Articolo metodologico

Metodi Latte di raccolta per topi e Reeves 'Muntjac

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DOI:

10.3791/51007

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19 luglio 2014

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1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

In questo articolo

Sommario

La raccolta del latte da modelli animali facilita varie strade di ricerca: la comprensione dell'immunità passiva, l'identificazione di agenti patogeni responsabili della trasmissione verticale e, attraverso l'uso di topi transgenici, anche la produzione commerciale di proteine presenti nel latte materno umano. Qui illustriamo un metodo semplice per la raccolta del latte nei topi e nel cervo muntjac di Reeves.

Abstract

I modelli animali sono comunemente utilizzati in tutti i laboratori di ricerca per realizzare ciò che normalmente sarebbe considerato poco pratico nell'ospite nativo di un agente patogeno. La raccolta del latte dagli animali offre agli scienziati l'opportunità di studiare molti aspetti della riproduzione, tra cui la trasmissione verticale, l'immunità passiva, la biologia della ghiandola mammaria e l'allattamento. Ottenere volumi adeguati di latte per questi studi è un compito impegnativo, soprattutto da modelli di piccoli animali. Qui illustriamo un metodo economico e facile per la raccolta del latte nei topi e nel cervo muntjac di Reeves che non richiede attrezzature specializzate o una formazione approfondita. Questo particolare metodo richiede due ricercatori: uno per estrarre il latte e stabilizzare l'animale, e uno per raccogliere il latte in un contenitore appropriato da un modello di Muntjac o di topo. Il modello murino richiede anche l'uso di un pipettatore P-200 e dei corrispondenti puntali per pipette. Sebbene questo metodo sia a basso costo e relativamente facile da eseguire, i ricercatori dovrebbero essere informati che l'anestetizzazione dell'animale è necessaria per una raccolta ottimale del latte.

Introduzione

Modelli animali forniscono informazioni patologia malattia che non può essere acquisita mediante analisi in vitro. Per fornire i risultati più efficaci, è importante utilizzare un modello animale che è strettamente correlata alla malattia e specie di interesse. Ad esempio, la Reeves 'muntjac (Muntiacus reevesi), un piccolo cervo asiatico 1,2, e topi transgenici che esprimono la proteina prionica cervide (CerTgPrP) 3 sono modelli animali utili per le specie di cervidi. Entrambe le specie sono polyestrous, che permette tutto l'anno di allevamento, e quindi una fonte costante per i tessuti e fluidi legate alla gravidanza per studiare meccanismi specifici di cervidi biologia. Studi di latte hanno una vasta gamma di applicazioni che sono più semplice (ed economico) compiute in modelli animali che nell'uomo. I ricercatori hanno potuto studiare il latte e il colostro come una potenziale fonte di 1) trasmissione di malattie infettive, 2) immunoglobuline trasferiti dalla madre alla prole in svipment dell'immunità passiva 4 e 3) lattoferrina, una proteina presente nel latte materno umano coinvolto nella immunità passiva che i ricercatori stanno tentando di produrre commercialmente 5.

La raccolta di una notevole quantità di latte proveniente da animali di piccola taglia può rivelarsi un compito difficile. Rogers ha proposto un metodo per raccogliere il latte da ratti 6, che è stato successivamente utilizzato in topi. DePeters e Hovey proposti due metodi per la raccolta del latte, uno con un aspirapolvere manualmente generata prodotta da una lampadina pipetta gomma collegata ad una pipetta Pasteur, e una seconda che richiede la costruzione di un gruppo di mungitura, che viene poi collegato ad una sorgente di vuoto (ad esempio come un rubinetto) per raccogliere il latte topo 7. Qui vi proponiamo un metodo semplice ed economico per la raccolta del latte da entrambi i topi e Reeves 'muntjac cervo, che richiede solo prontamente disponibili attrezzature di laboratorio e le competenze tecniche di base. Il nostro metodo produce quantità sufficienti di latte per varieapplicazioni.

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Protocollo

1. Mouse mungitura protocollo

I metodi descritti in questo protocollo sono state approvate dal IACUC.

1. Separazione della diga di Offspring

  1. Selezionare la diga da mungere. Scegliere una diga con una cucciolata di 4 o più cuccioli che è 8-12 giorni dopo il parto per fornire il latte la massima raccolta, anche se la raccolta è possibile in qualsiasi momento punto di post parto fino a 21 giorni.
  2. Separare la diga dalla sua cucciolata di almeno 2 ore prima della mungitura.
    Nota: Se una voglia di mungere più di una diga in un dato periodo di tempo, è accettabile per ospitare le dighe separate nella stessa gabbia con cibo adeguato e acqua.

2. Somministrazione di ossitocina, Anestesia e lubrificante Eye

  1. Somministrare 2 UI / kg di ossitocina per via intraperitoneale (IP). L'ossitocina è un ormone che agisce sulle ghiandole mammarie delle femmine in allattamento per stimolare il rilascio di latte. L'ossitocina può essere acquisito from un veterinario.
  2. Somministrare miscela anestetica contenente 80-100 mg / kg ketamina in combinazione con 5-10 mg / kg IP xilazina. Ad esempio, una miscela di 10 ml di brodo anestetico potrebbe essere preparata in anticipo per topi del peso di circa 30 g ed includerebbe 0,1 ml xilazina, 8,9 ml di H 2 O e 1,0 ml di ketamina. 0,25 ml di anestetico totale sarà sedare un topo di queste dimensioni per circa 20-30 min, che dovrebbe fornire un tempo adeguato per la raccolta del latte.
    Note: Per determinare che l'animale è stato anestetizzato con successo, dolcemente immettere sul suo stomaco su una superficie solida; non dovrebbe essere in movimento i piedi o il tentativo di salire a piedi se lei è completamente anestetizzato. Nel caso di un topo non essere completamente anestetizzati con il dosaggio originale, il ricercatore può somministrare un altro ¼ o ½ della dose iniziale della miscela anestetica seconda delle dimensioni del mouse e / o il livello di sedazione che il mouse ha già raggiunto . Tuttavia, questo potreincrease la possibilità di una reazione avversa all'anestesia, e può anche comportare il mouse che viene più profondamente anestetizzati e / o anestetizzato per un periodo di tempo più lungo.
    Nota: Se mungitura più di una diga, è necessario sfalsare ossitocina e iniezioni anestetiche causa della breve emivita di ossitocina e tempi di sedazione per chetamina e xilazina.
  3. Applicare una piccola quantità di lubrificante dell'occhio verso l'angolo di ogni occhio e la diffusione di evitare gli occhi del topo si secchi mentre sotto anestesia.

3. Milk Collection

La raccolta del latte è più facilmente eseguita con due ricercatori: un ricercatore di tenere il mouse anestetizzato esprimendo manualmente il latte (denominato R1), e un ricercatore di raccogliere il latte (R2). Questo metodo può anche essere eseguita con una sola persona, se il mouse è fissato su una superficie piana per evitare un danno.

  1. R2 dovrebbe essere dotato di sterili rilievi di preparazione alcol, un pip P-200etman, un puntale pulito per ogni topo, e un contenitore per il latte, quale un tubo Eppendorf da 1,5 ml o un esageratamente 1,2 ml (vedi tabella dei materiali).
  2. Come l'ossitocina comincia a fare effetto, latte delusione diventerà visibile nella zona mammaria del topo (vedi Figura 1A). R1: Svolgere una sterile tampone imbevuto di alcool e pulire delicatamente la zona mammaria del topo per pulire la zona prima della mungitura. Esprimere manualmente latte dal capezzolo con il pollice e l'indice per massaggiare delicatamente e spremere il tessuto mammario in un movimento verso l'alto finché una goccia visibile di latte comincia a formarsi alla base del capezzolo.
  3. Premere il Pipetman stantuffo P-200 alla sua prima fermata per liberare l'aria dalla punta della pipetta e prepararsi per la raccolta del latte.
  4. Posizionare la punta della pipetta nella parte superiore della goccia di latte, e tirare delicatamente il latte nella punta della pipetta rilasciando lentamente la pressione sullo stantuffo. Fare attenzione a non mettere la punta troppo vicino al capezzolo o della pelle (vedereFigura 1B). Non è necessario rilasciare completamente il pistone come questa tirerà il latte fino alla parte superiore della punta della pipetta e renderà difficile per espellere il latte spesso viscoso nella tenuta del contenitore.
  5. Espellere il latte nel contenitore con il pollice per premere lo stantuffo passato il primo arresto (vedere Figura 1C). Per facilitare l'espulsione di piccoli volumi, premere la punta della pipetta contro il lato del tubo in modo che il liquido non viene perso.
  6. Continuare ad esprimere manualmente latte di ogni capezzolo, muovendosi in senso orario o antiorario in modo da non saltare alcuna tettarelle. E 'sia accettabile e utile per tornare e continuamente estrarre il latte dal medesimo capezzolo dovrebbe produrre più latte di un altro.

4. Reversal anestetico nella diga

  1. Nella maggior parte dei casi, è comune per la diga di cominciare a cominciare a svegliare durante la mungitura. Se questo non è il caso, posizionare la diga in una cage indirettamente sotto una fonte di calore, come una coperta riscaldata di circolazione, fino a quando lei comincia a svegliarsi.
    Nota: Poiché la diga comincia a svegliarsi, tenere stretta osservazione della sua attività fino a quando lei è in grado di camminare su di lei gabbia da sola.
  2. Una volta che la diga si muove sulla gabbia senza lotta, posizionare la schiena nella sua gabbia originale con la sua cucciolata. Senza effetti negativi sono stati notati per quanto riguarda la capacità dei cuccioli 'per alimentare dopo la raccolta del latte.

2. Muntjac mungitura protocollo

I metodi descritti in questo protocollo sono state approvate dal IACUC.

1. Separazione della Doe di Offspring

  1. Selezionare la cerva da mungere. Reeves 'muntjac cervo generalmente danno vita ad uno fulvo 2. Mungere la cerva il giorno dopo parto per consentire l'opportunità fulvo di accedere ai nutrienti essenziali nel colostro 8.
    Nota: Il fulvo di solito si nasconde e non si ripresenta durante il procedure; separazione della coppia madre-prole non è necessario.

2. Somministrazione di ossitocina, Anestesia e lubrificante Eye

  1. Somministrare 10 UI / kg di ossitocina per via intramuscolare (IM). L'ossitocina è un ormone che agisce sulle ghiandole mammarie delle femmine in allattamento per stimolare la let-down di latte. L'ossitocina può essere acquistato da un veterinario.
  2. Amministrare l'anestetico BAM IM 11 contenente Butorfanolo 0,45 mg / kg, azaperone 0,25 mg / kg, medetomadine 0,07 mg / kg. Una dose della miscela di anestetico BAM sarà sedare una muntjac per circa 20-30 min, che prevede ampio spazio per la raccolta del latte completo. Un'altra opzione per anestesia è midazolam 1-2 mg / kg, che sedare una muntjac per circa 10-15 min. Mentre questo fornisce un tempo adeguato per la raccolta del latte, questo anestetico viene metabolizzato più rapidamente di BAM e l'animale può tentare di sfuggire alla fine del periodo di tempo più breve.
    Nota: Minimal risposta al dolore, Riflessi minori upon toccare le orecchie, seguita dalla capacità di R1 per tenere il MJ senza lotta indica che l'animale è stato anestetizzato con successo.
    Nota: Nel caso di un muntjac non essendo completamente anestetizzati con il dosaggio originale, il ricercatore può somministrare un altro ¼ o ½ della dose iniziale della miscela anestetica seconda delle dimensioni dell'animale e / o il livello di sedazione che è già stato raggiunto. Tuttavia, questo potrebbe aumentare la probabilità di una reazione avversa all'anestesia, e può anche comportare la muntjac essere più profondamente anestetizzati e / o anestetizzato per un periodo di tempo più lungo.
  3. Applicare una piccola quantità di lubrificante fino all'angolo di ciascun occhio e la diffusione di evitare gli occhi del muntjac si secchi mentre sotto anestesia.

3. Milk Collection

La raccolta del latte è più facilmente eseguita con due ricercatori; un ricercatore di tenere il muntjac anestetizzato inil giro mentre esprimendo manualmente il latte (di seguito R1), e un secondo ricercatore per mantenere la testa del muntjac in una posizione comoda e sicura e per raccogliere il latte (R2).

  1. A seconda del anestetico usato, la mungitura deve essere effettuata sia 1) nei loro recinti per fornire un luogo sicuro per loro dovrebbero svegliarsi durante la procedura (2) o midazolam-indotta) in un antibagno-biancheria da letto libero per mantenere la pulizia (BAM- indotta).
  2. R1 e R2 devono essere dotati di una garza imbevuta di etanolo e diverse provette da 15 ml in polipropilene coniche per contenere il latte.
  3. Come l'ossitocina comincia a fare effetto, latte delusione diventerà visibile nella zona mammaria del muntjac. R1: Sterilizzare mani guantate e le dita, così come l'intera mammella e ogni singolo capezzolo dell'animale con la garza imbevuta di etanolo. R2: Tenere la testa del muntjac in una posizione sicura e confortevole per consentire facilità di respirazione e aiutare a prevenire rumine rigurgito. Tenere le cl tubo di raccolta ose al capezzolo essere munte senza toccarla per evitare potenziali contaminazioni.
  4. Esprimere il latte da un capezzolo con il pollice e l'indice per premere delicatamente il tessuto mammario in un movimento verso l'alto fino a quando il capezzolo è gonfio di latte, e rotolare delicatamente il latte dal capezzolo e nel tubo che R2 è in possesso (vedi Figura 2 ).
  5. Nota: Il latte viene fuori in un flusso, quindi è importante per R2 per avere il tubo di raccolta posizionato in modo che poco o nessun latte sarà sprecato.
  6. Mammella della muntjac è diviso in quadranti. R1: Continuare a estrarre il latte da ogni quadrante fino a che il latte non scorre più facilmente. Se il latte non può essere espresso da una tettarella, espresso da tutte le altre tettarelle prima di tornare al primo. E 'sia accettabile e utile per tornare e continuamente estrarre il latte dal medesimo capezzolo dovrebbe produrre più latte di un altro.

4. Reversal anestetico nel Doe

t "> E 'comune per midazolam indotta doe per cominciare a svegliarsi durante il processo di mungitura. Nella maggior parte dei casi, la cerva tenterà di fuggire prima che tutto il latte è stato espresso. ritenuta minore è usata in uno sforzo per aumentare il latte rendimento, ma la sicurezza e il comfort sia dei ricercatori e la cerva sono ugualmente importanti.

  1. Somministrare atipamezolo a 2,5 mg / mg medetomadine per via sottocutanea per una rapida inversione della BAM anestetizzato doe.
    Nota: Con entrambi i tipi di anestesia, è necessario mantenere una stretta osservazione del doe fino a quando lei è in grado di camminare da sola senza inciampare o cadere, ed è in grado di mangiare e bere senza timore di aspirazione o di soffocamento. Senza effetti negativi sono stati notati in relazione alla capacità del fulvo ad allattare dopo la raccolta del latte.

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Risultati

Mouse

Dai nostri esperimenti, abbiamo determinato che è possibile raccogliere circa 100-400 ml di latte da un topo di laboratorio, dipendenti da diverse variabili. Queste variabili includono 1) la quantità di tempo dedicato per la raccolta, 2) la dose di ossitocina somministrata, 3) quanti cuccioli la diga è attualmente infermieristica e 4) la quantità di tempo dopo il parto. I nostri studi hanno dimostrato che il rendimento massimo si ottiene quando le dighe sono separati d...

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Discussione

Mouse

Ci sono diversi fattori da prendere in considerazione durante la raccolta del latte da un mouse, di cui 1) la quantità di tempo dedicato per la raccolta, 2) la dose di ossitocina somministrata, 3) quanti cuccioli la diga è attualmente infermieristica e 4) l'importo di tempo che è trascorso da quando parto al momento della raccolta. Utilizzando gli studi precedenti come linee guida, abbiamo deciso di ottimizzare le condizioni per la produzione di latte.

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questi esperimenti sono stati finanziati dalla sovvenzione NIH #RAI093634A. Esprimiamo immensa gratitudine a Jenny Powers, DVM, PhD, per la sua assistenza nella mungitura del Muntjac.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali— Ketamina di topo
(KetaVed 100 mg/ml) (dose: 80-100 mg/kg)MWI/Vedco011075
Xilazina (TranquiVed 100 mg/ml) (dose: 5-10 mg/kg)MWI/VedcoNADA 139236
Lubrificante oculareMWI/Apexa701013
ossitocina (2 UI/kg)Vet One501013
Materiali— Muntjac
Midazolam (1-2 mg/kg)Amerisource Bergen Drug Corp924326Facoltativo: il ricercatore può utilizzare Midazolam da solo o la combinazione BAM come anestetico
Butorphanol tartrato (Torbugesic) (0,45 mg/kg)Fort Dodge Animal HealthNADA 135-780
Azaperone tartrato (0,25 mg/kg)ZooPharm
Medetomadina HCl (0,07 mg/kg)ZooPharm
Antipamezol cloridrato (Antisedan) (dose: 0,25 mg/kg)Orion CorporationNADA 141-033
Ossitocina (10 UI/kg)Vet One501013
Equipment— Topo
P-200 PipetmanGilson F123601
200 μ l puntali per pipetteLight LabsB-2004-SH
siringhe da 1 mlMWI005427
aghi da 27 GMWI002031
Equipment— Muntjac
15 ml tubi coniciVWR21008-918
22 G aghiMWI873
3 ml siringhe luer lockMWI001377

Riferimenti

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
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  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

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