Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l'imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.
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Articolo metodologico
L'analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di
In questo articolo
Sommario
Abstract
Drosophila melanogaster è un sistema potente modello che è stato ampiamente utilizzato per chiarire una varietà di processi biologici. Ad esempio, gli studi sia del femminile e linee germinali maschili di Drosophila hanno contribuito notevolmente alla comprensione corrente della meiosi e biologia delle cellule staminali. Protocolli eccellenti sono disponibili in letteratura per l'isolamento e l'imaging di Drosophila ovaie e testicoli 3-12. Qui, metodi per la dissezione e la preparazione dei testicoli Drosophila per l'analisi microscopica sono descritti con un video dimostrativo accompagnamento. Un protocollo per isolare testicoli dall'addome dei maschi adulti e preparare vetrini di tessuto reale per l'analisi al microscopio a contrasto di fase e un protocollo per il fissaggio e immunocolorazione testicoli per l'analisi al microscopio a fluorescenza sono rappresentati. Queste tecniche possono essere applicate nella caratterizzazione di mutanti di Drosophila che esibiscono defects nella spermatogenesi e nella visualizzazione delle localizzazioni subcellulari di proteine.
Introduzione
Testicoli Drosophila sono un sistema modello ideale per lo studio di molti processi biologici che comprendono la regolazione delle cellule staminali, meiosi e sviluppo dello sperma 13-18. Gli spermatociti ed i loro fusi meiotiche sono grandi e quindi conveniente per l'analisi citologica e rilassato checkpoint del ciclo cellulare durante la spermatogenesi facilitano lo studio delle mutazioni nei geni del ciclo cellulare. Diversi tipi di cellule possono essere osservati in progressione ordinata lungo la lunghezza dei testicoli, e qualsiasi problema nella spermatogenesi può portare a cambiamenti in questa disposizione complessiva. Queste caratter....
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Protocollo
1. Testicoli Dissection
- Anestetizzare mosche in una bottiglia o flacone utilizzando un flusso di CO 2 e trasferire ad un pad mosca.
- In ordine mosche sotto un microscopio da dissezione utilizzando un pennello piccolo, e raccogliere un numero appropriato (seconda dell'esperimento) di maschi di Drosophila dei genotipi desiderati. I maschi giovani (0-2 giorni) sono l'ideale per l'esame delle cellule durante i primi stadi della spermatogenesi (ad esempio spermatogoni, spermatociti e spermatidi precoci post-meiotiche), mentre i maschi leggermente più anziani (2-5 giorni) sono l'ideale per l'esame di cell....
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Risultati
Un esempio di una coppia correttamente sezionato di organi riproduttivi maschili Drosophila è mostrato in Figura 2A. Testicoli rimossi dall'addome della mosca maschio adulto sono tipicamente collegati al condotto eiaculatorio (marrone, Figura 2A ') ed una coppia di ghiandole accessorie (verde, Figura 2A') tramite una coppia di vescicole seminali (blu, Figura 2A ') . Per separare i testicoli dalla maggior parte del tessuto somati.......
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Discussione
Anche se i testicoli di wild-type mosche possono essere facilmente identificati grazie al loro colore giallo (in contrasto con i tessuti bianchi vicini), i testicoli di mosche mutanti bianchi sono bianchi e quindi può occasionalmente essere confusi con l'intestino. Ceppi più transgenici, tipicamente in uno sfondo bianco, hanno anche testicoli bianchi perché il mini-bianco gene trovato P-elementi non promuove l'accumulo di pigmento nei testicoli. Quando testicoli Drosophila.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Michael Anderson per stabilire in laboratorio Lee questi metodi accettati per lo studio della spermatogenesi con la consulenza di esperti da Karen Hales. H. Oda e Y. Akiyama-Oda generosamente fornito la γ-tubulina-GFP volare stock. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione NIH R01 al LAL (GM074044).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Elastomero siliconico in due parti per la realizzazione di piastre di dissezione rivestite in silicone da Kimax Petri |
| Penna PAP | Fisher Scientific NC9888126 | Ted Pella #22309 | |
| Protettore per unghie trasparente | Wet n Wild | 7780235001 | |
| Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Anticorpo anti-gamma-tubulina di topo (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniIgG anti-topo di capra pura | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Etanolo | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldeide | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Utilizzare secondo le indicazioni del produttore per siliconare i vetrini coprioggetti |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0,5 mg/ml in etanolo al 75%; conservare a -20 ° C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Tergicristalli delicati Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | |
| Barattolo per colorazione in vetro Coplin | Microscopia elettronica Scienze | 70315 | |
| Vetrini per microscopio smerigliati singoli | Corning | 2948-75X25 | |
| Vetrini per microscopio rivestiti in poli-L-lisina Polysciences | , Inc. | 22247-1 | Opzionale (per sostituire i vetrini da microscopio non trattati) |
| Vetro di copertura quadrato | Corning | 2865-22 | |
| Lamette da barba | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Petri | Dish Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 Pinza EMD |
| Dumont | 52100-51S | Modello 5 INOX | |
| Stereoscopio | Stemi 2000-CSObiettivo Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40X | Nikon | ||
| Axiophot | Obiettivo Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40X | Carl Zeiss |
Riferimenti
- McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Bonacc....
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Ristampe e permessi
