Intramiocardico cellulare di consegna: Osservazioni in murini Hearts

Sommario

Consegna cellula intramiocardico in modelli murini di malattie cardiovascolari, come ipertensione o infarto del miocardio, è ampiamente utilizzato per testare il potenziale terapeutico di diversi tipi di cellule in studi rigenerativi. Pertanto, una descrizione dettagliata e una chiara visualizzazione di questa procedura chirurgica contribuiranno a definire i limiti ei vantaggi di cellule cardiovascolari analisi terapeutici in piccoli roditori.

Abstract

Precedenti studi hanno dimostrato che la consegna delle cellule promuove la funzione cardiaca miglioramento da rilascio di citochine e fattori che aumentano la rivascolarizzazione del tessuto cardiaco e la sopravvivenza cellulare. Inoltre, ulteriori osservazioni rivelato che le cellule staminali specifici, come le cellule staminali cardiache, cellule staminali mesenchimali e cardiosfere hanno la possibilità di integrare nel miocardio circostante differenziando in cardiomiociti, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali.

Qui vi presentiamo i materiali ei metodi per fornire in modo affidabile le cellule noncontractile nella parete del ventricolo sinistro del mouse immunodepleto. Le fasi salienti di questa procedura microchirurgica coinvolgono l'anestesia e analgesia iniezione, intubazione endotracheale, incisione per aprire la cassa ed esporre il cuore e la consegna di cellule da un ago sterile da 30 gauge e una siringa di precisione microlitro.

Trasformazione del tessuto costituito da raccolta cuore, embedding, sezionamento e colorazione istologica ha mostrato che l'iniezione di cellule intramiocardico prodotto un piccolo danno nella zona epicardico, nonché nella parete ventricolare. Noncontractile cellule sono state mantenute nella parete miocardica di topi immunocompromessi ed erano circondati da uno strato di tessuto fibrotico, probabilmente per proteggere dalla pressione cardiaca e carico meccanico.

Introduzione

Vari protocolli di recapito cella sono stati testati in modelli murini e ratto di malattie cardiovascolari con l'obiettivo di tradurre l'efficienza, l'efficacia e la sicurezza di questa procedura sperimentale in pazienti umani. In piccoli cuori roditori, la consegna delle cellule intramiocardico è il metodo più fattibile di consegna delle cellule ^1,2, mentre nel anterograda cuore di ratto ³ e retrograda ⁴ intracoronarica infusione di cellule può essere utilizzato anche. Entrambi i metodi hanno dei limiti e vantaggi. Invio delle cellule per via intracoronarica presenta vantaggi rispetto iniezione intramuscolare diretta nel promuovere la diffusione cella globale ^3, ma ha anche il rischio di causare embolia coronarica ^3,5. Limiti di consegna intramiocardico sono associati a danni meccanici, infiammazione acuta, e infarto del danno ^6,7. Negli esseri umani, cellule per la riparazione cardiaca sono forniti da iniezione intramiocardico attraverso un epicardico endocardiaca o chirurgicaavvicinarsi o per via arteriosa intracoronarica ^8. Iniezione per vie transvascolare è adatto nei pazienti con infarto miocardio acuto e riperfusione, ma potrebbe non essere possibile nel caso di occlusioni totali o scarsa flusso all'interno dei vasi del territorio effettuata ^9. Iniezione diretta nella parete ventricolare mediante iniezione transendocardial o transepicardial è tecnicamente fattibile a seconda dello stato di salute del paziente. Infatti, è stato dimostrato che questa tecnica è sicura ^10,11, sebbene iniettabile transepicardial è necessario un intervento chirurgico a torace aperto e per transendocardial avvicina una mappatura elettrofisiologica per ciascun paziente è necessario differenziare siti di vitale ischemica o sfregiato miocardio ^9.

È importante sottolineare che in studi di terapia cellulare la scelta della migliore cella da trapiantare è ancora oggetto di indagine. Analisi a breve termine (4 settimane) hanno mostrato che l'iniezione di cellule staminali cardiache definite come cardiosfere ^{12 o cellule di popolazione lato dal midollo osseo 13 indotta recupero funzionale cardiaca in murini 14 e ratto 15 modelli di infarto del miocardio diminuendo le dimensioni della cicatrice e la morte cellulare. Il trapianto allogenico di cardiosfere in un topo modello di infarto infarto senza immunosoppressione è stato trovato per essere sicuro, ha promosso la rigenerazione cardiaca, e migliorato la funzione del cuore attraverso la stimolazione dei meccanismi di riparazione endogena 15. Lin-/c-kit + adulte cellule progenitrici nel cuore hanno dimostrato di essere auto-rinnovano, clonogenica, e multipotenti in vitro e in vivo, e quando iniettato in un cuore ischemico ratto ricostituito ampie porzioni della parete miocardica ferito 16 e aveva l' capacità di formare conduttivo e di dimensione intermedia arterie coronarie 17. Questi dati promettenti alimentato fase I e II di sviluppo clinico nell'uomo: l'iniezione di cellule staminali mesenchimali autologhe e allogeniche (MSC) 18, cardiosfere 19o c-Kit positivi cellule staminali cardiache (CSC) 20 nei cuori umani ischemici ogni hanno mostrato effetti benefici in funzione cardiaca in studi a lungo termine. Tuttavia, la vasta follow-up a lungo termine e retrospettiva meta-analisi hanno dimostrato che la terapia con cellule staminali offre benefici significativi per alcuni pazienti, ma non in altri con una serie di risultati imprevedibili 21. E 'possibile che queste limitazioni richiederanno la progettazione di specifici protocolli di consegna delle cellule per ogni individuo e ogni malattia.}

Nei modelli topi e ratti, studi a lungo termine hanno rivelato che l'iniezione di cellule non migliora ulteriormente la funzione cardiaca (12 mesi). Infatti, innesti di cardiomiociti staminali embrionali umane derivate da cellule (hESC-CM) sono stati in gran parte isolate dal miocardio ospite da uno strato di tessuto fibrotico ^22,23. Risultati simili sono stati osservati dopo il trapianto di mioblasti scheletrici intramiocardico nel cuore di topi infartuati ^24. Furthermore, la capacità a lungo termine di MSC allogeniche per conservare la funzione nel cuore infartuato è stato limitato dal passaggio da un immunoprivileged ad uno stato immunogenica dopo la differenziazione ^25.

Prendendo in considerazione le sfide e le prospettive di cui sopra, vi mostriamo qui come consegnare le cellule mediante iniezione intramiocardico nei topi. Osserviamo che le cellule senza cardiomiociti proprietà contrattili non sono collegati con il miocardio host e una massa coesiva con una barriera fibrotica sottile. Anche se in alcuni casi questo risultato può essere vantaggioso, la seguente analisi può essere utile per capire come attecchimento delle cellule può essere modulata per generare strutture del miocardio funzionalmente collegate pure.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità internazionale (direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo) e nazionale (UK Home Office, Act del 1986) regolamenti. Le procedure qui descritte sono parte del nostro piano di lavoro sotto licenza autorità britanniche e non sono state intraprese a fini di registrazione.

1. Preparazione di cellule

Questo protocollo descrive la preparazione di una linea cellulare specifica (rene embrionale umano, cellule HEK293) a scopo dimostrativo. Protocolli specifici di cellule devono essere impiegate per la coltivazione e alla fine differenziazione delle cellule staminali pluripotenti o adulte in linee cellulari specifici.

1. Crescere le cellule in DMEM supporti (alto glucosio, 4.500 mg / L) contenente 1% di sodio piruvato, glutammina 2 mM, 1% antibiotico Pen / Strep e 10% siero fetale bovino (FBS). Un piatto di 10 centimetri dovrebbe essere normalmente diviso a 1:3 e mezzi completato fresco ogni due giorni.
2. Il trattamento di cellule leggermente con trypsin 1x e risospendere in mezzo DMEM come descritto in 1:1.
3. Contare le celle in una camera emocitometro e raccogliere 3 x 10 ⁶ cellule in un tubo separato.
4. Centrifugare in un rotore secchio swing a 100 g per 5 min.
5. Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con tampone fosfato sterile 2x.
6. Risospendere in PBS 1x ad una concentrazione di 10 ^6/50 pi per iniezione nel ventricolo sinistro del mouse immunodepleto.

2. Condizioni presurgical

1. Mantenere topi immunodepleto (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) con palline sterili di cibo e acqua in un isolatore a temperatura controllata (22 ° C; Tabella 1) prima di ogni intervento chirurgico.
2. Eseguire un intervento chirurgico di topi immunodepleto sotto una cappa a flusso laminare. Pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo e autoclave strumenti chirurgici (pinze e forbici).
3. Accendere rilievi di riscaldamento per la chirurgia e per il recupero. Rilievi di riscaldamento sono importantiper bloccare la diminuzione della temperatura corporea si verificano durante e dopo la chirurgia.
4. Mettere una gabbia pulita e autoclavato sulla rampa di recupero-riscaldamento.
5. Trasportare i topi nelle loro gabbie originali del sezionatore in sala operatoria in un sacchetto autoclavato sterile.
6. Pesare il mouse e in base al peso corporeo iniezione sottocutanea (sc) una soluzione contenente medetomidina e ketamina cloridrato diluito in soluzione salina sterile allo 0,9% per anestetizzare il mouse, come pure per rilassare la muscolatura (medetomidina 1 mg / kg; ketamina cloridrato 75 mg / kg).
7. Rimuovere il mouse dalla gabbia quando completamente anestetizzato (entro 1-2 minuti, nessun riflesso toe-pinch dopo stimolazione)
8. Applicare crema depilatoria sul lato sinistro del petto e la zona della gola. Dopo un congruo periodo di tempo (circa 2-5 minuti), rimuovere i capelli sciolti con un panno bagnato in acqua.
9. Posizionare il mouse sul pannello chirurgia in posizione supina. Dapunto di vista del chirurgo la posizione è verticale, coda verso il basso-testa.
10. Iniettare la soluzione analgesica a 0,1-0,2 mg / g diluito in soluzione fisiologica sterile (buprenorfina) nel sottocute arto posteriore e coprire la zona rasata con l'asettica iodio povidone soluzione utilizzando un cotton-fioc.
11. Mettere a fuoco il microscopio (obiettivo 2.5X) sulla zona della gola.

3. Condizioni chirurgici

1. Con le forbici spuntate fanno una linea mediana incisione cutanea ventrale di circa 0,5-1 cm di lunghezza leggermente al di sotto della cartilagine cricoide. Separare la pelle dal tessuto connettivo per visualizzare le ghiandole salivari.
2. Dividere le ghiandole salivari sulla loro divisione mediana naturale tirando contemporaneamente ogni lateralmente parte con pinza e magnetico divaricatore toracico ed esporre la trachea.
3. Tirare la lingua dolcemente verso il lato per esporre la laringe. Far scorrere il tubo di intubazione con cautela nella trachea. La punta del tubo è visibile attraverso il l visualizzatoarynx e trachea. È importante sottolineare che, se il tubo è in, ma non chiaramente visibile, è nell'esofago. Rimuovere e cambiare la posizione della punta del tubo.
4. Collegare il tubo alla macchina di ventilazione. Impostare il volume della corsa a 200 ml e 150 ictus / min. Fissare il tubo di ventilazione sul pannello chirurgia con un nastro.
5. Con le forbici smussate e pinze, fare una coda verticale a testa 1 - 1,5 cm a lunga incisione cutanea sopra la zona torace sinistro.
6. Allentare la pelle dagli strati di tessuto / muscolari connettivo e delle maggiori e minori muscoli pettorali senza incisioni.
7. Eseguire toracotomia tra la terza e la quarta costola come segue:
   1. Perforare lo strato muscolare intercostale da pizzicare e graffi con le piccole, pinze arrotondate.
   2. Una volta che lo strato di muscolo intercostale è perforato, posizionare il divaricatore petto per aprire al massimo la cavità toracica. Le parti superiori e medie del ventricolo sinistro (LV) con il suo padiglione auricolare sovrastante (atrio) sonoora visibile.
8. Preparare una siringa di precisione con le cellule. La siringa deve essere in grado di erogare una quantità di volume di 10 ul per ogni iniezione. Cast un ago G 30 sulla punta della siringa.
9. Fissare con nastro una piccola cannula di plastica (da un introcan-W 20 G) sul ferro, lasciando esposto 1 mm compresa l'estremità aperta dell'ago. Ciò evitare che l'ago perforante tutta la parete del ventricolo sinistro e iniettando le cellule nella cavità ventricolo sinistro.
10. Con l'aiuto di un obiettivo 5X, visualizzare in questo ingrandimento del ventricolo sinistro e iniettare le cellule nella parete ventricolare sinistra in 5 posizioni differenti (ogni iniezione fornirà 10 ul per un totale di 106 cellule iniettata). Se l'iniezione è successo, una superficie bianca e l'assenza di importanti controlavaggio delle cellule saranno visibili (se l'iniezione non ha avuto successo, l'animale sarebbe escluso da analisi funzionale).
11. Rimuovere il divaricatore. Chiudere la parete toracica by allegando i due costole separate con due punti di sutura di seta 6-0.
12. Idratare i muscoli pettorali e la pelle con una punta di cotone intriso di PBS 1x e delicatamente mettere i muscoli della schiena nella posizione originale con le pinze.
13. Chiudere la pelle con 3-4 punti di sutura di seta 6-0. Suturare l'incisione della gola con 2-3 punti di sutura per chiudere la pelle.
14. Iniettare atipamezolo (1 mg / kg concentrazione finale) per ripristinare gli effetti anestetici.
15. Non appena il topo inizia a respirare autonomamente, estrarre il tubo dalla trachea e mettere il mouse sul lato destro. Il mouse si prevede di recuperare in pochi minuti.
16. Quando il mouse comincia a girare e camminare, metterlo in gabbia recupero calda (piccola gabbia IVC, con chiusura superiore filtrata) per un'ora.
17. Lasciare gli animali durante la notte in una scatola riscaldata controllata (37 ° C).
18. Riempire un piatto con acqua e cibo pellet per sostenere la ripresa durante i primi due giorni dopo l'intervento.

4. Le analisi post-operatorie

Dieci cuori iniettati con cellule e 10 di controllo cuori non iniettati sono analizzati istologicamente come segue:

1. Eseguire analisi delle cellule innestate 1 settimana dopo l'iniezione (figure 1 e 3).
   1. Dopo l'eutanasia per overdose di isoflurano, profumato i cuori con 20 ml di paraformaldeide al 4% (PFA) per fissare il tessuto. Disidratare il tessuto fissato in percentuali crescenti di etanolo (dal 70-100%) e incorporare in blocchi di paraffina.
   2. Sezione cuori in paraffina con un microtomo a 5 micron e macchia con ematossilina ed eosina per l'analisi morfologica.
   3. Visualizza tessuto connettivo mediante colorazione tricromica di Masson.
   4. Analizzare le immagini al microscopio scanner per diapositive (Figure 1A, 2A, 3A, 3B e 3C) e visualizzare l'intero cuore in asse corto utilizzando un microscopio scanner per diapositive digitali (Figures 1B e 1C).
2. Dopo le analisi di cui sopra, Deparaffinare i tessuti cardiaci in xilene, reidratare immergendo esemplari discendente percentuali di etanolo (dal 100% acqua) e di processo per microscopia elettronica a scansione (SEM) come segue:
   1. Incubare blocchi deparaffinate con 1% di acido tannico in tampone fosfato 0,1 M per 1 ora.
   2. Disidratare i campioni in percentuali crescenti di etanolo (25-100%).
   3. Campioni secco con HMDS (esametildisilazano).
   4. Montare gli esemplari di Stubbs con Acheson Argento Dag e cappotto con oro-palladio.
   5. Visionare campioni in modo analitico microscopio elettronico a scansione (Figura 2B).

Risultati

Abbiamo iniettato HEK293 cellule, che sono distinguibili dalle cellule del cuore per la loro diversa morfologia (figura 1), con una forma di ciottoli rispetto ai cardiomiociti allungati (Figura 1A). Cellule HEK293 sono stati più reattivi a ematossilina colorante (colore blu) rispetto ai cardiomiociti (colore rosa), probabilmente a causa del loro elevato contenuto di nucleare (Figura 1A). Per distinguere ulteriormente le cellule iniettate dal tessuto ospite, cellule HEK2...

Discussione

In questo manoscritto, abbiamo mostrato come eseguire intramiocardico iniezione di cellule nei cuori murini. Come prova di questa metodologia, abbiamo utilizzato cellule HEK293. E 'importante sottolineare che le cellule HEK293 non vengono utilizzate in studi di terapia cellulare e, pertanto, i risultati di questo manoscritto non sono appropriati per la traduzione diretta di un approccio terapeutico. Tuttavia, il fatto che le cellule HEK293 non sono cellule contrattili e non transdifferenziare in altri tipi cellulari...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isolatore	Sistemi		Preventivo necessario Termoforo
	Vet Tech Solutions	HE006	Per piccoli animali
Medetomidina	Servizio		È necessaria la prescrizione veterinaria
Ketamina cloridrato	veterinario		È necessaria la prescrizione veterinaria
Atipamezolo	Servizio veterinario nazionale	È necessaria la prescrizione veterinaria
Microscopio elettronico a scansione	Jeol	JSM-6610
Forbici smussate	FST	14084-09
Apparecchio Minivent	Harvard	73-0043	Incluso piccolo adattatore a Y (73-0027) e cannula per intubazione (73-2844)
Pinze	FST	11052-10
Sistema di retrazione	FST	18200-20	Kit per animali fino a 200 g
30 G 12 mm; ½ pollici	BBraun	A210
Siringa da microlitri	ESSLAB	81201	Include anche un dispenser ripetibile Hamilton PB 600-1 Numero di catalogo 83700
6-0 Sutura di seta	Ethicon	W1614T

Pfi veterinario nazionale Servizio nazionale Crema depilatoria negozi commerciali Buprenorfina NVS È necessaria la prescrizione veterinaria Leica MZFLIII Microscopio Leica Modello S6E Con supporto a braccio oscillante TS0 Hamamatsu Scanner digitale per vetrini Nanozoomer Hamamatsu serie RS gialla fine