Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Stefano G. Daniele; Amanda A. Edwards; Kathleen A. Maguire-Zeiss

doi:10.3791/51005

Articolo metodologico

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

DOI:

10.3791/51005

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30 gennaio 2014

Stefano G. Daniele¹ , Amanda A. Edwards¹ , Kathleen A. Maguire-Zeiss¹

¹Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam ₃ CSK ₄ (Pam).

Abstract

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Isolamento di microglia dal tessuto del sistema nervoso centrale è un potente strumento di indagine utilizzato per studiare biologia microglia ex vivo. Il presente metodo dettaglia un procedimento per l'isolamento di microglia da cortecce neonatali murini mediante agitazione meccanica con un agitatore rotante. Questo isolamento microglia metodo rendimenti microglia corticali purissime che presentano caratteristiche morfologiche e funzionali indicative di microglia quiescenti in condizioni non patologiche normali in vivo. Questa procedura preserva anche la immunofenotipo microglia e funzionalità biochimica come dimostra l'induzione di modificazioni morfologiche, traslocazione nucleare della subunità p65 di NF-kB (p65), e la secrezione della citochina proinfiammatoria segno distintivo, fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α ), su lipopolisaccaride (LPS) e Pam ₃ CSK ₄ (Pam) sfide. Pertanto, l'attuale procedura di isolamento conserva l'immunofenotipo sia quiescente e attivamicroglia vato, fornendo un metodo sperimentale di investigare microglia biologia ex vivo condizioni.

Introduzione

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Cellule microgliali, i macrofagi sorveglianza del parenchima SNC, comprendono circa il 12% della popolazione totale di cellule del cervello dei mammiferi adulti. Microglia sono derivati dal sacco vitellino mieloidi precursori delle cellule e variano in densità cellulare e morfologia in diverse regioni cytoarchitectural all'interno del SNC adulto ^1-5. In un cervello adulto sano, microglia sono piccoli, ramificati o polari cellule con raffinati processi dinamici. In contrasto con macrofagi morfologia periferico, microglia dimostrano una quiescente, basso profilo fenotipo in cervelli sani che possono apparire come l'inattività cellulare, tuttavia, <....

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Protocollo

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Prima di iniziare questo protocollo, raccogliere topi neonati a giorni postnatali 1-3 (P1-3), in un contenitore sterile nidificato con biancheria gabbia originale per la protezione e calore. E 'importante lavorare in modo rapido ed efficiente attraverso questo protocollo per ottimizzare il rendimento della microglia. Si prega di consultare la tabella 1 per la lista completa di reagenti.

1. Preparazione di strumenti, terreni di coltura, e piatti

Preparare 10 ml / pup Microglia Complete media (MCM; 1x minimo essenziale del Piano Earle [MEM] supplementato con 1 mM L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 0,6% ....

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Risultati

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Conservando la immunofenotipo e la funzionalità della microglia ex vivo durante l'isolamento è fondamentale per essere in grado di utilizzare queste cellule come un modello di indagine per la biologia della microglia. Al fine di dimostrare la conservazione di successo della microglia immunofunctionality con il metodo attuale, abbiamo isolato microglia corticali da neonati P3 (CX3CR1-GFP ^{+ / -} e C57BL / 6) e le colture trattate sia con LPS o Pam.

Come illustrato nella

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Discussione

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Il presente procedimento offre un metodo efficace per l'isolamento di microglia corticali di topi neonati. Questa procedura ha un duplice vantaggio di 1) conservare immunofenotipo microglia e funzionalità, come determinato mediante imaging fluorescente, immunocitochimica e ELISA, e, 2) permettendo microglia di maturare in presenza di altre cellule gliali (astrociti e oligodentrocytes) prima isolamento, che può facilitare importanti interazioni cellula-cellula durante il periodo di coltura maturazione gliale. È impor.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dal NIEHS R01ES014470 (KMZ).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glucosio	Sigma	G8270	Preparare una soluzione madre al 20% con acqua MilliQ; filtrare sterilizzare; conservare a 4 gradi C; Periodo di validità: 3-6 mesi. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Piruvato di sodio 100 mM (100x)	Hyclone	SH30239.01	Conservare a 4°C. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Penicillina/Streptomicina 10.000 unità/ml (100x)	Gibco	15140-122	Conservare a -20 °C. Utilizzato per produrre MCM, MGM, MM e DM.
L-Glutammina 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Conservare a -20 °C. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Siero fetale bovino (definito)	Hyclone	SH30070.03	Filtro sterilizzare; conservare a -20 °C. Utilizzato per produrre MCM e MGM.
Terreno essenziale minimo Cellgro di Earle (MEM)		15-010-CV	senza L-glutammina. Contiene sali di Earle. Utilizzato per produrre MCM, MGM e DM.
Siero di cavallo	Gibco	16050	Filtro sterilizzare; conservare a -20 °C. Utilizzato per fare MCM e MGM.
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)	Cellgro	21-021-CV	Senza calcio e magnesio. Conservare a 4 °C. Utilizzato per fare MM.
HEPES 1 M	Gibco	15630-031	Negozio a 4 °C. Utilizzato per fare MM.
T-75	Flask Corning	430641
4',6-Diamidino-2-fenilidolo, dilattato (DAPI)	Invitrogen	D3571	Utilizzato per colorare il nucleo cellulare.
Coniglio anti-Iba1	Wako	019-19741	Utilizzato a diluizione 1/750 per la colorazione ICC di Iba1.
Coniglio anti-NFκ B (p65)	Abcam	7970	Utilizzato a diluizione 1/1.250 per la colorazione ICC per p65.
Alexa Fluor 594 Capra anti-coniglio IgG (H+L)	Invitrogen	A11012	Utilizzato a diluizione 1/1.000 per la visualizzazione del complesso antigene:anticorpo in ICC.
Pipetta sierologica monouso da 10 ml	Fisher Scientific	13-678-11E
Provetta da centrifuga monouso da 50 ml	Fisher Scientific	05-539-8
Provetta da centrifuga monouso da 15 ml	Fisher Scientific	05-539-12
Piastra di Petri sterile in polistirene	Fisher Scientific	875713	100 mm x 15 mm
Forbice: Metzembaum dritta (forbice #1)	Roboz Surgical	RS-6010	1; 5 pollici; utilizzato per rimuovere la testa
Forbice: Vannas (forbice #2)	Fine Science Tools	15000-08	1; non angolato; tagliente da 2,5 mm; utilizzato per aprire il cuoio capelluto
Forbice: Student Vannas (forbice #3)Fine	Science Tools	91501-09	1; curvo; utilizzato per tritare il tessuto cerebrale
Forcipe: Dumont #7 (pinza #1)	Fine Science Tools	91197-00	2; utilizzato per fissare il naso e rimuovere le cortecce
Forcipe: Dumont #2 (pinza #2)	Fine Science Tools	11223-20	1; utilizzato per rimuovere il cuoio capelluto
Forcipe: Dumont #3 (pinza #3)	Fine Science Tools	11231-30	1; utilizzato per rimuovere il cranio
Forcipe: Dumont #5a (pinza #4)	Fine Science Tools	11253-21	1; utilizzato per rimuovere le meningi
Table of Specific Equipment
Microscopio per dissezione stereo zoom	Olympus	SZ4060	è collocato all'interno di una cabina a flusso laminare-orizzontale
Cabina a flusso laminare-orizzontale	Nuaire	NU-201-330
Cabina di sicurezza biologica	Labconco	3440001	Classe II
rivestimento d'acqua CO₂	VWR	97025-836	Impostato su 37 ° C, 5% CO₂
Secchi estraibili	Fisher Scientific		75006441 Da utilizzare con il rotore oscillante
Rotore oscillante	Fisher Scientific	75006445	Raggio massimo: 19,2 (cm)
Centrifuga Sorvall Legend RT+ (centrifuga clinica)	Fisher Scientific	75-004-377	Con rotore oscillante
AccuSpin Micro 17 microcentrifuga ( microcentrifuga da tavolo)	Fisher Scientific	S98645	Con rotore da microlitro (24 x 1,5/2,0 ml; Gatto #: 75003524)

Il microscopio con

Riferimenti

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Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adul....

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Ristampe e permessi

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Cortical Microglia Isolation Microglia Immunophenotype Murine Neonates Mechanical Agitation Mixed Glial Cultures Immunofluorescence Microscopy ELISA Meningeal Tissue Removal Rotary Shaker Cell Culture Plates

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

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