Articolo metodologico

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

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DOI:

10.3791/51021

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23 gennaio 2014

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo video mostra una strategia semplice e affidabile per la preparazione di colture pure di cellule endoteliali del prosencefalo embrionale entro 10-12 giorni e sarà utile per la ricerca focalizzata su molti aspetti della angiogenesi cerebrale.

Abstract

Cellule endoteliali cerebrali embrionali possono servire come strumento importante nello studio dell'angiogenesi e sviluppo neurovascolari e interazioni. Le due reti vascolari del prosencefalo embrionale, piale e periventricolare, sono spazialmente distintivo e avere origini e modelli di crescita. Le cellule endoteliali delle reti vascolari piale e periventricolare hanno profili di espressione genica e funzioni uniche. Qui vi presentiamo un protocollo step-by-step per l'isolamento, la cultura, e la verifica delle popolazioni pure di cellule endoteliali dalla rete vascolare periventricolare (PVECs) del prosencefalo embrionale (telencefalo). In questo approccio, telencefalo privo di membrana piale ottenuto da giorno embrionale 15 topi è macinata, digerito con collagenasi / dispasi, e disperso meccanicamente in una sospensione di cellule singole. PVECs sono purificati dalla sospensione cellulare mediante la selezione positiva con l'anticorpo anti-CD-31/PECAM-1 coniugato con microsfere con un forte magneticometodo di separazione. Cellule purificate sono coltivate su collagene 1 rivestite piatti di coltura di cellule endoteliali terreno di coltura fino a quando diventano confluenti e l'ulteriore subcoltivate. PVECs ottenuto con questo protocollo mostra ciottoli e fenotipi fusiformi, come visualizzato dal contrasto di fase microscopia ottica e microscopia a fluorescenza. Purezza delle culture funzione PVEC è stato stabilito con i marcatori delle cellule endoteliali. Nelle nostre mani, questo metodo affidabile e coerente produce popolazioni pure di PVECs. Questo protocollo andrà a beneficio studi volti a ottenere intuizioni meccanicistica nel prosencefalo angiogenesi, comprendere le interazioni funzione PVEC e trasversali colloqui con tipi di cellule neuronali e detiene un enorme potenziale per l'angiogenesi terapeutica.

Introduzione

Angiogenesi, neurogenesi e migrazione neuronale sono eventi critici nel sistema nervoso centrale (SNC) lo sviluppo, la riparazione e la rigenerazione. Diversi studi eleganti hanno dimostrato che le cellule endoteliali stimolano la proliferazione neuronale e viceversa attraverso il rilascio di fattori solubili e per contatto diretto. Abbiamo trovato curioso che nella maggior parte di questi studi 1-3, mentre progenitori neuronali / cellule staminali neurali sono isolate dal cervello embrionale, sono co-coltivate con cellule endoteliali da cervello adulto, altre fonti tessuti adulti, o con linee di cellule endoteliali. Ciò può essere dovuto in parte alle difficoltà tecnici associati isolando e coltivando popolazioni pure di cellule endoteliali dal cervello embrionale. Tuttavia, l'angiogenesi, la neurogenesi e migrazione neuronale sono eventi concomitanti che si verificano in ordini di grandezza più robusta nel cervello embrionale rispetto al normale cervello adulto. La rete vascolare periventricolare del embryonic proencefalo (telencefalo) proviene da una nave situata all'interno dei gangli basali primordium e si sviluppa in forma di un gradiente ordinata da ventrale a quella dorsale telencefalo dal giorno embrionale 11 (E11) 4,5. Questo plesso delle navi della rete vascolare periventricolare sono distinti da navi piale basato su origini, posizione anatomica, modelli di crescita, e la regolamentazione dello sviluppo 4,5. La direzione di propagazione della sfumatura angiogenesi periventricolare corrisponde alla telencefalico trasversale gradiente neurogenetico. All'interno del telencefalo, il gradiente angiogenesi periventricolare e la pendenza dei neuroni GABA migrazione sovrapposizioni tangenzialmente spazialmente pure 6. Per quanto riguarda i tempi, il gradiente angiogenesi è in anticipo rispetto al neurogenetico gradiente e GABA neurone gradiente di circa un giorno. Così, le cellule endoteliali periventricolare sono spazialmente e temporalmente ben posizionati per fornire spunti critici per sostenere la neurogenesi telencefalica eneuronale 4,6 migrazione. Pertanto, l'uso delle embrionali cellule endoteliali periventricolare in esperimenti di co-coltura con cellule progenitrici e / o neuroni neuronali potrebbe fornire un modello più favorevole per lo studio delle interazioni neurovascolari e lo sviluppo di nuovi viali per il trattamento di malattie neurodegenerative o lesioni cerebrali traumatiche / ischemico.

Sottolineiamo l'importanza di eliminare la membrana piale, non solo per limitare la contaminazione delle cellule epiteliali, ma anche per separare le cellule endoteliali piale che sono molecolarmente e funzionalmente distinta dalle cellule endoteliali della periventricolare rete vascolare 4,6 (PVECs denominati per distinguerli da piale EC) . Qui, descriviamo il metodo che usiamo abitualmente nel nostro laboratorio per ottenere una resa ricca e pura di PVECs. Queste cellule endoteliali sono preparati da forebrains embrionali isolate da un singolo mouse al momento giusto incinta. Essi possono essere ampliati, subcoltivate e congelati giù con successo per un uso futuro.

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Protocollo

1. Preparazione dei reagenti e soluzioni

  1. Rivestimento di 35 mm piatto di coltura: collagene di tipo 1 soluzione viene fornito in soluzione acquosa in 20 mM di acido acetico (~ 100 mg di proteina / fiala). Diluire un volume adeguato di soluzione di collagene per una concentrazione di lavoro del 0,01% con acqua di coltura tissutale sterile grado. Piatti cappotto con 1 ml di soluzione di collagene per 3-4 ore a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la notte a 2-8 ° C. Rimuovere la soluzione in eccesso dal piatto rivestito e lasciarlo asciugare durante la notte. Sciacquare il piatto con acqua di coltura tissutale grado o PBS prima di aggiungere media. Piatti rivestiti possono essere conservati a 4 ° C per un mese.
  2. Preparare completa di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM). Integrare il DMEM (500 ml) con 10% FBS e soluzione antibiotica-antimicotica (concentrazione 1x; 1 ml/100 ml). DMEM completo può essere conservato a 4 ° C per due mesi.
  3. Preparare una aliquota (50 ml) di DMEM con DNasi I (0,001 mg / ml), (denominato DMEM-DNasi I).
  4. Preparare un'altra aliquota (10 ml) di DMEM con collagenasi e dispasi (1 mg / ml) (denominato DMEM-collagenase/dispase).
  5. Preparare cellule endoteliali Cultura Media (ECCM, 500 ml), integrato con EGF (5 mg), ECG (100 mg) e 5 ml di soluzione antibiotica-antimicotica. ECCM può essere conservato a 4 ° C per due mesi.
  6. Preriscaldare tutti i media prima dell'uso.
  7. Preparare buffer di purificazione: PBS, pH 7,2 con 0,5% BSA e 2 mM EDTA. Tenere tampone a freddo (2-8 ° C).

2. Rimozione di embrioni e la dissezione di Telencefalo

Tutti gli esperimenti su animali da laboratorio sono approvati dalla cura degli animali e l'uso comitati del McLean Hospital e conformi alle linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

  1. Utilizzare cronometrate topi CD1 gravidanza (giorno embrionale 15). Il giorno della scoperta spina vaginale è considerato embrionale giorno 0 (E0). Dighe CD1 generalmente producono grandi cucciolate, così 10-12 embriones sono attesi da una diga incinta.
  2. Per isterotomia, anestetizzare i topi in gravidanza con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) / xylazina (5 mg / kg). Per i topi di circa 20-30 g, erogare 0,3 ml di una soluzione anestetica 10 ml / kg di ketamina / xilazina e garantire che il dolore e il disagio è minimo durante le iniezioni intraperitoneali di anestetico. Utilizzare ritenuta mano per le iniezioni.
  3. Controllare anestesia profonda da pizzico punta. Rimuovere gli embrioni di topi profondamente anestetizzati. Decapitare ogni embrione immediatamente dopo l'estrazione dalla madre. Mettere le teste embrionali in piastre sterili a freddo ghiaccio PBS.
  4. Segui isterectomia per eutanasia immediato con overdose di anestetico (130 mg / kg pentobarbital, ip), un metodo di eutanasia, che è coerente con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali: 2013 Edition.
  5. Sotto un microscopio stereo, rimuovere il cervello dalla testa con le forbici MicroTip sottili e una pinza sottile. Nota: Un sezionare alta qualitàione è essenziale per rimuovere con successo la membrana piale dal cervello embrionale. Ciò si ottiene con la pratica. Pinza sottile e forbici MicroTip sono strumenti fondamentali per ottenere un buon dissezione.
  6. Utilizzare le pinze per avere una presa salda sul cervello e le forbici MicroTip a staccarsi membrana piale. Rimuovere il mesencefalo e metencephalon e isolare il telencefalo. Trasferimento telencefalo-piale libero da tutti gli embrioni per un piatto di cultura 35 millimetri con 2 ml di PBS nel ghiaccio.

3. Isolamento delle cellule

  1. Macinare telencefalo in 1-2 mm frammenti con una lama di bisturi e raccogliere il tessuto in un tubo Falcon da 15 ml contenente 2 ml di DMEM completo.
  2. Dissociare il tessuto delicatamente ma accuratamente con una pipetta 1 ml fino grumi scompaiono e una sospensione lattiginosa è raggiunto.
  3. Centrifugare dissociato cellule a 800-1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere pellet in DMEM-DNasi I. delicatamente dissociare il cells nuovamente utilizzando 1 ml pipetta e centrifugare a 800-1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Risospendere il pellet in caldo DMEM completo. Celle filtranti attraverso una sterile maglia di Nylon 70 micron. Raccogliere le cellule filtrati e tenere in ghiaccio.
  6. Raccogliere le cellule porzioni trattenuti sulla maglia e digerire ulteriormente con DMEM-collagenase/dispase (2 ml) per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3x cellule in DMEM-DNasi tramite centrifugazione a 800-1000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Pool queste cellule con le cellule filtrati raccolti nel passo 3.5. Lavare le cellule in totale una volta con DMEM completo. Procedere per determinare il numero di cellulare e passaggi di etichettatura magnetici. Nota: è importante avere una cella singola sospensione prima marcatura magnetica.

4. Etichettatura magnetica

  1. Questo protocollo mostra la marcatura magnetica di 10 7 cellule. Per il numero di cellule inferiore a 10 7, utilizzare lo stesso volume di reagente e per il numero di cellule superiore a 10 7, scalare tutti i volumi dei reagenti e dei volumi totalidi conseguenza (ad esempio 2 x 10 7 cellule totali, utilizzare il doppio del volume di tutti i reagenti indicati). Conservare tutti i reagenti e le cellule in ghiaccio.
  2. Determinare il numero di cellule con un emocitometro.
  3. Sospensione cellulare centrifugare a 300 xg per 10 minuti a RT. Aspirare il surnatante completamente.
  4. Aggiungere 90 μl/10 7 cellule di tampone di purificazione al pellet seguita da 10 ml di microsfere CD31. Le microsfere forniti dal costruttore sono coniugati ad anticorpo monoclonale anti-CD31 mouse.
  5. Mescolare bene e incubare per 15 minuti in frigorifero. Nota: temperature più elevate e / o tempo di incubazione più lungo durante l'etichettatura magnetica può provocare legame non specifico.
  6. Lavare le cellule aggiungendo 1-2 ml/10 7 cellule di tampone di purificazione e centrifugare a 300 xg per 10 min. Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 500 ml di buffer di purificazione. Procedere alla separazione magnetica o fase di purificazione.

5. Purification

  1. Mettere colonna MS nel campo magnetico della MACS separatore.
  2. Risciacquare colonna con 500 microlitri di tampone di purificazione.
  3. Applicare sospensione cellulare sulla colonna. Caricare numero adeguato di cellule per colonna MS come numero di cellule superiore può intasare la colonna. Attenzione: Ogni colonna MS può ospitare un numero massimo di 2 x 10 7 cellule, per un numero di cellule superiore, utilizzare più colonne.
  4. Raccogliere e smaltire flow-through contenente cellule senza etichetta.
  5. Lavare colonna con 500 ml di buffer di depurazione tre volte. Durante le fasi di lavaggio, assicurarsi che il serbatoio colonna è vuota prima di aggiungere ulteriori aliquote del buffer di purificazione.
  6. Togliere colonna dal separatore MACS e posizionarlo su un tubo Falcon 15 ml.
  7. Un pistone viene fornito insieme con la colonna MS. Pipettare 1 ml di tampone di purificazione nella colonna MS e subito scovare le cellule marcate magneticamente saldamente spingendo lo stantuffo nella colonna.
  8. Piatto cells su un piatto di coltura 35 millimetri rivestiti con collagene di tipo 1 e crescere le cellule in ECCM in un incubatore a 37 ° C con 95% O 2 e 5% CO 2.
  9. Cambia il mezzo ogni quattro giorni. Utilizzare PVECs per esperimenti o sottocultura dopo 10-12 giorni, quando il piatto è confluente.

6. Subculture del fotovoltaico ECS

  1. Rimuovere il ECCM e risciacquare il monostrato di PVECS con 1-2 ml di PBS sterile.
  2. Aggiungere delicatamente 1,5 ml di soluzione 0,25% tripsina-EDTA a coprire il monostrato cellulare.
  3. Riportare il piatto per l'incubatore. Entro 5-7 minuti, le cellule saranno staccarsi dalla superficie del piatto.
  4. Dopo che le cellule hanno staccato, immediatamente aggiungere un uguale volume di inibitore della tripsina e triturare più volte.
  5. Trasferire le cellule ad una sterile 15 ml tubo Falcon. Centrifugare la provetta a 500 xg per 5 min.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di preriscaldata ECCM.
  7. Seed le cellule per espandere la cultura, iminvecchiamento o altri saggi.

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Risultati

La caratterizzazione fenotipica di PVECs dal giorno 1-12 è mostrata da contrasto di fase microscopia ottica (Figura 2). Le cellule attaccate al piatto al giorno 1 mostra morfologia caratteristica di divisione cellulare (Figura 2A). Tra 5-8 giorni, PVECs transizione dalla pietra, affastellate al mandrino morfologia forma tipica per le cellule endoteliali e più simile al suo stato in vivo (Figure 2B e 2C). Di giorno 12 la cultura funzione PVEC ra...

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Discussione

Funzione PVEC di sono fisiologicamente più rilevanti rispetto adulte cellule endoteliali cerebrali e EC da altre fonti di tessuto per gli studi incentrati sulle interazioni neurovascolari e anche avere un potenziale terapeutico. Per la preparazione funzione PVEC, è principio fondamentale con dissezione di lavorare velocemente per ottenere una buona redditività poiché le cellule morte possono legarsi in modo aspecifico a microsfere CD31. Inoltre, se cella singola sospensione non viene raggiunto prima della fase di marcat...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da una Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Depressione e schizofrenia (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health concedere R01NS073635 AV.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DNase ISigmaD-4527 
Collagene, soluzione di tipo 1 dalla coda di ratto SigmaC3867 
DPBSQualità Biologici114057-131 
EDTAFisher ScientificM4055 
BSASigmaA2058 
Colonna MSMiltenyi Biotech130-042-201 
Microsfere CD31Miltenyi Biotech130-097-418 
Separatore MACSMiltenyi Biotech130-042-102 
MACS multi standMiltenyi Biotech130-042-303 
Filtro cellulare 70 &; micro; mBD Bioscienze352350 
Soluzione antibiotica e antimicoticaSigmaA5955 
FBSSigmaF4135 
Collagenasi/DispaseRoche10269638001 
DMEM Lonza12-604F 
Piatto di coltura da 35 mmBD Bioscience353001 
Tubo Falcon da 15 ml BD Bioscienze352097 
Tubo Falcon 50 mlBD Bioscience352098 
Kit ECCM355054BD Bioscienceinclude un integratore per la crescita delle cellule endoteliali, un EGF e un integratore
crescita delle cellule endoteliali (ECGS)BD Bioscience354006 
Applicazioni per celleRBECGMR819-500 
DMEM F12 Tecnologie per la vita10565-018 
Tecnologie GlutaMAXLife305050-061 
Acqua per colture tissutaliLife Technologies15230162 
0,25% TrypsinLife Technologies15050 
Inibitore della tripsina di soiaBD Bioscience5425 
MatrigelBD Bioscienze354234 
Kit di etichettatura cellulare Qtracker 655Life TechnologiesQ25021 
Membrana al plasma CellLight-RFP, BacMam 2.0Life TechnologiesC10608 
Anticorpo biotinilato isolectina B4 SigmaL2140 
Fattore anti-Von WillebrandSigmaF3520 
Anti-CD31/PECAM-1BD Pharmingen550274 
Supporti di montaggio rigidi VECTASHIELD con DAPIVector LaboratoriesH-1500 
KetaminaButler Schein Animal Health Supply44028 
XilazinaLloyd Laboratories1009 
StereomicroscopioMoticSMZ-168 
EmocitometroFisher Scientific267110 
Microscopio invertitoOlympus CK-40CK-40 
Microscopio a fluorescenzaOlympus FSX-100FSX-100 
Pinze finiRoboz Surgical Instrument7 inox 
Forbici a micropunta fineRoboz Surgical InstrumentRS5611 
Il kit per la

Riferimenti

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