Questo video mostra una strategia semplice e affidabile per la preparazione di colture pure di cellule endoteliali del prosencefalo embrionale entro 10-12 giorni e sarà utile per la ricerca focalizzata su molti aspetti della angiogenesi cerebrale.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule endoteliali cerebrali embrionali possono servire come strumento importante nello studio dell'angiogenesi e sviluppo neurovascolari e interazioni. Le due reti vascolari del prosencefalo embrionale, piale e periventricolare, sono spazialmente distintivo e avere origini e modelli di crescita. Le cellule endoteliali delle reti vascolari piale e periventricolare hanno profili di espressione genica e funzioni uniche. Qui vi presentiamo un protocollo step-by-step per l'isolamento, la cultura, e la verifica delle popolazioni pure di cellule endoteliali dalla rete vascolare periventricolare (PVECs) del prosencefalo embrionale (telencefalo). In questo approccio, telencefalo privo di membrana piale ottenuto da giorno embrionale 15 topi è macinata, digerito con collagenasi / dispasi, e disperso meccanicamente in una sospensione di cellule singole. PVECs sono purificati dalla sospensione cellulare mediante la selezione positiva con l'anticorpo anti-CD-31/PECAM-1 coniugato con microsfere con un forte magneticometodo di separazione. Cellule purificate sono coltivate su collagene 1 rivestite piatti di coltura di cellule endoteliali terreno di coltura fino a quando diventano confluenti e l'ulteriore subcoltivate. PVECs ottenuto con questo protocollo mostra ciottoli e fenotipi fusiformi, come visualizzato dal contrasto di fase microscopia ottica e microscopia a fluorescenza. Purezza delle culture funzione PVEC è stato stabilito con i marcatori delle cellule endoteliali. Nelle nostre mani, questo metodo affidabile e coerente produce popolazioni pure di PVECs. Questo protocollo andrà a beneficio studi volti a ottenere intuizioni meccanicistica nel prosencefalo angiogenesi, comprendere le interazioni funzione PVEC e trasversali colloqui con tipi di cellule neuronali e detiene un enorme potenziale per l'angiogenesi terapeutica.
Introduzione
Angiogenesi, neurogenesi e migrazione neuronale sono eventi critici nel sistema nervoso centrale (SNC) lo sviluppo, la riparazione e la rigenerazione. Diversi studi eleganti hanno dimostrato che le cellule endoteliali stimolano la proliferazione neuronale e viceversa attraverso il rilascio di fattori solubili e per contatto diretto. Abbiamo trovato curioso che nella maggior parte di questi studi 1-3, mentre progenitori neuronali / cellule staminali neurali sono isolate dal cervello embrionale, sono co-coltivate con cellule endoteliali da cervello adulto, altre fonti tessuti adulti, o con linee di cellule endoteliali. Ciò può essere dovuto in parte alle dif....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti e soluzioni
- Rivestimento di 35 mm piatto di coltura: collagene di tipo 1 soluzione viene fornito in soluzione acquosa in 20 mM di acido acetico (~ 100 mg di proteina / fiala). Diluire un volume adeguato di soluzione di collagene per una concentrazione di lavoro del 0,01% con acqua di coltura tissutale sterile grado. Piatti cappotto con 1 ml di soluzione di collagene per 3-4 ore a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la notte a 2-8 ° C. Rimuovere la soluzione in eccesso dal piatto rivestito e lasciarlo asciugare durante la notte. Sciacquare il piatto con acqua di coltura tissutale grado o PBS prima di aggiungere media. ....
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Risultati
La caratterizzazione fenotipica di PVECs dal giorno 1-12 è mostrata da contrasto di fase microscopia ottica (Figura 2). Le cellule attaccate al piatto al giorno 1 mostra morfologia caratteristica di divisione cellulare (Figura 2A). Tra 5-8 giorni, PVECs transizione dalla pietra, affastellate al mandrino morfologia forma tipica per le cellule endoteliali e più simile al suo stato in vivo (Figure 2B e 2C). Di giorno 12 la cultura funzione PVEC ra.......
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Discussione
Funzione PVEC di sono fisiologicamente più rilevanti rispetto adulte cellule endoteliali cerebrali e EC da altre fonti di tessuto per gli studi incentrati sulle interazioni neurovascolari e anche avere un potenziale terapeutico. Per la preparazione funzione PVEC, è principio fondamentale con dissezione di lavorare velocemente per ottenere una buona redditività poiché le cellule morte possono legarsi in modo aspecifico a microsfere CD31. Inoltre, se cella singola sospensione non viene raggiunto prima della fase di marcat.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Depressione e schizofrenia (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health concedere R01NS073635 AV.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagene, soluzione di tipo 1 dalla coda di ratto | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Qualità Biologici | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| Colonna MS | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| Microsfere CD31 | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| Separatore MACS | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Filtro cellulare 70 &; micro; m | BD Bioscienze | 352350 | |
| Soluzione antibiotica e antimicotica | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenasi/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| Piatto di coltura da 35 mm | BD Bioscience | 353001 | |
| Tubo Falcon da 15 ml | BD Bioscienze | 352097 | |
| Tubo Falcon 50 ml | BD Bioscience | 352098 | |
| Kit ECCM | 355054 | BD Bioscience | include un integratore per la crescita delle cellule endoteliali, un EGF e un integratore |
| crescita delle cellule endoteliali (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| Applicazioni per celle | RBECGM | R819-500 | |
| DMEM F12 | Tecnologie per la vita | 10565-018 | |
| Tecnologie GlutaMAX | Life | 305050-061 | |
| Acqua per colture tissutali | Life Technologies | 15230162 | |
| 0,25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Inibitore della tripsina di soia | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscienze | 354234 | |
| Kit di etichettatura cellulare Qtracker 655 | Life Technologies | Q25021 | |
| Membrana al plasma CellLight-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Anticorpo biotinilato isolectina B4 Sigma | L2140 | ||
| Fattore anti-Von Willebrand | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Supporti di montaggio rigidi VECTASHIELD con DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamina | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xilazina | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscopio | Motic | SMZ-168 | |
| Emocitometro | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscopio invertito | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Pinze fini | Roboz Surgical Instrument | 7 inox | |
| Forbici a micropunta fine | Roboz Surgical Instrument | RS5611 |
Riferimenti
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to ....
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Ristampe e permessi
