Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Sommario

Alcune perturbazioni genetiche o l'esposizione a tossine possono interrompere i normali processi di sviluppo portando alla morte di specifici tipi di cellule. L'analisi della caspasi 3 attivata mediante immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni di zebrafish rivela la localizzazione specifica dello stadio e del tessuto di cellule specificamente sottoposte ad apoptosi.

Abstract

L'immunofluorescenza a montaggio intero per rilevare la Caspasi 3 attivata (saggio Casp3) è utile per identificare le cellule sottoposte ad apoptosi intrinseca o estrinseca negli embrioni di zebrafish. L'analisi dell'intera montatura fornisce informazioni spaziali per quanto riguarda la specificità tissutale delle cellule apoptosanti, sebbene il sezionamento e/o la comarcatura siano in ultima analisi necessari per individuare i tipi di cellule esatte in fase di apoptosi. Il test Casp3 a montaggio intero è ottimizzato per l'analisi di embrioni fissati tra lo stadio di 4 cellule e 32 ore dopo la fecondazione ed è utile per una serie di applicazioni, tra cui l'analisi di mutanti e mormoranti di zebrafish, la sovraespressione di mRNA mutanti e wild-type e l'esposizione a sostanze chimiche. Rispetto alla colorazione con arancia acridina, che può identificare le cellule apoptotiche negli embrioni vivi nel giro di poche ore, i saggi Casp3 e TUNEL richiedono molto più tempo per essere completati (2-4 giorni). Tuttavia, a causa della natura dinamica della formazione e della clearance delle cellule apoptotiche, l'analisi degli embrioni fissati garantisce un confronto accurato delle cellule apoptotiche su più campioni in momenti specifici. Abbiamo anche riscontrato che il test Casp3 è superiore all'analisi delle cellule apoptotiche con il test TUNEL a montaggio intero per quanto riguarda il costo e l'affidabilità. Nel complesso, il test Casp3 rappresenta un test robusto e altamente riproducibile in cui analizzare le cellule apoptotiche nei primi embrioni di zebrafish.

Introduzione

Qui descriviamo come eseguire l'immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni precoci di zebrafish per rilevare cellule con Caspasi 3 attivata (di seguito indicato come saggio Casp3). L'obiettivo generale di questo metodo è identificare l'abbondanza relativa e la posizione delle cellule apoptotiche nel pesce zebra dallo stadio di 4 cellule a 32 ore dopo la fecondazione (hpf).

Sia le vie apoptotiche intrinseche (mediate dai mitocondri) che estrinseche (mediate dai recettori di morte) mediano la morte cellulare attraverso l'attivazione della cascata delle caspasi^1-2. Le caspasi iniziatrici esistono normalmente come monomeri all'interno della cellula e, una volta reclutate su piattaforme specifiche per percorso in risposta a un segnale pro-apoptotico, diventano dimeri attivati. Le caspasi iniziatrici attivate (Caspasi 9; via intrinseca e Caspasi 8; via estrinseca) prendono quindi di mira le caspasi effettrici predimerizzate e inattive (Caspasi 3, 6, 7) per la scissione per formare eterotetrameri attivi. Le caspasi effettrici attive scindono quindi i bersagli cellulari con specifici residui di tetrapeptidi per avviare la specifica distruzione proteolitica che culmina nei segni ultrastrutturali dell'apoptosi, come la condensazione della cromatina e il blebbing della membrana, e nei segnali della superficie cellulare che mediano l'impacchettamento della cellula per l'inghiottimento da parte dei fagociti in modo immunosilente. Nelle cellule di mammifero, si ritiene che le caspasi effettrici attive svolgano la maggior parte degli eventi di scissione cellulare che mediano l'apoptosi attraverso le vie intrinseche ed estrinseche^1-2. Il protocollo qui descritto utilizza un anticorpo che lega specificamente la forma eterotetramerica scissa della caspasi 3, ma non la caspasi 3 dimero inattiva.

Uno dei vantaggi del test Casp3 è la capacità di visualizzare la distribuzione spaziale delle cellule apoptotiche nel contesto dell'intero embrione. Pertanto, i tessuti di interesse possono essere esaminati per la presenza di cellule apoptotiche e, se esistono anticorpi o ceppi transgenici fluorescenti che marcano specifici tipi di cellule, allora è possibile individuare l'esatta identità delle cellule sottoposte ad apoptosi attraverso esperimenti di colabeling. Diversi gruppi hanno utilizzato con successo la caspasi 3 attivata come marcatore per l'apoptosi negli embrioni di zebrafish (ad es. ^3-7). Ulteriori tecniche di montaggio completo per identificare le cellule apoptotiche negli embrioni di zebrafish includono il saggio TUNEL⁸ e la colorazione arancione acridina (AO)⁹. Abbiamo utilizzato tutti e tre i metodi per identificare le cellule apoptotiche negli embrioni di zebrafish^4,6,10.

La colorazione TUNEL (Terminal deoxynucleotitidil transferase dUTP nick end labeling) sfrutta l'enzima deossinucleotidiltransferasi terminale (TdT) che viene utilizzato per aggiungere nucleotidi alle estremità 3' ossidriliche del DNA durante la ricombinazione VDJ nei linfociti¹¹. TdT aggiunge dUTP-biotina ai gruppi ossidrilici 3' liberi nel DNA, che sono abbondanti principalmente nelle cellule apoptotiche. I tessuti vengono quindi esposti all'avidina-perossidasi e le cellule apoptotiche vengono colorate con l'aggiunta del substrato 3-ammino-9-etilcarbazolo. Il test TUNEL è stato utilizzato per eseguire un'analisi approfondita delle cellule apoptotiche durante lo sviluppo embrionale in tessuti di pesce zebra wild-type¹². Simile al test Casp3, il test TUNEL viene eseguito solo su embrioni fissati. Abbiamo riscontrato che il test Casp3 è più coerente e meno costoso del test TUNEL.

La colorazione AO è stata descritta per la prima volta come un meccanismo per identificare specificamente le cellule apoptotiche in Drosophila¹³. L'AO colora sia il citoplasma che il nucleo delle cellule apoptotiche, ma non necrotiche. L'AO è ben noto per legare gli acidi nucleici¹⁴, e si pensa che questo spieghi la colorazione nucleare. Tuttavia, l'AO non colora la cromatina delle cellule vive; piuttosto, sembra che cambiamenti specifici che si verificano durante l'apoptosi permettano l'intercalazione e la colorazione dei nuclei apoptotici condensati¹⁵. La colorazione AO ha il vantaggio di una rapida analisi apoptotica di embrioni vivi. Tuttavia, la documentazione dei campioni deve essere eseguita rapidamente a causa della natura dinamica della formazione e della clearance delle cellule apoptotiche. D'altra parte, la fissazione simultanea di tutti i campioni fornisce un'istantanea dell'apoptosi in un dato momento su tutti i campioni e non è soggetta a questa variabile temporale. Pertanto, poiché l'analisi delle cellule apoptotiche mediante colorazione AO non è compatibile con gli embrioni fissati, il test Casp3 è preferibile per gli esperimenti in cui è richiesta la documentazione fotografica e/o la quantificazione su più campioni.

Protocollo

1. Preparazione delle Soluzioni

1. Preparare 500 ml di 1x PBST (1x PBS, 0,1% Tween-20) e sterilizzare con filtro. 1x PBST può essere conservato a temperatura ambiente (RT) a tempo indeterminato, purché non vi siano segni di crescita batterica.
2. ATTENZIONE: Preparare 50 ml di paraformaldeide (PFA) al 4% in una cappa chimica sciogliendo il PFA in polvere in 1x PBS a 60 °C per 1 ora e coprendo con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Conservare a 4 °C per 1 mese o a -20 °C per 2 anni.
3. Preparare 500 ml di 1x PDT fresco (1x PBST, 0,3% Triton-X, 1% DMSO). 1x PDT può essere conservato a 4 °C per un massimo di un mese.
4. Preparare 50 ml di tampone bloccante (1x PBST, 10% siero fetale bovino inattivato termicamente, 2% albumina sierica bovina). Creare aliquote da 10 ml e conservare a -20 °C per un massimo di 1 anno. Una volta scongelato, il tampone di blocco può essere conservato a 4 °C per un massimo di 48 ore.
5. Preparare 100 ml di metilcellulosa al 4% riscaldando 30 ml di acqua a 80 °C. Aggiungere 4 g di metilcellulosa all'acqua calda e mescolare con una barra di agitazione su una piastra di cottura a temperatura ambiente. Una miscelazione accurata richiede solitamente da 4 ore a tutta la notte. Aggiungere il resto dell'acqua (non riscaldata) e mescolare a 4 °C per 1 ora. Negozio presso RT.
6. Se si utilizzano embrioni tra lo stadio di tailbud e 32 hpf, preparare 50 ml di 10 mg/ml di pronasi e conservare per un massimo di 1 settimana a 4 °C. In caso contrario, conservare in aliquote da 10 ml a -20 °C per un massimo di 1 anno.
7. Porre 50 ml di metanolo al 100% a -20 °C.
8. Preparare 60 volte l'acqua all'uovo sciogliendo 280 g di sale marino istantaneo dell'oceano in 2 litri di acqua distillata (come in Westerfield¹⁶). Preparare 1x acqua d'uovo diluendo il brodo 60x in acqua deionizzata.

2. Preparazione degli embrioni

1. Raccogli gli embrioni di pesce zebra in una capsula di Petri in 1x acqua d'uovo tra lo stadio a 4 celle e 32 hpf.
   1. Per gli embrioni tra lo stadio a 4 cellule e quello di tailbud, procedere al passaggio 2.2.
   2. Per gli embrioni tra lo stadio di tailbud e 32 hpf, rimuovere i corioni aggiungendo 100 μl di 10 mg/ml di pronasi agli embrioni in 10 ml di 1x acqua d'uovo.
   3. Nota: l'attività della pronasi può variare tra i lotti. Pertanto, la concentrazione finale di pronasi dovrebbe essere ottimizzata per la decorionazione quando si ottengono nuovi lotti.
      1. Lasciare incubare a temperatura ambiente per 30 min.
      2. Versare l'acqua d'uovo / la soluzione di pronasi nei rifiuti e aggiungere lentamente 1 volta l'acqua fresca all'uovo.
      3. Risciacquare 2 volte versando l'acqua d'uovo esistente (e i corions fluttuanti) e aggiungere delicatamente nuova acqua d'uovo.
      4. Nota: la maggior parte dei corioni dovrebbe essere rimossa a questo punto. Con una pipetta di trasferimento, aspirare delicatamente gli embrioni su e giù fino a rimuovere i corioni rimanenti.
2. Trasferire fino a 40 embrioni in una provetta da 1,5 ml. Risciacquare 2 volte con 1 ml di 1x PBST.  
3. Rimuovere la PBST, lasciando il liquido appena sopra gli embrioni (circa 100 μl di volume dovrebbero rimanere nella provetta). Aggiungere 1 ml di PFA al 4%. Appoggiare le provette su un lato (in modo che gli embrioni si disfondano lungo la lunghezza della provetta) in un contenitore di dimensioni adeguate per facilitarne il trasporto (ad es. una capsula di Petri o una pipetta) e posizionarle su un dondolo delicato a 4 °C durante la notte o fino a una settimana.  
   1. Per gli embrioni tra lo stadio a 4 cellule e quello di tailbud, deteroionare manualmente gli embrioni fissati con una pinza.

3. Procedura di immunofluorescenza

1. Posizionare le provette in un rack per provette in modo che tutti gli embrioni affondino sul fondo della provetta. Rimuovere il PFA (nell'apposito contenitore per i rifiuti) lasciando il liquido appena sopra il livello degli embrioni. Dopo la fissazione (fase 2.3), gli embrioni non devono mai essere esposti all'aria per evitare la colorazione degli anticorpi di fondo.
2. Aggiungere 1 ml di metanolo ghiacciato al 100% (per permeabilizzare) goccia a goccia. Gli embrioni sono ora fragili dopo la fissazione e bisogna prestare particolare attenzione per evitare che cadano all'interno della tuba durante tutta la successiva rimozione/aggiunta di liquidi. Stendere i tubi sui lati e posizionarli a -20 °C per 2 ore. In alternativa, gli embrioni possono essere lasciati a -20 °C per un massimo di 24 ore.
3. Posizionare le provette in un rack per raccogliere gli embrioni sul fondo della provetta. Rimuovere il metanolo, lasciando il liquido appena sopra il livello degli embrioni.
4. Aggiungere con cautela 1 ml 1x PDT. Rimuovi la PDT e aggiungi 1 ml di PDT fresca. Appoggiare i tubi sui lati e oscillare delicatamente a RT per 30 minuti. Rimuovere la PDT e ripetere il lavaggio per 30 minuti con PDT fresca.
5. Rimuovere la PDT fino a quando il liquido non supera il livello degli embrioni e aggiungere 500 μl di tampone bloccante.
   1. Deporre gli embrioni su un fianco in un contenitore per il trasporto e assicurarsi che gli embrioni non viaggino per più di 2/3 della lunghezza della tuba. In caso contrario, gli embrioni rimangono intrappolati nel coperchio della provetta e all'esterno del liquido.  
   2. Posizionare con cura il contenitore di trasporto con i tubi su un bilanciere molto delicato a RT per 1 ora.
6. Posizionare le provette in posizione verticale in un rack per provette e aprire tutte le provette per verificare la presenza di embrioni bloccati sul coperchio. Per tutte le provette con embrioni sul coperchio, chiudere la parte superiore e far oscillare delicatamente la provetta a mano per riportare tutti gli embrioni nel liquido.
7. Aggiungere 1 μl di anticorpo anti-caspasi 3 di coniglio (diluizione 1:500).
   1. Se si esegue un esperimento di colabeling, è sufficiente aggiungere la diluizione appropriata del secondo anticorpo non derivato dal coniglio oltre all'anticorpo anti-caspasi 3 attivato.
8. Deporre con cura gli embrioni su un lato e cullarli delicatamente a temperatura ambiente per 2 ore. In alternativa, gli embrioni possono essere incubati a 4 °C durante la notte.
9. Posizionare le provette in un rack per provette. Rimuovere la soluzione di blocco/anticorpo. Aggiungere 1 ml di 1x PDT. Assicurati di capovolgere la provetta a mano per raccogliere eventuali embrioni bloccati sul coperchio della provetta. Quindi, apri tutte le provette per assicurarti che tutti gli embrioni siano stati rimossi dal coperchio.
10. Ripetere il passaggio 3.4.
11. Ripetere i passaggi 3.5-3.10, ma sostituire l'anticorpo anti-caspasi 3 attivato con l'appropriata diluizione di un anticorpo anti-coniglio coniugato con fluoroforo che assorbe la luce blu ed emette luce verde. Tuttavia, in questo caso può essere utilizzato qualsiasi anticorpo coniugato con uno spettro di assorbimento/emissione preferibile dall'utente. Dopo l'aggiunta dell'anticorpo secondario, è importante mantenere gli embrioni al buio per il resto del test. Coprire il contenitore di trasporto con un foglio di alluminio durante le fasi di incubazione, ma non preoccuparsi dell'esposizione alla luce quando si cambiano i tamponi.
    1. Se si esegue un esperimento di comarcazione, è sufficiente aggiungere la diluizione appropriata di un anticorpo secondario complementare coniugato con fluoroforo in questa fase.
    2. Nota: se l'utente desidera coetichettare la Caspasi 3 attiva con cellule che esprimono Gfp, l'anticorpo anti-caspasi 3 di coniglio deve essere seguito da un anticorpo secondario anti-coniglio non fluorescente verde e l'anticorpo anti-GFP deve essere seguito da un anticorpo secondario non di coniglio fluorescente verde. Ciò eliminerà la confusione se una certa fluorescenza Gfp rimane visibile dopo la fissazione degli embrioni.

4. Analisi di cellule apoptotiche mediante microscopia a fluorescenza

1. Analizza gli embrioni in 1x PDT in una piccola piastra di Petri o in una piastra spot di vetro sotto un microscopio a fluorescenza utilizzando il filtro ottico appropriato. Se i controlli positivi hanno una fluorescenza brillante con uno sfondo minimo, procedere al passaggio 4.2. (In caso contrario, consultare la sezione relativa alla risoluzione dei problemi nella Discussione e ripetere il protocollo con i nuovi embrioni.) Gli embrioni possono essere conservati a 4 °C in 1x PDT per un massimo di 48 ore.
2. Versare il 4% di metilcellulosa in una pirofila Petri da 3,5 cm, quanto basta per coprire il fondo della pirofila. In alternativa, è possibile utilizzare una piastra spot in vetro o un vetrino a depressione con una grande goccia di metilcellulosa nella depressione. Aspirare con cura gli embrioni dal fondo della provetta in una pipetta di trasferimento pulita e trasferirli nella piastra di Petri per la visualizzazione.
3. Orientare un embrione di interesse per la documentazione utilizzando una sonda angolata. Probabilmente ci sarà una certa variabilità tra gli embrioni dello stesso campione, quindi è importante scattare immagini che rappresentino l'intensità e il modello di fluorescenza osservati nella maggior parte degli embrioni di quel campione. La documentazione deve essere eseguita entro 48 ore dal completamento del test per evitare l'accumulo di fluorescenza di fondo non specifica. Il residuo di metilcellulosa al 4% non interferisce con le successive reazioni di PCR necessarie per la genotipizzazione degli embrioni.
4. Nota: per facilitare l'immobilizzazione di un embrione con una certa angolazione, è utile spingere delicatamente l'embrione sul fondo del piatto in modo che il tuorlo o qualche altra parte dell'embrione (a seconda della vista desiderata) sia appoggiato sul fondo del piatto. Quindi, utilizzare la sonda per spostare l'embrione o la metilcellulosa immediatamente circostante (visualizzando contemporaneamente al microscopio) per ottenere l'angolo desiderato per la documentazione.

Risultati

Il saggio Casp3 fornisce evidenza chiara di cellule apoptotiche a partire dallo stadio a 4 cellule fino a 32 hpf. Figura 2A mostra che l'iniezione di embrioni con alte concentrazioni di mRNA che codificano per potenti proteine pro-apoptotiche contenenti solo il dominio BH3, come Bim o Noxa, induce rapidamente la formazione di Caspasi 3 attiva già allo stadio a 4 cellule dello sviluppo. La morte embrionale si verifica successivamente entro 1 ora⁴. Si noti che l'intensità della fluorescenza è moderata, ma i risultati sono conclusivi. In stadi più avanzati, l'intensità della fluorescenza è più elevata. Ad esempio, Figura 2B mostra cellule attive positive per la Caspasi 3 negli embrioni allo stadio di sferula che sono stati iniettati con livelli moderatamente tossici4 di mRNA codificante per l'apoptosi solo bh3 gene puma. RNA messaggero che codifica per l'anti-apoptotico bcl-2 il gene è stato coiniettato per dimostrare che l'iniezione di puma L'mRNA induce apoptosi attraverso il percorso intrinseco mediato dai mitocondri.

L'apoptosi indotta da IR nel pesce zebra richiede la trascrizione mediata da p53 di geni della sola famiglia bh3, come puma^5-6. Il ritardo nell'apoptosi indotta da IR in Figura 3 è coerente con il requisito di trascrizione mediata da p53.

Il protocollo Casp3 dovrebbe produrre un rapporto segnale-rumore robusto. Figura 4 confronta il risultato ottimale del saggio Casp3 con due risultati subottimali comuni che si verificano quando passaggi critici sono compromessi (vedere la Discussione): un rapporto segnale-rumore debole dovuto alla fluorescenza di fondo nei tessuti dell'animale e alla fluorescenza del tuorlo che distrae dal segnale di interesse.

Esperimenti di codiluizione che utilizzano linee transgeniche esprimenti GFP approssimano i tessuti che subiscono apoptosi (Figura 5).

Figura 1. Schema semplificato del protocollo Casp3.

Figura 2. (A) Analisi dell'apoptosi in embrioni allo stadio a 4 cellule. Gli embrioni sono stati iniettati allo stadio a una cellula con 50 pg di mRNA codificante egfp (controllo) o il pro-apoptotico solo bh3 geni bim e noxa. Alla fase a 4 cellule (circa un'ora dopo l'iniezione, hpi), gli embrioni sono stati analizzati mediante immunofluorescenza per rilevare la Caspasi 3 attivata. Bim e noxa L'mRNA induce apoptosi rapida negli embrioni di pesce zebra immediatamente dopo l'iniezione, evento che, se gli embrioni vengono lasciati sviluppare, porta alla morte entro 2 hpi4. Viene mostrata un'immagine in campo chiaro di un embrione allo stadio di 4 cellule di tipo selvatico a scopo comparativo.B) Analisi dell'apoptosi in embrioni di zebrafish allo stadio di sferula. Gli embrioni sono stati iniettati allo stadio a una cellula con mRNA codificante per 50 pg egfp (controllo), 5 pg puma più 45 pg egfp (puma), oppure 5 pg puma più 45 pg di bcl-2 (bcl-2). A stadio di sferula (circa 4 hpi), gli embrioni sono stati analizzati mediante saggio Casp3. Sono mostrate viste laterali e del polo animale per visualizzare le cellule apoptotiche. Recupero dell'apoptosi indotta da puma mediante bcl-2 indica che l'iniezione di puma L'mRNA induce apoptosi specificamente attraverso il percorso intrinseco mediato dai mitocondri. Viene mostrata un'immagine in campo chiaro di un embrione allo stadio di sferula di tipo selvatico a scopo comparativo.

Figura 3. Andamento temporale dell'apoptosi indotta da radiazioni ionizzanti (IR) tra 17 e 20 hpf. Embryoni di zebrafish sono stati irradiati con 8 Gy di IR a 17 hpf e analizzati a 0, 1,5, 2 e 3 ore dopo l'irradiazione (hpIR) mediante il saggio Casp3. Le frecce a 20 hpf mostrano l'accumulo di cellule apoptotiche nel midollo spinale a 3 hpIR. Viene mostrata un'immagine in campo chiaro di un embrione a 17 hpf a scopo comparativo.

Figura 4. Risultati ottimali e subottimali dell'immunofluorescenza per Casp3 in embrioni a 27 hpf. Gli embrioni di pesce zebra sono stati irradiati (o meno) a 24 hpf con 15 Gy e analizzati mediante il saggio Casp3. Il gruppo "ottimale" mostra risultati ideali in cui le cellule apoptotiche fluorescono intensamente, mentre le cellule non apoptotiche e il tuorlo mostrano una fluorescenza di fondo minima. Le frecce nel gruppo “fluorescenza di fondo nel controllo” indicano una fluorescenza di fondo eccessiva nei tessuti degli embrioni di controllo. Gli asterischi nel gruppo “fluorescenza del tuorlo” dimostrano una fluorescenza aspecifica eccessiva nel tuorlo.

Figura 5. Esperimenti di codilluminazione approssimano la specificità tissutale dell'apoptosi indotta da radiazioni ionizzanti. La linea transgenica Tg(olig2:egfp)^vu12 etichetta i neuroni motori e gli oligodendrociti¹⁷, mentre la linea Tg(elavl3:egfp) etichetta tutti i neuroni in differenziazione¹⁸. Ogni linea transgenica è stata irradiata con 15 Gy a 24 hpf e analizzata 3 ore dopo utilizzando sia l'anticorpo primario murino anti-GFP sia quello coniglio anti-Caspase 3 attiva, seguiti rispettivamente da anticorpi secondari fluorescenti verdi e rossi. È mostrata un'ingrandimento del midollo spinale (localizzato dorsalmente rispetto all'estremità dell'estensione del tuorlo negli embrioni a 27 hpf, 3 h post-irradiazione). Le cellule apoptotiche sembrano essere parzialmente localizzate sia nella popolazione Tg(elavl3:egfp) sia in quella Tg(olig2:egfp)^vu12 (vedi le frecce nel diagramma sovrapposto), suggerendo che neuroni e oligodendrociti sono sensibili all'apoptosi indotta da radiazioni ionizzanti.

Discussione

Il test Casp3 presentato in questo protocollo è pensato per essere semplice e, se eseguito come indicato nel presente documento, dovrebbe dare origine a un robusto rapporto segnale/rumore. Le fasi critiche di questo protocollo includono l'uso di 1 tampone PDT fresco per tutti i lavaggi, una lunghezza sufficiente delle fasi di lavaggio nel tampone PDT dopo l'incubazione degli embrioni nell'anticorpo primario, una manipolazione delicata degli embrioni e una contabilizzazione meticolosa di tutti gli embrioni all'interno di provette o pipette di trasferimento durante tutte le fasi del protocollo.

Nella nostra esperienza, i motivi più comuni per la mancanza di un segnale sui controlli positivi sono i seguenti: 1) 1x PBST sostituisce 1x PDT durante le fasi di lavaggio, 2) 1x tampone PDT è più vecchio di un mese, 3) è stato utilizzato l'anticorpo secondario sbagliato, 4) gli embrioni hanno più di 32 hpf e/o 5) più di 40 embrioni sono stati analizzati in una provetta. Quando si verificano risultati incoerenti o variabilità all'interno dei campioni, ciò è solitamente dovuto al fatto che 1) non è stata prestata attenzione per garantire che tutti gli embrioni rimanessero sempre nel liquido durante la procedura e/o 2) gli embrioni non sono stati incubati con un dondolo sufficiente. Alti livelli di rumore di fondo sono spesso visualizzati come una generale foschia fluorescente che si forma in tutto il tessuto animale dell'embrione (vedi Figura 4, "fluorescenza di fondo"). Uno scarso rapporto segnale/rumore può verificarsi quando 1) gli embrioni non sono stati lavati per un tempo sufficiente dopo l'anticorpo primario e/o 2) gli embrioni sono stati lasciati in PFA o metanolo per un tempo più lungo del tempo raccomandato. Se gli embrioni non riescono a rimanere intatti entro la fine del test: 1) le soluzioni non sono state aggiunte goccia a goccia dopo la fissazione con PFA e/o 2) la velocità del bilanciere durante le fasi di incubazione è stata impostata su un valore troppo alto.

La visualizzazione dell'intera montatura inerente al saggio Casp3 è utile per la localizzazione spaziale delle cellule apoptotiche. Tuttavia, la specificità tissutale è approssimativa e probabilmente si baserà su tecniche di comarcatura (vedi Figura 5) e/o sezionamento embrionale per individuare l'esatta identità delle cellule sottoposte ad apoptosi. Nel protocollo qui descritto, la comarcatura è limitata dal requisito dell'anticorpo specifico derivato dal coniglio utilizzato nel nostro test. Non abbiamo identificato un anticorpo anti-caspasi 3 attivato non derivato dal coniglio disponibile in commercio che marcatori specificamente le cellule apoptotiche mediante immunofluorescenza a montaggio intero negli embrioni di zebrafish. Pertanto, gli anticorpi specifici per tipo di cellula che vengono allevati nei conigli non saranno compatibili con il saggio Casp3 per gli esperimenti di colabeling. Un'alternativa consiste nell'eseguire un test TUNEL che richiede un anticorpo derivato dal topo per marcare le cellule apoptotiche6. Tuttavia, abbiamo scoperto che il test TUNEL a montaggio intero eseguito su embrioni di zebrafish è molto sensibile a una serie di variabili nella reazione, tra cui la concentrazione dell'enzima TdT, la durata dell'incubazione dell'embrione nell'enzima TdT e il numero di embrioni presenti per provetta (le nostre osservazioni non pubblicate). Pertanto, è difficile trovare un equilibrio di enzimi che fornisca un'interpretazione coerente dei risultati. Pertanto, un'alternativa preferibile è quella di analizzare le cellule apoptotiche in embrioni transgenici di zebrafish che esprimono un fluoroforo (con anticorpi robusti disponibili in commercio) come la GFP in un tipo di cellula specifico. Quindi, gli esperimenti di colabeling possono essere eseguiti utilizzando un anticorpo primario di topo anti-Gfp seguito da un anticorpo secondario anti-topo fluorescente verde. Vedere la Figura 5 per un esempio.

Mentre il protocollo Casp3 fornisce una colorazione robusta e affidabile delle cellule apoptotiche negli embrioni dallo stadio di 4 cellule fino a 32 hpf, ha un'applicazione limitata oltre i 32 hpf a causa dell'incapacità degli anticorpi di penetrare nella pelle degli embrioni più vecchi. Ulteriori tecniche per permeabilizzare gli embrioni, tra cui il trattamento con collagenasi, tripsina, acetone o etanolo, potrebbero potenzialmente essere ottimizzate per adattare questo test all'analisi degli embrioni più vecchi. La colorazione con AO, tuttavia, può essere eseguita su zebrafish vivi fino ad almeno 5 giorni di età⁹. Pertanto, il test AO elude la restrizione dello stadio embrionale e rappresenta un test rapido per analizzare le cellule apoptotiche (1-2 ore). Al contrario, il test Casp3 richiede la fissazione notturna degli embrioni e richiede 2-4 giorni per essere completato. Gli svantaggi del test AO includono che un'efficiente documentazione fotografica degli embrioni può essere difficile con più campioni, poiché gli embrioni sono vivi e le cellule apoptotiche si formano e vengono eliminate rapidamente. Questo può essere particolarmente problematico se gli embrioni devono essere montati per ottenere un orientamento specifico per la documentazione. Inoltre, abbiamo scoperto che la colorazione AO diminuisce dopo la fissazione con PFA, quindi non è compatibile con gli esperimenti di comarcatura che coinvolgono l'immunofluorescenza.

L'analisi quantitativa della caspasi attivata 3 può essere eseguita utilizzando programmi software che misurano l'intensità della fluorescenza delle immagini documentate. Abbiamo quantificato l'apoptosi indotta dall'IR nel tessuto neurale, un metodo che abbiamo descritto in dettaglio altrove¹⁰. A seconda dell'esperimento, l'analisi quantitativa della caspasi 3 attivata può richiedere un'ulteriore manipolazione degli embrioni, come il montaggio piatto, per ottenere un orientamento corretto per un'analisi tissutale ottimale. Inoltre, la linearità dell'analisi dipenderà dallo spessore del tessuto analizzato. Ad esempio, abbiamo analizzato l'apoptosi indotta da IR nel tessuto neurale misurando l'immunofluorescenza della caspasi 3 attiva nel tessuto neurale superficiale del midollo spinale piuttosto che nel tessuto denso di neuroni del cervello^4,10.

Nella nostra esperienza, il test Casp3 è il test più robusto e affidabile disponibile per analizzare l'apoptosi negli embrioni di zebrafish tra lo stadio a 4 cellule e 32 hpf, quando l'analisi richiede molto tempo per la documentazione. Quando sono disponibili anticorpi appropriati o linee transgeniche per identificare cellule specifiche, questo test è anche altamente suscettibile di comarcatura per identificare i tipi cellulari specifici sottoposti ad apoptosi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi da 1,5 ml	Denville Scientific	c2170	Non pericoloso. Saranno sufficienti tubi di plastica simili da 1,5 m.
10x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	Non pericoloso.
anticorpo a-attivato-umana-caspasi-3	Fisher Scientific	BDB559565	Può essere dannoso se inalato o ingerito.
a-GFP anticorpo monoclonale (topo)	Life Technologies	33-2600	Può essere dannoso se inalato o ingerito.
proteina neuronale umana a-HuC/HuD, IgG2b di topo, monoclonale 16A11 - UNCONJ	Life Technologies	A21271	Può essere dannoso se inalato o ingerito.
Albumina, isolamento da shock termico bovino BSA	Amresco	CAS 9048-46-8	Non pericoloso. Può essere acquistato anche tramite Bioexpress: 0332-1006
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse IgG	Life Technologies	A11029	Utilizzare a diluizione 1:200. Può essere dannoso se inalato o ingerito.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG	Life Technologies	A21206	Utilizzare a diluizione 1:200. Può essere dannoso se inalato o ingerito.
Alexa Fluor 568 Donkey anti-Rabbit IgG	Life Technologies	A10042	Utilizzare a diluizione 1:200. Può essere dannoso se inalato o ingerito.
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma Aldrich	D8418	infiammabile.
Dumont #5 Inox Ropeps (punte standard/dritto)	Fine Science Tools	11251-20	Sharp!
FBS HyClone Siero fetale bovino	Thermo-Fisher	SH3091003	non pericoloso.
Fisher Scientific Ocelot Rotator	Fisher Scientific	05-450-21	Qualsiasi rotatore con controllo manuale della velocità è adatto.
Sale istantaneo dell'acquario oceanico	Petco	1373684	non pericoloso.
Metanolo (senza acetone)	Sigma Aldrich	M1775	Infiammabile: tossico per inalazione, ingestione e contatto.
Metilcellulosa	Sigma Aldrich	M0387-1006	Non pericoloso.
Paraformaldeide	Sigma Aldrich	P6148	Infiammabile: tossico per inalazione, ingestione e contatto.
Sonda (angolata 80 corta / diametro della punta 15,5 cm/0,15 mm)	Fine Science Tools	10140-02	Sharp!
La pronasi	Roche	11459643001	non pericolosa.
Piastra spot in Pyrex	Fisher Scientific	13-748B	Non pericolosa.
Pipette di trasferimento, Samco per uso generale	Thermo-Scientific	204	Non pericoloso.
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	Irritante: dannoso per ingestione o contatto.
Tween-20	Sigma Aldrich	P7949	Non pericoloso. Altri marchi includono VWR #97063-872.