-11. Oltre a PAMPs, PRRs hanno dimostrato di indurre l'attivazione della microglia contro sterili, molecole patogene conosciute come modelli molecolari pericolo / danno associato (smorza), che rappresentano una perturbazione nel sistema nervoso centrale dell'omeostasi, come danno cellulare 12-16. Una volta inserita, PRRs avviare una cascata di segnalazione intracellulare che si traduce in cambiamenti nella morfologia cellulare e l'espressione genica microglia, in particolare, microglia attivata adattare un fenotipo ameboide-like, traslocare la p65 NF-kB subunità (p65) al nucleo della cellula, e il potenziamento della produttoriction e la secrezione di citochine proinfiammatorie, come fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), interleuchina-1 β (IL-1β), insieme con le specie reattive dell'ossigeno (ROS) 16-24. Sebbene integrale nella risposta immunitaria innata del sistema nervoso centrale, queste molecole secrete sono stati trovati anche ad aumentare lo stress ossidativo neuronale, inducendo in tal modo aggravando e neurodegenerazione in stati malati come il Parkinson e il morbo di Alzheimer 25-29.

Tuttavia, i meccanismi di attivazione della microglia in stati patologici non sono del tutto chiare. Pertanto, l'isolamento di microglia è un potente strumento di indagine in tali processi biologici, come molti nelle caratteristiche vivo di attivazione della microglia può essere ricapitolato in cultura. Sono disponibili diversi metodi per isolare microglia, compreso l'isolamento con gradiente Percoll seguente digestione enzimatica del tessuto CNS 30,31. Tuttavia, la digestione enzimatica può alterarel'immunofenotipo delle cellule riducendo superficie cellulare espressione dell'antigene 32, e si traduce in quantità di cellule per animale inferiore rispetto al metodo qui descritto. In particolare, si segnala un rendimento medio microglia per pup corteccia di 7,5 x 10 5 cellule, mentre precedentemente riportato metodi di isolamento da tutto CNS con gradiente resa Percoll 3-5 x 10 5 cellule 30,33,34. Il presente procedimento elude l'uso di enzimi digestivi isolando microglia in base alle loro proprietà a bassa aderenza, preservando così l'immunofenotipo microglia e funzionalità.

Nel presente studio, si descrive l'isolamento di cellule microgliali da colture gliali miste derivate da neonati eterozigoti CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), e C57BL / 6 cortecce murini tramite agitazione meccanica su un agitatore rotante, una proroga di precedenza metodo pubblicato 24,35. Utilizziamo il primo ceppo di topi per una facile visualizzazione di microglia, comequesti topi esprimono GFP sotto il controllo del locus endogeno CX3CR1 - un promotore specifico monociti 36-38. Questo metodo produce colture microgliali altamente puri con una preservata immunofenotipo ex vivo, come dimostrato dai cambiamenti morfologici, traslocazione nucleare di p65, e la secrezione di TNF-α quando provocati con lipopolisaccaride batterico (LPS) o Pam 3 CSK 4, TLR4 e TLR1 / 2 agonisti rispettivamente.

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Protocollo

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Prima di iniziare questo protocollo, raccogliere topi neonati a giorni postnatali 1-3 (P1-3), in un contenitore sterile nidificato con biancheria gabbia originale per la protezione e calore. E 'importante lavorare in modo rapido ed efficiente attraverso questo protocollo per ottimizzare il rendimento della microglia. Si prega di consultare la tabella 1 per la lista completa di reagenti.

1. Preparazione di strumenti, terreni di coltura, e piatti

  1. Preparare 10 ml / pup Microglia Complete media (MCM; 1x minimo essenziale del Piano Earle [MEM] supplementato con 1 mM L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 0,6% v / v D-(+)-glucosio, 100 pg / ml Penicillina / streptomicina (P / S), 4% v / v siero fetale bovino (FBS), 6% v / v Horse Serum), e aggiungere ad ogni pallone T-75 (1 boccetta / pup); cappuccio e posto orizzontalmente in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per equilibrare per 1 ora. È essenziale equilibrare questo mezzo beuta (s) prima di iniziare la dissezione.
  2. Prepare, aliquota, e caldo in 37 ° C bagnomaria MCM per dissezione (6 ml / pup) e in un tubo conico MCM separato per risospensione delle cellule (2 ml / pup). Preparare, aliquote e freddo sul ghiaccio Tritacarne media (MM; HBSS completata con: 100 pg / ml P / S, 0.01 M HEPES, 3 ml / pup), e di dissezione media (DM; MEM supplementato con 100 pg / ml P / S, 2 ml / pup).
  3. Sterilizzare i seguenti strumenti chirurgici mediante immersione in etanolo al 70% per 10 min: forbice # 1 (1, a decapitare), forcep # 1 (2, per assicurare il naso e rimuovere cortecce), forbice # 2 (1; nonangled, per aprire cuoio capelluto ), forcep # 2 (1; rimuovere cuoio capelluto), forcep # 3 (1; rimuovere cranio), forcep # 4 (2; rimuovere meningi), forbice # 3 (1; tritare tessuto cerebrale). Lasciare asciugare all'aria su un tampone sterile.
  4. Pulire la postazione di lavoro e la dissezione microscopio orizzontale del flusso d'aria con il 70% di etanolo.
  5. Dispensare DM in 2 sterili, 100 millimetri piastre di Petri per l'acquisizione di testa (3 ml, 1 piatto / 3 cuccioli) e la dissezione (1 ml;1 piatto / pup; raffreddata in ghiaccio prima di dissezione). Dispensare MM in 1 sterile, 100 millimetri piatto di Petri per tritare il tessuto cerebrale (1 ml, 1 piatto / pup).

2. Cervello Tissue Dissection

  1. Prima di eutanasia, igienizzare delicatamente il collo e la testa del cucciolo con il 70% di etanolo utilizzando un tessuto di laboratorio. Con scissor # 1, eutanasia rapidamente pup togliendo la testa, testa di cattura in capsula di Petri precedentemente preparato. Euthanize e completare la dissezione di un cucciolo prima di procedere alla successiva animale.
  2. Trasferire la testa al piatto dissezione refrigerate; sotto il microscopio di dissezione fissare la testa pizzicando il naso con pinza # 1 (in alternativa, la testa può essere fissata da piercing pinza attraverso la cavità oculare); cuoio capelluto aperto con scissor # 2, creando un Y-cut: iniziare dalla base della testa ed inclinato verso gli occhi. Utilizzare forcep 3 # per rimuovere delicatamente il cuoio capelluto con il peeling laterale, esponendo il cranio.
  3. Utilizzando forcep # 3, rimuovere delicatamente il tessuto connettivo alla base deltesta. Quando la base del cranio è esposto, accuratamente aperto il cranio infilando un braccio della pinza tra il cervello e il cranio (seguendo la fessura interemisferica); presa; tirare delicatamente il cranio verso l'alto per strappare aperto.
  4. Disrupt tessuto connettivo sotto il lato ventrale del cervello utilizzando forcep # 1, e successivamente rimuovere il cervello utilizzando lo stesso strumento. Sollevare il cervello su cranio utilizzando una forza verso l'alto sotto la faccia ventrale del cervello.
  5. Mantenere il cervello nella sua posizione anatomica: lato dorsale verso l'alto per visualizzare le cortecce al microscopio dissezione; fissare il cervello in posizione inserendo punte della pinza nel punto di intersezione del mesencefalo e corteccia; rimuovere completamente meningi corticali con forcep # 4, quindi procedere a rimuovere le meningi ventrali. Una volta che le meningi siano stati completamente asportati, separare le cortecce dal resto del cervello utilizzando pinza # 4. È essenziale rimuovere completamente il tessuto meningeo per massimizzare microglia purezza e yield.

3. Cervello Tissue Mincing

  1. Cortecce di trasferimento di preparati in precedenza macinazione piatto, continuare a tritare passo con tecnica sterile in Classe II Sicurezza biologica Gabinetto.
  2. Tritare il tessuto cerebrale utilizzando forbice # 3; trasferimento di tessuto tritato in una provetta da 15 ml;. Lavare le forbici e tritare piatto con 1 ml di MM ciascuna, raccogliere e dispensare risciacqui nel tubo conico da 15 ml contenente il tessuto tritato Questa fase di risciacquo massimizzerà la resa di microglia garantendo che tutto il tessuto residuo viene trasferito tubo conico. Lascia sospensione tessuto indisturbato per 1-2 minuti, permettendo il tessuto macinata di stabilirsi sul fondo della provetta. Non superare 2 min come MM non contiene nutrienti essenziali.
  3. Rimuovere con cautela e scartare 2 ml di surnatante con generico 1000 microlitri micropipettatore con un puntale di serie, facendo attenzione a non disturbare il tessuto tritato risolta.
  4. Aggiungere 3 ml di MCM al tessuto tritato; triturare il tessuto con forza con un generico 1000 microlitri micropipettatore con un puntale di serie n distinguibile tessuto solido dovrebbe rimanere quando triturazione è completa.. Aggiungere altri 3 ml di MCM con la stessa punta della pipetta, la raccolta del campione triturato residuo dalla punta della pipetta.

4. Crescita delle cellule corticali

  1. Centrifugare il tessuto tritato a pellet cellule (215 xg, 5 min; RT, centrifuga clinica con rotore oscillante). Ritorno cellule pellet al gabinetto di sicurezza biologica, rimuovere e scartare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet cellulare (2 ml / provetta, MCM), aggiungere la risospensione delle cellule al precedentemente preparato T-75 pallone, tappare il pallone e metterlo in orizzontale in umidificata standard coltura tissutale incubatore (37 ° C, 5% CO 2). Permettono alle cellule di incubare per 24 ore.
  2. Dopo 24 ore, delicatamente toccare pallone contro il palmo della mano per distruggereframmenti di tessuto. Controllare le cellule prima e dopo aver toccato per garantire la completa rimozione dei detriti. Set pallone verticale; rimuovere ed eliminare media; aggiungere MCM fresco al fondo del pallone (12 ml; 37 ° C); cappuccio e inserire di nuovo nel incubatore, orizzontalmente.
  3. Controllare le cellule al giorno per la contaminazione e per monitorare la crescita.
  4. A circa 17-21 giorni in vitro (DIV), le cellule microgliali saranno pronti per il raccolto dalla cultura gliali mista. Per determinare se le cellule sono pronte, esaminare le cellule sotto un microscopio a contrasto di fase invertito. Microglia sono pronti per il raccolto, quando al ~ 40% di confluenza. Essi appaiono come piccoli, luminosi, celle sferiche, crescendo come un monostrato in cima glia altri.

5. Isolamento di Microglia da Mixed Cultura Glial

  1. Per isolare microglia, vigorosamente toccare pallone contro il banco di laboratorio. Questa agitazione aiuta microglia, distinta da altre cellule gliali a causa delle proprietà di bassa aderenza della microglia.
  2. Seal T-75 caps pallone con Parafilm e ruotare le colture gliali miste (200 giri, 37 ° C, 5 ore). utilizzando un nonhumidified agitatore rotante a temperatura controllata Non permettere alle cellule di scuotere per più di 5 ore Effettuare il controllo visivo. che la microglia hanno sollevato dalla superficie pallone dopo 5 ore, utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito. Microglia sono luminose, sferico, free-floating cellule. Ci sarà uno strato residuo di astrociti e oligodendrociti aderenti al fondo del pallone.
  3. Raccogliere i media surnatante contenente microglia in una provetta da centrifuga conica sterile; microglia a pellet (215 xg, 5 min, oscillanti rotore secchio).
  4. Risospendere il pellet microglia nel warm microglia crescita medio (MGM; MEM supplementato con: 1 piruvato di sodio mM, 0,6% v / vglucose, 1 mM L-glutammina, 100 pg / ml P / S, 5% v / v di FBS; ~ 2 ml / beuta), determinare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro e piastra 1 x 10 5 cellule / pozzetto in un formato di piastra da 24 pozzetti sullaplastica o sterili scivola copertura in vetro (500 microlitri / e; MGM). Utilizzando questa procedura il rendimento medio microglia è di 7,5 x 10 5 cellule / pup corteccia.
  5. 24 ore di post-placcatura, rimuovere tutti i mezzi di comunicazione e delle cellule refeed con MGM fresco (37 ° C) per rimuovere le cellule galleggianti e detriti. Questo passaggio è fondamentale alla sopravvivenza delle cellule e mantenere microglia quiescenti. Le cellule possono essere utilizzati per la sperimentazione subito dopo rialimentazione.

6. Trattamenti Esempio

  1. Esporre le cellule a 10 ng / ml di Pam 3 CSK 4 (Pam), 10 ng / ml di lipopolisaccaride (LPS) o di controllo del veicolo; incubare per 2 o 24 ore in incubatore umidificato (37 ° C, 5% CO 2).

7. Analizzando Microglia per la funzionalità ex vivo tramite immunofluorescenza Imaging e Immunocytochemistry

  1. Dopo il trattamento, mezzi di coltura cellulare raccolto in provette per microcentrifuga (1,5 ml) e centrifuge utilizzando una microcentrifuga da tavolo (2 min; 900 xg) per cancellare i media. Trasferire il supernatante in una provetta per microcentrifuga pulita; dosaggio immediatamente, o conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Analizzare concentrazione di TNF-α in coltura cellulare surnatante tramite disponibile in commercio del mouse-TNF α kit ELISA.
  2. Lavare le cellule con tampone fosfato (PBS), e fissare le cellule con il 4% (w / v) di paraformaldeide / 4% (w / v) di saccarosio / PBS pH 7,4 (4% PFA, 15 min; RT). Dopo la fissazione, lavare le cellule con PBS per 5 minuti agitando delicatamente su un agitatore orbitale.
    1. Immunofluorescenza / Immunocytochemistry. Dopo la fissazione e PBS lavare, processo microglia per immunocitochimica. Tutte le fasi effettuate con un leggero scuotimento. Permeabilize cellule in PBS/0.1% triton X-100; cellule blocchi in siero normale di capra PBS/10% per un'ora. Incubare le cellule O / N a 4 ° C con coniglio anti-NF-kB anticorpo (p65 subunità, 1/1, 250) o coniglio anti-Iba-1 anticorpo (1/750) nel tampone di bloccaggio. Visivoize antigene: anticorpo seguente incubazione con fluorescenza di capra coniugato anti-IgG di coniglio anticorpo secondario (1 ora, 1/1, 000). Rimuovere l'anticorpo secondario non legato mediante lavaggio con PBS/0.1% triton X-100 (3x 5 min).
    2. Cellule macchia contatore con 4 ',6-Diamidino-2-phenylindole / PBS (DAPI; 0,1 mg / ml). Per visualizzare nucleo della cellula Tutti microglia derivati ​​da CX3CR1-GFP + / - topi esprimono GFP. Utilizzare un filtro di lunghezza d'onda di 350 nm per visualizzare DAPI, un filtro di lunghezza d'onda di 488 nm per visualizzare GFP, ed un filtro di lunghezza d'onda 594 nm di visualizzare p65 e Iba-1 immunocomplessi.
  3. Montare il coperchio scivola usando la soluzione di montaggio acquosa e visualizzare microglia usando la microscopia a fluorescenza.

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Risultati

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Conservando la immunofenotipo e la funzionalità della microglia ex vivo durante l'isolamento è fondamentale per essere in grado di utilizzare queste cellule come un modello di indagine per la biologia della microglia. Al fine di dimostrare la conservazione di successo della microglia immunofunctionality con il metodo attuale, abbiamo isolato microglia corticali da neonati P3 (CX3CR1-GFP + / - e C57BL / 6) e le colture trattate sia con LPS o Pam.

Come illustrato nella

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Discussione

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Il presente procedimento offre un metodo efficace per l'isolamento di microglia corticali di topi neonati. Questa procedura ha un duplice vantaggio di 1) conservare immunofenotipo microglia e funzionalità, come determinato mediante imaging fluorescente, immunocitochimica e ELISA, e, 2) permettendo microglia di maturare in presenza di altre cellule gliali (astrociti e oligodentrocytes) prima isolamento, che può facilitare importanti interazioni cellula-cellula durante il periodo di coltura maturazione gliale. È impor...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal NIEHS R01ES014470 (KMZ).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
GlucosioSigmaG8270Preparare una soluzione madre al 20% con acqua MilliQ; filtrare sterilizzare; conservare a 4 gradi C; Periodo di validità: 3-6 mesi. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Piruvato di sodio 100 mM (100x)HycloneSH30239.01Conservare a 4°C. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Penicillina/Streptomicina 10.000 unità/ml (100x)Gibco15140-122Conservare a -20 °C. Utilizzato per produrre MCM, MGM, MM e DM.
L-Glutammina 200 mM (100x)Gibco25030-081Conservare a -20 °C. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Siero fetale bovino (definito)HycloneSH30070.03Filtro sterilizzare; conservare a -20 °C. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Terreno essenziale minimo Cellgro di Earle (MEM)15-010-CVsenza L-glutammina. Contiene sali di Earle. Utilizzato per produrre MCM, MGM e DM.
Siero di cavalloGibco16050Filtro sterilizzare; conservare a -20 °C. Utilizzato per fare MCM e MGM.
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)Cellgro21-021-CVSenza calcio e magnesio. Conservare a 4 °C. Utilizzato per fare MM.
HEPES 1 MGibco15630-031Negozio a 4 °C. Utilizzato per fare MM.
T-75Flask Corning430641
4',6-Diamidino-2-fenilidolo, dilattato (DAPI)InvitrogenD3571Utilizzato per colorare il nucleo cellulare.
Coniglio anti-Iba1Wako019-19741Utilizzato a diluizione 1/750 per la colorazione ICC di Iba1.
Coniglio anti-NFκ B (p65)Abcam7970Utilizzato a diluizione 1/1.250 per la colorazione ICC per p65.
Alexa Fluor 594 Capra anti-coniglio IgG (H+L)InvitrogenA11012Utilizzato a diluizione 1/1.000 per la visualizzazione del complesso antigene:anticorpo in ICC.
Pipetta sierologica monouso da 10 mlFisher Scientific13-678-11E
Provetta da centrifuga monouso da 50 mlFisher Scientific05-539-8
Provetta da centrifuga monouso da 15 mlFisher Scientific05-539-12
Piastra di Petri sterile in polistireneFisher Scientific875713100 mm x 15 mm
Forbice: Metzembaum dritta (forbice #1)Roboz SurgicalRS-60101; 5 pollici; utilizzato per rimuovere la testa
Forbice: Vannas
(forbice #2)		Fine Science Tools15000-081; non angolato; tagliente da 2,5 mm; utilizzato per aprire il cuoio capelluto
Forbice: Student Vannas (forbice #3)FineScience Tools91501-091; curvo; utilizzato per tritare il tessuto cerebrale
Forcipe: Dumont #7
(pinza #1)		Fine Science Tools91197-002; utilizzato per fissare il naso e rimuovere le cortecce
Forcipe: Dumont #2
(pinza #2)		Fine Science Tools11223-201; utilizzato per rimuovere il cuoio capelluto
Forcipe: Dumont #3
(pinza #3)		Fine Science Tools11231-301; utilizzato per rimuovere il cranio
Forcipe: Dumont #5a
(pinza #4)		Fine Science Tools11253-211; utilizzato per rimuovere le meningi
Table of Specific Equipment
Microscopio per dissezione stereo zoom OlympusSZ4060è collocato all'interno di una cabina a flusso laminare-orizzontale
Cabina a flusso laminare-orizzontaleNuaireNU-201-330
Cabina di sicurezza biologicaLabconco3440001Classe II
rivestimento d'acqua CO2VWR97025-836Impostato su 37 ° C, 5% CO2
Secchi estraibiliFisher Scientific75006441 Da utilizzare con il rotore oscillante
Rotore oscillanteFisher Scientific75006445Raggio massimo: 19,2 (cm)
Centrifuga Sorvall Legend RT+
(centrifuga clinica)		Fisher Scientific75-004-377Con rotore oscillante
AccuSpin Micro 17 microcentrifuga
( microcentrifuga da tavolo)		Fisher ScientificS98645Con rotore da microlitro (24 x 1,5/2,0 ml; Gatto #: 75003524)   
Il microscopio con

Riferimenti

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