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Articolo metodologico

Fluorescenza

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DOI:

10.3791/51030

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24 febbraio 2014

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1Department of Entomology, Volcani Center, 2Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 3Department of Applied Sciences, Institute for Adriatic Crops and Karst Reclamation, 4The Institute of Plant Sciences, Volcani Center

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui un semplice ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la localizzazione di virus e batteri nei tessuti insetti e vegetali. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di mRNA in tutto il monte e le sezioni microscopiche.

Abstract

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è un nome dato a una varietà di tecniche comunemente utilizzate per la visualizzazione trascritti genici in cellule eucariotiche e può essere ulteriormente modificato per visualizzare altri componenti della cellula come l'infezione con virus e batteri. Localizzazione spaziale e la visualizzazione di virus e batteri durante il processo di infezione è un passo essenziale che integra espressione profiling esperimenti come microarrays e RNAseq in risposta a diversi stimoli. Comprendere le infezioni spazio-temporali con questi agenti integra esperimenti biologici volti a comprendere la loro interazione con componenti cellulari. Diverse tecniche di visualizzazione dei virus e batteri come sistemi gene reporter o metodi immunoistochimici richiedono molto tempo, e alcuni sono limitati a lavorare con organismi modello e coinvolgere metodologie complesse. FISH destinato RNA o DNA specie nella cella è un me relativamente facile e veloceThOD per studiare la localizzazione spazio-temporale di geni e per scopi diagnostici. Questo metodo può essere robusto e relativamente facile da attuare quando i protocolli impiegano breve ibridazione, sonde commercialmente acquistati, che non sono costosi. Ciò è particolarmente robusto quando la preparazione del campione, la fissazione, ibridazione, e la visualizzazione microscopica non comportano passaggi complessi. Qui si descrive un protocollo per la localizzazione di batteri e virus nei tessuti insetti e vegetali. Il metodo si basa sulla preparazione semplice, fissazione, e l'ibridazione dei monti interi insetti e organi sezionati o parti di impianti fatti a mano, con 20 paia di basi sonde di DNA brevi coniugati con coloranti fluorescenti sul loro 5 'o 3' finisce. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di tessuti insetti e vegetali, e può essere utilizzato per analizzare l'espressione di mRNA o altre specie di RNA o DNA nella cellula.

Introduzione

Quando studio delle interazioni tra virus vegetali e altri patogeni con i loro ospiti vegetali infetti, è importante visualizzare i patogeni e relativi acidi nucleici in situ, indipendentemente dal fatto che causano effetti negativi sulla loro ospiti. Questo è molto importante quando si studia il movimento patogeno all'interno e tra le cellule vegetali. Nella localizzazione in situ di prodotti genici del patogeno è un passo essenziale che integra altri approcci per studiare il processo di patogenicità. Molti agenti patogeni delle piante, in particolare virus, vengono trasmessi da insetti, avendo interazioni complesse e intime con i loro vettori. La localizzazione di questi virus nei loro vettori è importante per studiare il percorso per la trasmissione, e le possibili siti di interazione all'interno del vettore. La trasmissione di alcuni virus delle piante insetto-vectored è aiutata da batteri endosimbiontica che risiedono all'interno di questi insetti. Per studiare meglio la trasmissione di questi virus vegetali by loro vettori, è anche indispensabile per visualizzare i batteri endosimbiontica in generale, e quelli coinvolti nella trasmissione del virus, in particolare. Colocalizzazione dei batteri virus e endosimbiontica è quindi desiderato per indagare le possibili relazioni tra questi organismi, nel loro ospite insetti. A parte la trasmissione del virus, batteri endosimbiontica influenzano diversi aspetti della biologia di insetti vettori, la localizzazione così spaziale di questi batteri all'interno di insetti è di grande interesse e importanza.

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) è il più importante complesso malattia virale di pomodoro coltivata in tutto il mondo 1-4. TYLCV è un virus floema limitata ed è vectored esclusivamente dalla mosca bianca Bemisia tabaci 5,6. Un modello che descrive la traslocazione di begomoviruses nei loro vettori mosche bianche è stato proposto 6-9. Due ostacoli specifici sono attivamente attraversati duranteing questa trasmissione circulative: midgut / emolinfa e le barriere ghiandole emolinfa / salivari. Questo processo di trasmissione si ipotizza essere mediata da recettori sconosciute che riconoscono il capside del virus. TYLCV è pensato per attraversare B. tabaci midgut 6,10, e viene assorbito attraverso la ghiandola salivare primario 6 prima di essere iniettato nella pianta. Nel emolinfa mosca bianca, TYLCV interagisce con una proteina GroEL prodotta dal batterio insetto endosimbiontica secondario Hamiltonella. Questa interazione garantire un trasporto sicuro del TYLCV nella emolinfa, e lo protegge dagli attacchi del sistema immunitario degli insetti 11. Hamiltonella e Portiera, il endosymbiont primario di mosche bianche, sono alloggiati in bacteriocytes, cellule di insetto si trovano nelle emolinfa e la casa endosimbiontica batteri 11. B. tabaci ospita batteri endosimbiontica aggiuntive, tra cui Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, e FritschEA, che può essere localizzata all'interno o all'esterno dei bacteriocytes, e hanno diversi effetti sulla biologia dell'insetto 12.

Diversi studi hanno cercato di studiare la localizzazione di TYLCV in piante e whiteflies utilizzando protocolli in termini di tempo e costosi quali microscopia elettronica a trasmissione (TEM), anticorpi e RNA in situ su sezione di spessore microscopico 10,13, uno studio recente ha descritto la localizzazione dei virus delle piante all'interno delle loro piante e vettoriali padroni di casa utilizzando un semplice protocollo 14. Qui si descrive un protocollo semplice per la localizzazione di TYLCV in B. tabaci sezionato midguts e delle ghiandole salivari, e nelle sezioni preparato da piante TYLCV da HIV. Descriviamo ulteriormente la localizzazione della Portiera, il endosymbiont primario di B. tabaci, e le sue endosimbionti secondarie Hamitonella, Rickettsia e Arsenophonus. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di sonde di DNA corti, chesono fluorescente sulla loro estremità 5 ', e specificamente ibridarsi sequenze complementari a sequenze di geni virali o batterici. Il campione di trasformazione è relativamente facile e il segnale ottenuto è altamente specifico. Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare virus, batteri e altri agenti patogeni nel loro vegetali, animali e insetti host, e può inoltre essere utilizzato per localizzare mRNA in un dato tessuto.

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Protocollo

1. Preparazioni Generale Whitefly, Flora e virus per l'analisi FISH

  1. Posteriore B e Q aleurodidi biotipo su piantine di cotone (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) e mantenere all'interno di gabbie a prova di insetti e camere di crescita in condizioni standard di 25 ± 2 ° C, 60% di umidità relativa, e una luce di 14 ore / 10-hr fotoperiodo scuro.
  2. Eseguire PCR per testare infezione con endosimbionti utilizzando primer specifici endosymbiont come precedentemente descritto 15-19.
  3. Acquistare Piantine di pomodoro (Solanum esculentum cv. Bistecca) da un vivaio commerciale oppure semi di pomodoro pianta.
  4. Mantenere nelle stesse condizioni di allevamento sopra descritte fino a quando le piante raggiungono il quattro stadi true-foglia, l'età più adatta per whitefly-mediata inoculazione di TYLCV 15 (vedere paragrafo 4.1).

2. Manipolazione Insetto, Fissazione, Probe Design, ibridazione e visualizzazione per Endosimbionte FISH

  1. Raccogliere 10 aleurodidi adulti per aspirazione da piante di cotone, o scegliere 10 3 ° o 4 ° ninfe instar da foglie di cotone.
  2. Immergere immediatamente in fissativo di Carnoy (acido cloroformio-etanolo-acetico glaciale, 06:03:01, vol / vol) all'interno di tubi Eppendorf. Fix per 2 ore a notte (preferibilmente durante la notte).
  3. Rimuovere completamente il fissativo e decolorare nel 6% H 2 O 2 in etanolo per 2 ore.
  4. Conservare i campioni in etanolo assoluto per diversi giorni a diverse settimane a temperatura ambiente, o procedere al passo successivo.
  5. Sonde di progettazione complementari primer DNA temporanee basate sui 16S ribosomiale geni RNA di ciascun batterio. Per progettare le sonde, tenere il conto delle stesse considerazioni per la progettazione di primer PCR. Utilizzare le sonde oligonucleotidiche BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', Rb1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-BTH Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'e Ars2 5'-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'per la gestione mirata di Portiera, Rickettsia, Hamilonella, e Arsenophonus, rispettivamente.
  6. Ibridare campioni notte al buio in tampone di ibridazione (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [peso / vol] sodio dodecil solfato, 30% formammide [vol / vol]) contenente 10 pmol sonda fluorescente per ml . Combinare più di una sonda con differenti coloranti fluorescenti se necessario. Utilizzare aleurodidi non infette con il batterio mirati e campioni non-probe come controlli negativi.
  7. Montare i campioni di tutto, su un vetrino da microscopio, in tampone di ibridazione contenuta con un bloccante liquido, coprire con un vetrino, sigillare con smalto, e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale.

3. Whitefly Organo Dissection, Fissazione, ibridazione e visualizzazione per TYLCV FISH

  1. Raccogliere aleurodidi adulti allevati con continuità su piante di pomodoro TYLCV infettati mediante aspirazione e anesthetize dall'esposizione a tovagliolo di carta impregnata con acetone. Esporre aleurodidi solo per 1-2 min come troppo lunga esposizione di acetone può risolvere aleurodidi tessuti. Utilizzare aleurodidi nonviruliferous allevati su piante di pomodoro non infette e non campioni sonda per i controlli per confermare l'ibridazione specifica.
  2. Aleurodidi Montare su microscopio depressione scivoli per la dissezione degli organi utilizzando un microscopio stereo.
  3. Tirare via la testa dell'insetto dal protorace e sezionare ghiandole salivari in 1x PBS completato con l'1% di toluidina blu macchia per una migliore visualizzazione, a causa delle loro piccole dimensioni. Consentire l'assorbimento del colorante per 2-3 min.
  4. Estrarre l'insetto parte alla confluenza tra il torace e l'addome per osservare ed espellere il midgut. Espellere il contenuto dell'addome spingendo con una pinza sulla punta addome.
  5. Rimuovere delicatamente il PBS e blu di toluidina da dissezioni di successo e aggiungere lentamente 300 ml di fissativo di Carnoy per risolvere gli organi per 5 min.
  6. Ladd il fissativo da un lato del bene depresso e non dalla parte superiore per impedire movimenti incontrollati degli organi sezionati. Una volta che tocca il fissativo, gli organi aderiranno al vetro, e tutto il processo che non si muovano.
  7. Rimuovere fissativo e aggiungere 500 ml di tampone di ibridazione supplementato con 10 pmol della sonda di DNA fluorescente Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', che è complementare ad una sequenza in TYLCV gene della proteina di rivestimento.
  8. Ibridare notte a temperatura ambiente al buio incubando il vetrino con il campione all'interno di una piccola camera umida composta piccola scatola di plastica con carta asciugamano bagnato sul fondo.
  9. Dopo l'ibridazione, raccogliere gli organi con uno strumento di dissezione fine e rapidamente spostarli in un vetrino da microscopio fresco contenente 30 ml di nuovo tampone di ibridazione integrati con DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) e contenuti con bloccante liquido.
  10. Coprire i campioni con un vetrino, sigillare spiritoh smalto per unghie e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale.

4. Manipolazione pianta, a mano sezionamento, Fissazione e ibridazione per TYLCV FISH

  1. Seminare piantine di pomodoro con TYLCV utilizzando viruliferous inoculazione mosca bianca-mediata. Il virus può essere rilevato usando questo metodo FISH in piante asintomatiche una settimana dopo l'inoculazione. I sintomi della malattia tipici sono visibili tre settimane dopo l'inoculazione. Utilizzare piante di pomodoro infette e nessun campione sonda per i controlli per confermare l'ibridazione specifica.
  2. Utilizzare una lama di rasoio istologico affilata per la preparazione tagliate a mano 2-4 cm di lunghezza sezioni longitudinali o trasversali di pomodoro steli e foglie.
  3. In provette Eppendorf, fissare le sezioni in fissativo di Carnoy per 2 ore durante la notte a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere fissativo e preservare le sezioni in etanolo assoluto per diversi giorni a diverse settimane a temperatura ambiente, o procedere al passo successivo.
  5. Lavare le sezionitre volte, 1 min ciascuno, in tampone di ibridazione.
  6. Ibridare le sezioni con 500 microlitri di tampone di ibridazione supplementato con 10 pmol di oligonucleotide sonda fluorescente Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'che è complementare ad una sequenza in TYLCV gene della proteina di rivestimento.
  7. Lavare le sezioni tre volte, 1 min ciascuno, in tampone di ibridazione.
  8. Mount intere sezioni in tampone di ibridazione integrato con DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) e contenuti con blocker liquido, coprire con un vetrino, sigillare con smalto e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale.

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Risultati

Il sistema studiato in questo manoscritto è mostrato in Figura 1 e comprende una pianta infetta con TYLCV, un adulto e una ninfa del whitefly B. tabaci, e l'anatomia interna della mosca bianca che mostra il percorso per TYLCV traslocazione nella insetto. Figura 2 mostra doppia FISH in una mosca bianca adulta per il simbionte primario Portiera e il simbionte secondario Arsenophonus. figura 3 mostra doppia FISH per Portiera e Ha...

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Discussione

Il protocollo descritto qui per la localizzazione di un virus vegetale nella sua pianta ospite e dell'insetto vettore, e batteri endosimbiontica nel loro ospite whitefly specifico, può essere adattato per la localizzazione di altri virus in piante e anche nei tessuti animali. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per localizzare batteri endosimbiontica e patogeni e altri microrganismi in sistemi vegetali e animali. I metodi descritti si basano sul semplice concetto di ibridazione tra breve, fluorescenza marca...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

La ricerca in laboratorio Ghanim è stato supportato da assegno di ricerca n. 908-42.12/2006 dal tedesco-israeliano Foundation (GIF), Grant no. IS-4062-07 dagli Stati Uniti e Israele binazionale agricolo di Ricerca e Sviluppo Fund (BARD), e assegno di ricerca n. 884/07 da Israele Science Foundation (ISF) per MG

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etichettato in modo fluorescente  SondeMetabion20 bp HPLC purificatoSequenza progettata dal cliente
Blu di toluidinaSigma-Aldrich89640
Sodio Dodecil solfatoSigma-AldrichL3771Grado di biologia molecolare
FormamideSigma-AldrichF9037Grado di biologia molecolare
Tris-HClSigma-AldrichT5941Grado di biologia molecolare
Acido acetico glacialeSigma-Aldrich320099
bloccante liquidoTed Pella Inc.Codice 22309
di biologia molecolare

Riferimenti

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  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).

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