Una proboscide risposta estensione Protocollo per Indagare plasticità comportamentale in Insetti: Applicazione di base, biomedica e ricerca agricola

Molti insetti conoscere stimoli ecologicamente rilevanti, e quindi cambiano le loro risposte comportamentali a tali stimoli al fine di adattarsi a nuove relazioni predittive nel loro ambiente. Diversi meccanismi diversi possono essere alla base questa plasticità comportamentale (ad esempio, non associativa, associativa / pavloviano, e operante / strumentale ^1). Questi tipi di plasticità differiscono nel modo stimoli o comportamenti sono associati a eventi importanti, quali il verificarsi di cibo, un compagno, o pericolo. La comprensione di queste forme di plasticità è molto importante per la ricerca di base nel modo in cui il sistema nervoso cambia per codificare nuove memorie ^2. E 'anche importante per comprendere i comportamenti adattivi di insetti che sono vettori di malattie importanti (ad esempio, tse-tse e la zanzara) e di insetti che sono importanti agricolo, sia nella produzione agricola (api da miele) o come parassiti.

Studiare la plasticità comportamentale in qualsiasi animAl richiede un livello di controllo sperimentale su un numero di variabili che non è realizzabile nel campo ^1. Si richiede lo sviluppo di un protocollo di condizionamento robusto che può essere impiegato in condizioni più controllate, ma che sono ancora rilevanti per il comportamento in condizioni naturali. Il miele delle api (Apis mellifera) è un ottimo modello per come sviluppare un protocollo per l'esecuzione di analisi controllate di plasticità comportamentale ^3,4. La risposta estensione proboscide (PER) in api mellifere è un riflesso naturale comportamentale in cui l'ape estende la sua proboscide in risposta alla stimolazione antenne con una soluzione di zucchero. Durante il normale comportamento di foraggiamento, PER verifica quando il miele delle api trova il nettare in un fiore. Fortunatamente, le api mellifere saranno prontamente presentare questo comportamento semplice e facilmente quantificabile in laboratorio. Questo rende possibile studiare, in un ambiente controllato, i meccanismi che influenzano questo comportamento ecologicamente rilevante ^5. PER can essere utilizzato anche all'interno di un protocollo di condizionamento per indagare la percezione dello stimolo e l'apprendimento e la memoria in diverse condizioni di trattamento, che sono progettati per rivelare i meccanismi comportamentali e neurali che sono alla base della plasticità ^6.

Fin dai primi studi di Kuwabara ^7, PER condizionata è stato ampiamente utilizzato per rivelare non associativa, associativo e meccanismi operanti che sono alla base della plasticità comportamentale api mellifere ^8. Questi meccanismi sono identici a quelli rivelato negli studi di liberamente battenti api mellifere ^9. A differenza degli studi di liberamente volanti api da miele, PER protocolli di condizionamento possono essere accoppiati con elettrofisiologia ^10,11 o live-cell imaging di fluorescenza ^12-14 del cervello. Inoltre, i protocolli PER permettono di manipolazione sperimentale dei processi neurali attraverso trattamenti farmacologici o genetici molecolari per verificare ipotesi circa i ruoli dei componenti specifici della rete, come ad esempio neuromodulators ^15,16. PER protocolli hanno anche fornito un modo importante per valutare gli effetti subletali di condizioni ambientali e tossine sulla salute e bottinatrici efficienza delle api mellifere ^17.

Questa procedura descrive due metodi di consegna odore in parallelo. Metodo 1 è una versione di odore e di stimolo incondizionato (saccarosio) consegna che fornisce un metodo poco costoso e tecnicamente semplice per presentare l'odore e la ricompensa di saccarosio. Questo metodo è buono per la formazione di base e quando l'automazione non è possibile. Si tratta di un ottimo modo per introdurre questa tecnica per un laboratorio di classe o di insegnamento. Durante condizionata per gli esperimenti che coinvolgono compiti più difficili e valutazioni fisiologiche accoppiati della percezione degli odori, l'apprendimento, o la memoria, è molto importante per regolare in modo accurato e preciso l'insorgenza, tempistiche di consegna, la durata degli stimoli. Per la consegna stimolo più affidabile, usare un mezzo di automatizzare la consegna di un odorend un preciso metodo di consegna ricompensa. Metodo 2 impiega automatizzato consegna odore e precisa consegna saccarosio. E 'tecnicamente più sofisticato e richiede più per la configurazione iniziale di metodo 1, ma aumenta in modo significativo la coerenza dei tempi e la quantità di stimoli utilizzati per il condizionamento e dovrebbe essere usato quando possibile.

1 Odore (Condizionata Stimulus) Impostazione Cartuccia

1. All'inizio dell'esperimento, configurazione cartucce odore più per tutti i diversi odori necessari per le prove di condizionamento.
   1. Utilizzare una cappa aspirante per la diluizione degli odori e la preparazione cartuccia odore. Mai bottiglie aperte di odori al di fuori di quella cappa, dal momento che gli odori si diffuse rapidamente in tutto il laboratorio e potenzialmente esporre le api il miele per l'odore prima di condizionamento. Inoltre, indossare guanti durante l'impostazione delle cartucce odore e lavare accuratamente in seguito per evitare di esporre le api da miele al odori durante la manipolazione di loro.
   2. Assicurarsi che ogni cartuccia odore è chiaramente etichettato con un'etichetta con codice colore del l'odore per cui viene utilizzato prima. Non usare mai una cartuccia odore (siringa o stantuffo) per più di un odore, dal momento che ci possono essere odore residuo sulla cartuccia.
2. Odori Preparazione e Odore Miscele
   1. Diluire odori in entrambi esano o olio minerale al dconcentrazione esired.
      NOTA: La modifica della concentrazione di odore o di presentare le miscele di due o più odoranti possono consentire un'indagine di ulteriori aspetti di come le api percepiscono gli odori e imparano l'associazione condizionato. Miscele odore può essere semplice come una miscela binaria 50:50 o così complesso come diversi odori che imitano gli stimoli olfattivi naturali. Riducendo la concentrazione dell'odore aumenta anche la difficoltà del compito.
      1. Gli odori diventeranno impoverito con riutilizzo della cartuccia (Figura 2). Per evitare problemi di esaurimento rendono abbastanza cartucce per essere in grado di passare a una nuova cartuccia ogni 10-12 utilizzi.
3. Preparazione Odore Cartucce
   1. Metodo 1
      1. Per questo metodo, utilizzare 20 ml siringhe di plastica con un diametro di 15 mm di carta da filtro appuntato al fine di gomma del pistone per cartucce odore.
      2. Rimuovere lo stantuffo dalla siringa e utilizzare una puntina da disegno per fissare il pezzo di filtecarta r alla fine dello stantuffo.
      3. Utilizzare una micropipetta a versare 10 ml di odore sulla carta da filtro, e reinserire lo stantuffo nel cilindro della siringa. Spingere lo stantuffo fino alla tacca 15 ml sul cilindro della siringa.
   2. Metodo 2
      1. Per questo metodo, utilizzare il vetro 1 cc o siringhe tubercolina plastica (o pipette modificate di volumi simili e forma) con una striscia di carta da filtro all'interno e un limitatore di gomma o di silicone nella vasta fine del corpo della siringa per le cartucce odore.
      2. Rimuovere lo stantuffo da un 1 cc siringa tubercolina. Il corpo della siringa sarà il corpo della cartuccia odore.
      3. Rimuovere la punta in gomma nera dal stantuffo della siringa e tagliare l'estremità chiusa della punta di gomma.
         NOTA: Questo anello in gomma agirà come un limitatore per ridurre l'aspirazione dal flusso d'aria nell'arena, che prematuramente trarre odore dalla cartuccia e sopra il miele delle api trattenuto. In alternativa, tubi in silicone (4,8 millimetri outediametro r) tagliato in 5 sezioni mm funziona come limitatori.
   3. Sciacquare l'interno del corpo della siringa e il limitatore di gomma / silicone con etanolo al 70% (per rimuovere tanto l'odore residuo da uso precedente) e lasciarli asciugare all'aria.
   4. Posizionare una striscia di 0,2 x 4 cm di carta da filtro in ampia apertura della canna in modo che la carta si estende 1-2 cm oltre l'apertura.
   5. Utilizzare una micropipetta per posizionare 3-10 microlitri dell'odore sulla carta da filtro senza lasciare l'odore toccare l'estremità del corpo della siringa. La punta della pipetta può essere riutilizzato per lo stesso odore, ma assicuratevi di utilizzare una punta fresca per impostare la prossima odore.
   6. Ruotare l'ampia apertura del corpo della siringa verso l'alto in modo che la carta da filtro scivola rapidamente nel tubo. Inserire il limitatore nella grande apertura del corpo della siringa.
      1. Assicurarsi che ogni cartuccia odore è chiaramente etichettato con un'etichetta con codice colore del l'odore della sua prima utilizzazione per. Non usare mai una cartuccia odore (siringa o Restrictor) per più di un odore, poiché vi possono essere odore residuo su di esso.
   7. Palla la fine di un tessuto privo di lanugine, bagnare con il 70% di etanolo, e usarlo per pulire a fondo la superficie esterna della cartuccia per eliminare ogni odore residuo sulla parte esterna della cartuccia.

2 Raccolta, Trattenere, e Nutrire le api

1. Preparazione Bee Trattenere Imbracature
   1. Rendere semplici imbracature di trattenuta per le api mellifere di cannucce di plastica di soda, tubi di plastica dura, o tubi di metallo lavorato (tutto sono circa 0,9 cm di diametro interno e hanno spessore 1-2 mm). Utilizzare imbracature robusti per le procedure che comportano un intervento chirurgico.
   2. Tagliare tre centimetri sezioni del tubo. Poi, parzialmente tagliare via circa la metà dei superiori 1 cm l'imbracatura per rendere più facile tenere l'ape in posizione mentre il fissaggio del cablaggio.
   3. Tagliate una striscia di 0,2 x 6 cm di nastro adesivo e collegare una estremità ad un lato delle api cablaggio, leaVing l'altra estremità libera.
2. Raccolta Api di operaio
   1. Raccogliere i lavoratori dall'ingresso alla colonia come si fermano prima di partire dalla colonia o tornano da foraggiamento.
      NOTA: mettendo un pezzo di rete metallica, con fori abbastanza grandi per le api operaie a strisciare attraverso, sopra l'ingresso rallenta i lavoratori che ritornano verso il basso e rende più facile catturare prima che entrino la colonia.
   2. Mettere una fiala di scintillazione sopra l'ape fino a quando non vola su in esso. Tenere il flaconcino con la sua apertura orizzontale o rivolto verso il basso, mentre il coperchio è fissato così l'ape non vola fuori dal flacone. Mettere una sola ape in ogni fiala. Assicurarsi che il coperchio ha un foro in esso per consentire un adeguato scambio di gas.
   3. Raccogliere le api rapidamente per ridurre al minimo il tempo che trascorrono in fiale. Tenere i flaconcini con le api in loro in una piccola scatola in ombra.
   4. Trasferire la scatola con le fiale e le api al laboratorio, e posizionare le fiale in una sl ghiaccio-acquaUrry fino a quando le api smettere di muoversi. Una volta che un'ape è immobile, togliere il flacone dal ghiaccio immediatamente per evitare la sovraesposizione al freddo, e posizionare l'ape in una imbracatura di contenimento.
      NOTA: Si consiglia di non collocare le api nel frigorifero o nel congelatore poiché è difficile controllare quando le api diventano immobili, con conseguente eccessiva esposizione al freddo. Quando sfruttando più di 10 api, trasferire solo poche api per l'impasto di acqua e ghiaccio per volta.
3. Trattenere le Api
   1. Inserire l'ape nel cablaggio con il torace dorsale rivolta verso la porzione di taglio lontano del tubo e la testa appena sopra la parte superiore del tubo. Premere delicatamente l'ape vicino al tubo così le sue apparato boccale si estendono oltre il bordo del tubo. Far scorrere la striscia di nastro adesivo tra la testa e il torace sul lato dorsale delle api e fissare saldamente l'estremità libera verso il lato del cablaggio.
      1. Assicurarsi che il nastro sul cablaggio è liscia e tesa. Non ci dovrebbero essere notilacune ceable tra la parte anteriore del cablaggio api e il nastro, e il nastro deve aderire sulla parte superiore del cablaggio. Se ci sono lacune l'ape non può essere in grado di estendere la sua proboscide corretto, altrimenti potrebbe sfuggire. Inoltre, assicurarsi che le gambe anteriori del api non sporgano tra la parte anteriore del trapezio e del nastro adesivo.
4. Nutrire le api e l'alimentazione di condizionamento Intervallo
   1. Circa 30 minuti dopo imbrigliamento - dopo che le api hanno recuperato dalla configurazione iniziale - nutrire le api 3-4 microlitri 0,5 M di saccarosio (in acqua). Tale importo sarà sufficiente per un intervallo di alimentazione-per-condizionamento di 3-4 ore.
      1. In generale, alimentare 1 ml 0,5 M di saccarosio per circa ogni ora di tempo di attesa tra l'alimentazione e condizionamento per garantire le api sopravvivono l'intervallo sono ancora abbastanza fame all'inizio del condizionamento per essere motivati ​​a imparare l'associazione condizionato. In un laboratorio mantenuto ad una temperatura calda o se ucantare una diversa concentrazione di saccarosio, modificare l'importo alimentato o l'intervallo di tempo di conseguenza.
         NOTA: Con una alimentazione a intervallo di condizionamento di 24 ore, assicurarsi che tutte le api sono alimentati a sazietà con 0,5 o 1 M di saccarosio, almeno 24 ore prima condizionata inizierà. A temperatura ambiente, le api richiedono circa 24 ore prima di essere motivati ​​abbastanza per rispondere bene in un protocollo di condizionamento.
         NOTA: utilizzare una minore concentrazione di soluzione di saccarosio per l'alimentazione delle api rispetto alla concentrazione usata come ricompensa durante il condizionamento per evitare che le api di diventare meno sensibile alla concentrazione di saccarosio utilizzato durante condizionata, che può ridurre le prestazioni di apprendimento ^18.
      2. Alimentare le api in una zona ben lontano dalla zona di allenamento. L'esposizione allo stimolo incondizionato (saccarosio) nel contesto di condizionamento prima di condizionamento possa influenzare la successiva condizionata per l'odore.
   2. Durante l'intervallo tra alimentazione e conditioning posizionare le api sul piano di lavoro in una zona tranquilla di laboratorio al fine di evitare perturbazioni inutili. Se il laboratorio ha una bassa umidità ambientale, posizionare le api in un contenitore di plastica con tovaglioli di carta bagnati durante l'intervallo di tempo. Questo impedisce l'essiccazione, in quanto le api possono morire se sono esposti a bassa umidità per periodi di tempo prolungati.
      NOTA: Non modificare il protocollo di sfruttamento e di alimentazione all'interno di un esperimento! Utilizzare solo un intervallo di tempo specifico tra creazione e nutrire le api e l'inizio di condizionamento per ogni esperimento in modo che le api sono tutti trattati allo stesso modo.

3. condizionata

1. Test per Saccarosio Sensibilità
   1. Pochi minuti prima di iniziare condizionata, testare la motivazione delle api per nutrire toccando le antenne con una piccola goccia di 0,5 M soluzione di saccarosio (la stessa concentrazione usata durante l'allattamento). Non permettere loro di nutrirsi durante il test. Se essi rispondono EXTEnding loro proboscide, probabilmente sono sufficientemente motivati ​​ad apprendere e possono essere utilizzati per il protocollo.
2. Esperimento di design
   NOTA: Questo protocollo può essere modificato per adattarsi a una vasta gamma di protocolli di apprendimento, al fine di approfondire molti aspetti della capacità di apprendimento e memoria api al miele. Tra i molti parametri che possono essere modificati sono l': intervallo di Inter-prova, numero di api addestrate in un dato momento, intervallo inter-stimolo, il tipo e la concentrazione e il numero di odori, il tipo e la concentrazione dello stimolo incondizionato, il numero e la sequenza degli studi (figura 1; Tabella 1) ^19-21. Nel progettare il protocollo preciso per ogni prova di condizionamento, è molto importante mantenere l'intervallo inter-trial coerente tra gli individui. Un intervallo di prova, tra che è troppo corto, troppo lungo o incoerenti compromette le prestazioni delle api. Vedere la discussione per un trattamento completo di questo argomento.
   NOTA: Bees impareranno il compito più rapidamente se si trovano in un ambiente caldo. Pertanto, mantenere la temperatura dell'ambiente formazione coerente e caldo (29-30 ° C se possibile).
3. Mantenere l'odore (Condizionata Stimulus)
   1. Metodo 1
      1. Impostazione del sistema Odore di consegna
         1. Montare la plastica siringa da 20 ml caricato con la carta da filtro odori trattato quindi è stabile e l'estremità più piccola si trova ad affrontare direttamente presso le antenne dell'ape. Impostare lo stantuffo in corrispondenza del segno 15 ml e posizionare la siringa in modo che il pistone è facilmente accessibile.
      2. Presentando lo stimolo Odore
         1. All'inizio di ogni prova, posizionare l'ape nel cablaggio sul piolo nell'arena di condizionamento con le sue antenne puntate direttamente verso la cartuccia odore. Lasciate che l'ape acclimatare per l'arena per 15-25 secondi prima di iniziare lo stimolo odore di ridurre disagi causati dal brusco cambiamento nei suoi dintorni visivi durante lo stimolo odore.
            1. Se l'ape comincia a rispondere alla cartuccia odore subito dopo essere stata immessa nell'arena di condizionamento, ci può essere l'odore sulla punta della cartuccia. Rimuovere l'odore contaminare lavando la cartuccia con un panno privo di pelucchi imbevuto di etanolo al 70%. Se questo non risolve il problema, sostituire la cartuccia.
         2. Premere lo stantuffo della siringa ad un tasso costante in modo che il pistone è completamente premuto entro 4 sec. Monitorare la risposta del ape per l'odore prima di presentare lo stimolo incondizionato.
         3. Dopo ogni prova, consentono l'ape per riposare in campo di condizionamento per un altro 15-25 sec. Spostando l'ape troppo presto dopo il processo ridurrà significativamente l'efficacia di ogni prova condizionata.
   2. Metodo 2
      1. Impostazione del sistema Odore di consegna
         1. Flusso d'aria di origine e portata
            1. Come il flusso d'aria di origine per la consegna degli odoriutilizzare una pompa aeratore acquario o un banco di laboratorio di alimentazione aria in pressione, se il laboratorio è equipaggiato con esso.
               NOTA: Una pompa tipico acquario aeratore avrà un flusso d'aria nei pressi di 400 ml / min (7 ml / sec); sopra l'odore stimolo 4 sec, 28 ml di aria fluirà attraverso una cartuccia 1 ml.
            2. Utilizzare un misuratore di portata in linea con il tubo dell'apparecchio di erogazione dell'aria per regolare la velocità di flusso per l'aria di alimentazione. Regolare il flussometro fino a quando la velocità del flusso è di 400 ml / min. Controllare la portata all'apertura della cartuccia odore con un flussometro separato.
            3. Collegare il flusso d'aria alla cartuccia odore attraverso un sistema di tubazioni e valvole in plastica.
               NOTA: Il dispositivo di cronometraggio discusso sotto apre le valvole al momento opportuno nel processo. Connettori di plastica attaccano il sistema di flusso d'aria alla cartuccia odore attraverso un tipo Luer attaccamento al corpo siringa della cartuccia.
            4. Indipendentemente dalla fonte di flusso d'aria, controllare la portata periodicamente make che la linea è intatto e la portata viene mantenuta alla velocità desiderata.
      2. Automated Odore di consegna
         1. Usare un controllore logico programmabile (PLC) per automatizzare la consegna del odore.
            NOTA: Il PLC è programmato per aprire le valvole alla consegna odore flusso d'aria 6 secondi dopo l'inizio del programma (avviato premendo un pulsante), tenere le valvole aperte per 4 sec, e di emettere un segnale acustico di alimentazione, tramite un piccolo altoparlante, 3 secondi dopo l'odore stimolo esordio per segnalare lo sperimentatore di consegnare saccarosio.
         2. Utilizzare un piccolo LED per indicare la tempistica dello stimolo odore durante ogni prova. Se possibile, utilizzare un LED rosso, dal momento che i fotorecettori api vengono spostate da più [rosso] e lunghezze d'onda più corte verso [UV] lunghezze d'onda in modo che non possano vedere bene. Posizionare il LED dietro e sotto l'ape, al di fuori del loro campo visivo, in modo che la luce non diventi uno stimolo involontario condizionata.
            NOTA: Il light aiuta anche a verificare che il PLC sta funzionando correttamente ed è utile per analizzare le registrazioni video delle risposte delle api durante le prove di collaudo.
      3. Il sistema di scarico
         1. Impostare un sistema di scarico dietro l'ape per aiutare tirare l'aria passato l'ape e di evacuare l'aria carica di odori dall'arena condizionata per mantenere un discreto lasso di tempo per ogni presentazione del odore.
            NOTA: Se c'è un sistema di vuoto in laboratorio, modificare la porta del vuoto e collegare un condotto di tubi essiccatore per fornire il flusso d'aria necessario per evacuare l'arena condizionata. Se non vi è un sistema di vuoto, un piccolo ventilatore elettrico alloggiato in linea con il tubo essiccatore portato ad una cappa aspirante o attraverso una finestra sarà sufficiente.
      4. All'inizio di ogni giornata, verificare i collegamenti elettrici e dell'aria del sistema di erogazione odore e il sistema di scarico. Premere il pulsante di avvio del sistema di consegna odore e tenere traccia del tempo che intercorre tra la pressione delpulsante e quando le valvole aperte (una tranquilla click e la luce LED si accende) e quando lo spunto per presentare lo stimolo incondizionato (un segnale acustico) suoni. Controllare l'erogazione dell'aria inserendo un dito umido davanti del connettore che verrà attaccato alla cartuccia odore. Ci dovrebbe essere un forte flusso d'aria solo quando le valvole sono aperte. Controllare il sistema di scarico per possesso di un tessuto privo di lanugine fino all'apertura del sistema di scarico per assicurarsi che il flusso d'aria è abbastanza forte per evacuare correttamente l'aria dall'arena condizionata.
   3. Montaggio della cartuccia Odore
      1. Mettere un po 'di plastilina o sul piano di lavoro o su un piccolo plexiglas stand per posizionare la cartuccia ape e l'odore direttamente di fronte al sistema di scarico. Posizionare la siringa odore di vetro nella creta e regolare così l'apertura l'estremità larga è puntato alla testa dell'ape. La fine della siringa deve essere di 1-2 cm dalla ape. Scegli una distanza all'interno di questa gamma e di essere costante.
      2. Posizionare saldamente il raccordo che collega la cartuccia al tubo dell'aria e sistema di valvole sopra la stretta fine vetro smerigliato della siringa.
   4. Presentando lo stimolo Odore
      1. All'inizio di ogni prova, posizionare l'ape imbrigliato sul piolo nell'arena di condizionamento con le sue antenne puntate direttamente verso la cartuccia odore. Lasciare riposare ape in campo per 15-25 secondi prima di iniziare lo stimolo odore per permettergli di abituarsi al nuovo ambiente.
         NOTA: Se l'ape comincia a rispondere alla cartuccia odore subito dopo essere stati posti in campo di condizionamento, ci può essere l'odore sulla punta della cartuccia. Rimuovere l'odore contaminare lavando la cartuccia con un panno privo di pelucchi imbevuto di etanolo al 70%. Se questo non risolve il problema, sostituire la cartuccia.
      2. Premere il pulsante di avvio per avviare il meccanismo di temporizzazione per la consegna odore. Monitorare la risposta del ape per l'odore dopo stimoloinsorgenza e prima della presentazione dello stimolo incondizionato.
      3. Dopo ogni prova, consentono l'ape per riposare in campo di condizionamento per un altro 15-25 secondi per consentire la formazione della memoria iniziale. Spostando l'ape troppo presto dopo il processo ridurrà significativamente l'efficacia di ogni prova condizionata.
4. Consegnare il saccarosio (Incondizionato Stimulus)
   1. Metodo 1
      1. Per questo metodo, utilizzare uno stuzzicadenti per consegnare il saccarosio.
         NOTA: Si consiglia di utilizzare uno stuzzicadenti di plastica in quanto gli stuzzicadenti di legno possono avere un odore che influenzerà le risposte delle api allo stimolo condizionato.
      2. Immergere la punta dello stuzzicadenti nella soluzione di saccarosio, e, quando è il momento di presentare il stimolo incondizionato, tenere lo stuzzicadenti fronte delle api e consentire l'ape a leccare il saccarosio dalla stuzzicadenti per circa 1 sec.
      3. Sostituire lo stuzzicadenti regolarmente per evitare l'accumulo di suCrose.
   2. Metodo 2
      1. Saccarosio Delivery System
         NOTA: Un modo più accurato per fornire lo stimolo incondizionato è attraverso l'uso di siringhe micrometriche, che può fornire con precisione piccole quantità (decimi di microlitro) della ricompensa saccarosio.
         1. Avvolgere il micrometro della siringa all'indietro il più possibile. Caricare la siringa micrometrica con la soluzione di saccarosio. Assicurarsi che non vi siano bolle nella parte in vetro e montare la siringa. Riempire il mozzo dell'ago con la soluzione di saccarosio prima dell'immissione sul l'estremità più stretta del corpo della siringa. Per assicurarsi che il liquido nel ago è in realtà saccarosio e non l'acqua dal lavaggio dell'ago, avvolgere il micrometro avanti 1-2 microlitri prima di iniziare l'esperimento.
   3. Presentazione Saccarosio
      1. Tenere la punta dell'ago circa 2 cm dalla ape mentre l'odore è presentato. Utilizzare il bordo dell'arena formazione per prevenirescuotendo la siringa come il movimento può distrarre l'ape. Non ottenere l'ago troppo vicino in attesa del segnale di alimentazione, dal momento che sarà anche prematuramente spostare l'attenzione delle api dall'odore al saccarosio.
      2. Non appena il segnale acustico di alimentazione, toccare leggermente le antenne fino a quando l'ape estende la sua proboscide, poi nutrire l'ape. Questo dovrebbe richiedere solo un tocco molto leggero o due per le antenne.
         1. Utilizzare una quantità terzi tra 0,2 e 0,8 microlitri. L'ape dovrebbe facilmente consumare l'intera goccia entro il periodo di tempo assegnato per lo stimolo incondizionato (~ 1-2 sec). Non usare "ad libitum" alimentazione da una grande goccia, che l'ape si nutre per alcuni secondi, ma non può interamente consumare.
         2. Guarda per saccarosio costruire l'antenna, che ridurrà la risposta delle api alle successive presentazioni del premio. Modificare la procedura di alimentazione se questo si verifica.
         3. Per assicurare l'accoppiamento preciso dell'odorecue e la ricompensa di saccarosio, assicurarsi di presentare la goccia di soluzione di saccarosio per l'ape non appena possibile dopo il segnale acustico.
            NOTA: Timing tra l'inizio del CS (odore) e Stati Uniti (saccarosio) è critica. Idealmente, la presentazione odore e la presentazione di saccarosio dovrebbero brevemente sovrapporsi. Se più di un paio di secondi trascorsi tra la fine del CS e la consegna degli Stati Uniti, prestazioni condizionata diminuirà.

4 Test

1. A seguito di uso condizionata prove di laboratorio, non rinforzate per valutare quanto bene le api hanno imparato e / o ricordare l'associazione condizionato.
   NOTA: Vedere la discussione per una spiegazione dettagliata della importanza di analizzare 'risposte a prove di laboratorio, non rinforzate, oltre alle api le api prestazioni nelle prove di condizionamento e una spiegazione dello scopo del numero di prove di laboratorio e odori di prova.
2. Consolidamento Tempo
   1. Seguitocondizionata, o amministrare un giudizio immediato prova o consentire le api di riposare in un periodo di consolidamento.
      NOTA: La lunghezza del periodo di consolidamento, l'intervallo di tempo tra condizionamento e le prove, dipenderà l'obiettivo dell'esperimento. Se lo scopo è quello di indagare le differenze di apprendimento o memoria a breve termine, le prestazioni delle api su prove di laboratorio può essere valutata immediatamente dopo o più ore dopo il condizionamento. Se l'esperimento comporta indagare memoria a lungo termine, le prove di laboratorio devono essere somministrati almeno 24 ore dopo la fine del condizionamento.
   2. Se le prove di laboratorio, sono più di 24 ore dopo condizionata, nutrire le api a sazietà con 0,5 M di saccarosio seguente condizionata e almeno una volta al giorno dopo fino a 12-24 ore prima che le prove di laboratorio.
      1. Per assicurarsi che le api hanno raggiunto sazietà, alimentano ognuno di loro diverse volte diversi fino a quando non si estendono più i loro proboscide in risposta al contatto con la loro antennaE con saccarosio. Essi possono consumare fino a 40 microlitri per raggiungere sazietà.
   3. Mantenere le api in un contenitore umidificato per impedire la loro essiccare e morire durante il periodo di consolidamento.
3. Prove di prova
   1. Utilizzare cartucce odore solo di recente preparati per il test.
      NOTA: Le cartucce utilizzate per l'acquisizione può essere differenziato esaurito, così lo stimolo test non sarà coerente in tutti gli studi, gli odori, e le singole api e, di conseguenza, potrebbe influenzare in modo significativo la consistenza e la robustezza dei risultati.
   2. Durante il test, mantenere lo stesso intervallo tra tentativi ed altri parametri usati nella fase di condizionamento dell'esperimento.
   3. Non presentare il stimolo incondizionato durante prove di laboratorio, dal momento che la presenza di una ricompensa alterare la risposta delle api allo stimolo condizionato, potenzialmente mascherare gli effetti più sottili del protocollo di condizionamento o di un trattamento.
   4. Video registrazione di tutti of le prove di laboratorio, per essere in grado di misurare dopo molteplici aspetti risposte delle api per l'odore (s).

5. Registrazione Risposte delle api

1. Binary (presenza / assenza) Punteggio di PER
   1. Utilizzare un sistema di punteggio binario di PER durante le prove di condizionamento e durante le prove di collaudo. Punteggio risposte come positivo o negativo; questo è soddisfacente per molti tipi di analisi con un campione di 20-40 api per gruppo di trattamento. La topologia precisa delle risposte può essere complessa ^22. E 'importante stabilire un facile da vedere e segnare criterio per una risposta positiva.
      1. Punteggio ottenuto risposta di un ape come positivo (+) quando l'ape estende la sua proboscide oltre la linea realizzata collegando le punte delle mandibole aperte. Segnare una risposta positiva Solo quando l'ape estende la sua proboscide dopo odore di esordio, ma prima di offset odore.
      2. Punteggio ottenuto risposta di un ape come negativo (-) quando non c'è extension della proboscide durante il processo o se la proboscide è estesa dopo l'offset della odorizzante.
      3. Evitare di cercare di segnare risposte parziali. Per fare delle distinzioni più sottili nel comportamento delle api, utilizzare la tecnica di video analisi descritto di seguito.
2. Analisi Video di ulteriori misurazioni per (Film 1)
   1. Raccogliere informazioni aggiuntive da test comportamentali, analizzando i video delle risposte di un ape a un odore.
      NOTA: Queste misure possono anche fornire una risoluzione temporale maggiore per l'esame delle risposte delle api agli odori, in particolare quando non vi è una differenza nel punteggio presenza / assenza di PER tra i gruppi di trattamento.
   2. Registrazione di video
      1. Utilizzare sempre dei test o prove di estinzione non armato per le registrazioni video. La presenza del premio altererà risposta delle api per l'odore, modificando la durata di estensione proboscide.
      2. Impostare una videocamera su un treppiede sopra l'arena di formazione e mettere a fuoco la fotocamera sul lato anteriore della testa di ape, così le antenne e proboscide sono a fuoco.
      3. Posizionare la piccola luce LED, che indica la presentazione dello stimolo odore, in una zona dietro l'ape che è visibile nel video, al fine di utilizzarlo per identificare l'odore insorgenza e offset durante l'analisi.
      4. Iniziare a registrare 20 sec prima dell'inizio odore e continuare la registrazione per almeno 20 secondi dopo aver compensato l'odore prima di disturbare l'ape.
   3. Analisi Video
      1. Caricare i video in software di editing video, come iMovie o Final Cut Pro, con la capacità di misurare intervalli di tempo tra i fotogrammi specifici nel video.
      2. Analizzare la risposta delle api per l'odore per un periodo di tempo discreto che inizia al momento della comparsa dello stimolo odore (per esempio, 10 o 20 secondi).
      3. Utilizzare le seguenti misure comuni per la valutazione PER:
         1. Misurare ildurata di estensione proboscide, che è il tempo totale che la proboscide estende oltre la linea mandibola-a-mandibola (descritto sopra).
            NOTA: Un ape può estendere e ritrarre la sua proboscide più volte durante la finestra di tempo di 10-20 sec. Misurare ogni estensione proboscide individualmente, e calcolare la durata totale. Analizzando il numero e la durata di ogni estensione proboscide individuo può anche fornire informazioni preziose.
         2. Misurare la latenza di estensione proboscide, che è il tempo che intercorre tra odore esordio, quando la luce LED si accende, e la prima estensione proboscide.
         3. Conte e le estensioni di tempo Glossal relativi alla comparsa di odorizzante, la prima estensione, o di altri parametri di temporizzazione.
         4. Traccia movimenti antenne ^23, che mostrano anche i cambiamenti caratteristici odori-oriented.
            NOTA: In Movie 1, i movimenti delle antenne sono stati monitorati con il software di monitoraggio di video per illustrare il cambiamento nei movimenti delle antenne in risposta ad uno stimolo odore.

Presentiamo due esempi di utilizzo dei protocolli PER sopra descritti. Il primo esempio fatto uso del metodo 2 di studiare come le api il miele percepiscono odori diversi in funzione della somiglianza molecolare per l'odore utilizzato come CS 5,24,25. Il secondo è un esempio di utilizzo del metodo 1 e alcune delle precauzioni che devono essere prese quando si inizia ad usare PER condizionata esperimenti nel laboratorio di ricerca.

Studi come questo sono stati utilizzati per descrivere la olfattiva 'spazio percettivo' di api e falene in combinazione con Bioimmagini 13 o elettrofisiologico analisi 26. Le api da miele (n = 20) sono stati condizionati ad associare l'odorizzante decanale con rinforzo saccarosio oltre 12 avanti l'associazione di condizionamento prove (Figura 3a). Circa il 10% delle api mellifere risposto 'spontaneamente' il primo processo, che è normale. Dopo che la percentuale che responded aumentare nel corso dei prossimi studi fino al 100% delle api mellifere risposto alla quinta prova e ogni prova successiva. Diversi studi hanno dimostrato che questo aumento di risposta è specifico alla condizione in avanti accoppiamento (figura 1) rispetto a diversi importanti procedure di controllo 3. Dopo la fase di acquisizione, ogni ape è stato sottoposto ad una serie di prove di laboratorio, non rinforzate (Figura 3B) che comporta l'esposizione al odore CS e diversi altri odoranti che sistematicamente diversi dalla CS in strutture molecolari. Le api da miele hanno risposto maggiormente al CS. Le loro risposte agli altri odoranti diminuite in funzione dei cambiamenti sistematici nella struttura, con le risposte più bassi ai odoranti meno come il CS.

Nella Figura 4, i risultati di un recente workshop in cui gli studenti hanno imparato, per la prima volta, come per condizionare le api mellifere utilizzando il metodo 1 sono illustrati. Studenti abeti t condizionato api da miele di avanti accoppiamento methycyclohexanone (MCH) o ottanolo (OCT) con rinforzo saccarosio (Figura 4A). Risposte per cento sono stati inferiori al primo processo e sono aumentati in prove successive, indicando che le api hanno imparato l'associazione odore-saccarosio. Ci sono state differenze nel grado che le api hanno imparato l'associazione condizionata tra i diversi gruppi di studenti. Nella nostra esperienza, questi tipi di differenze potrebbero essere dovute al odore che è stato utilizzato come CS, agli elementi imprecisi nel metodo (metodo 1), o al livello di formazione degli sperimentatori. Nel terzo caso, la prestazione diventa rapidamente più coerente con maggiore esperienza degli sperimentatori. Dopo il condizionamento, ogni ape è stato testato due volte con ogni odore. In gruppi di api che erano stati condizionati con abbinamento avanti di PTOM o MCH, la risposta è stata, come previsto, più forte l'odore condizionato (Figura 4B).

ent "> Il secondo gruppo di api mellifere che hanno subito in avanti accoppiamento di ottobre è stata condizionata in parallelo ad un altro gruppo in cui l'odore ottobre è stata all'indietro accoppiato con saccarosio. abbinamento a ritroso è uno dei diversi tipi di procedure di controllo per dimostrare che l'aumento della risposta è specifico per inoltrare l'accoppiamento e non a causa di un altro processo, come ad esempio l'eccitazione non specifico da sensibilizzazione. Per accoppiamento all'indietro, il saccarosio Stati Uniti e l'odore CS sono presentati in ordine inverso di ciò che viene mostrato in Figura 1. Acquisizione Dati da accoppiamento indietro siamo non mostrato perché la CR non può essere segnata data la presentazione dell'odore CS dopo la presentazione del saccarosio. come sarebbe previsto per il condizionamento associativo, i livelli di risposta a ottobre erano più alti nel gruppo in avanti accoppiato rispetto al gruppo all'indietro (Figura 4C).

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Figura 1: Schemi di disegno sperimentale per il condizionamento utilizzando avanti accoppiamento. Vedere la Tabella 1 per le definizioni dei termini utilizzati in questa figura. (A) Il CS (odore) precede e si sovrappone con gli Stati Uniti (soluzione di acqua / saccarosio). Il rapporto tra il CS e US mostrato è ottimale per le api da miele condizionata e falene. Ma l'ottimale ISI può dipendere dal protocollo di condizionamento e specie animale 1. (B) Ripartizione e relativa tempistica di CS, CR, Stati Uniti, e UR. Il CR che si verifica sia prima presentazione degli Stati Uniti o nel corso degli studi non armato "test" è la misura dipendente per protocolli sperimentali.

Figura 2 Odore esaurimento con il riutilizzo di cartucce. Per questi dati, cartucce odore eranoset-up con esanolo come descritto nel testo. Esanolo è comunemente usato come un CS in studi PER; Tuttavia, il tasso effettivo di esaurimento dipenderà l'odore e solvente. Le cartucce sono stati poi utilizzati una volta per 4 secondi ogni minuto su 8 prove (supponendo 5 api mellifere / processo in un esperimento standard che sarebbe pari a 40 usi). Le diluizioni che il solvente indicato, che erano relativamente standard per gli esperimenti PER, erano 2,0 M (A) e 0,2 M (B). (A, B) L'odore è stata campionata dopo la prima e l'ottava prove di adsorbimento su una fase solida microestrazione (SPME) fibra che è stato poi desorbito su un gascromatografo. Le relative aree sotto i picchi erano più alti dopo il primo processo relativo alla ottava per entrambi i solventi e per entrambe le concentrazioni (Wilcoxon abbinato coppie firmato rank test p <0.05 [*] o maggiore), il che dimostra che meno l'odore è stato consegnato dalla cartuccia dopo che la cartuccia è stata utilizzata più volte. (C, D) Gli stessi dati mostrano solo l'ottavo tr IAL con l'asse y espanso. Essa mostra che la deplezione era leggermente maggiore per esano rispetto all'olio minerale, ma solo alla concentrazione più bassa.

Figura 3 Acquisizione e test utilizzando decanale come il CS e il metodo 2 di condizionamento. (A) Trial-by-trial di risposta (CR) su 12 prove di abbinamento a termine (Figura 1). I dati sono da api n = 20 miele condizionata in quattro gruppi di 5 api mellifere ciascuno. L'ISI è stato di 3 secondi e l'ITI era 6 min. (B) prove non rinforzate con odori diversi da decanale per lunghezza e / o la posizione del carbonio carbonilico catena di carbonio. Gli odori sono stati presentati in una serie randomizzato tra i quattro gruppi e sono stati intervallati da prove rinforzati con Decanal (ogni due o tre prove), al fine di evitare l'estinzione del CR.

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Figura 4. dati provenienti da un workshop durante il quale studenti universitari sono stati addestrati a condizionare le api mellifere utilizzando PER metodo 1. dati (A) Acquisizione da tre gruppi di api da miele condizionati per ottanolo (n = 23 e 15 per Gps 1 e 2, rispettivamente) e metilcicloesanone (n = 10) (B) CR durante le prove non rinforzate con entrambi gli odori.; quattro studi presentati in serie casuale di tutti i gruppi. (C) prove non rinforzate con entrambi gli odori in due gruppi di api da miele, uno in avanti accoppiato (Gp 1, n = 23) e uno indietro accoppiati (n = 25).

Term (sigla)	Definizione	Esempio Rilevante
Stimolo condizionato (CS)	Lastimolo che suscita poca o nessuna risposta in un primo momento e segnala Uniti	ODOR
Risposta condizionata (CR) un	La risposta al CS dopo associazione con gli Stati Uniti	Proboscide ESTENSIONE
Stimolo incondizionato (US)	Uno stimolo biologicamente significativo che suscita una risposta	Saccarosio / SOLUZIONE ACQUA
Risposta incondizionata (UR) un	La risposta alla US	Proboscide ESTENSIONE
Inter-Stimulus Interval (ISI)	Il tempo tra l'inizio della SC e insorgenza degli Stati Uniti	ODORE di intervallo saccarosio
Inter-Trial Interval (ITI)	Il tempo tra successivi abbinamenti CS-USA per un singolo animale	ODORE (prova n) ODORE (prova n + 1) Intervallo

Tabella 1 Importante Terminologia. Fare riferimento alla Figura 1 per un esempio di questi termini. Per un PER di condizionamento del CR e UR sono gli stessi, anche se per altri tipi di associazioni e riflessi del CR e UR possono differire.

Movie 1. Un video di un miele delle api PER esecuzione dopo che era stato condizionato a rispondere a un odore. Nota la risposta PER dell'ape circa 1,5 sec seguente odore insorgenza. Software di monitoraggio mappato i movimenti delle antenne in risposta alla presentazione del odore. Le linee tracciate in alto a destra del video raffigurano i movimenti delle antenne reali. I due grafici in basso dello schermo mostrano movimenti delle antenne sulla X (a sinistra) e Y (destra) coordinate. Le linee verticali nel grafico mostrato nel video indicano, da sinistra a destra, la luce ON, PER, luce fuori e proboscide retrazione.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.