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Articolo metodologico

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

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DOI:

10.3791/51066

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9 febbraio 2014

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1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Renal Division, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3First Department of Critical Care Medicine and Pulmonary Services, University of Athens Medical School, Evangelismos Hospital, Athens, Greece

In questo articolo

Sommario

Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP). Attuali protocolli per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi CLP-indotta sono presentati qui: Un protocollo per misurare autofagia utilizzando topi (GFP)-LC3, e un protocollo per misurare formazione dell'autofagosoma mediante microscopia elettronica.

Abstract

Sepsi sperimentale può essere indotta in topi usando la legatura del cieco e puntura metodo (CLP), che causa sepsi polimicrobica. Qui, un protocollo è realizzato per indurre sepsi di gravità variabile nei topi usando la tecnica CLP. L'autofagia è una risposta tessuto fondamentale per lo stress e patogeno invasione. Due protocolli attuali per valutare autofagia in vivo nel contesto della sepsi sperimentale sono anche presentati qui. (I) topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde proteina (GFP)-LC3 di fusione sono sottoposti a CLP. Valorizzazione localizzata di segnale GFP (puncta), come saggiata mediante analisi immunoistochimica o confocale, può essere utilizzato per rilevare la formazione dell'autofagosoma maggiore e, quindi, l'attivazione alterata della via autofagia. (II) rafforzata vacuole autophagic (dell'autofagosoma) formazione per area di tessuto dell'unità (come marcatore di stimolazione dell'autofagia) può essere quantificato usando la microscopia elettronica. Lo studio delle risposte autofagiche a sepsi è un comp criticoonent di comprendere i meccanismi attraverso i quali i tessuti rispondono alle infezioni. Risultati della ricerca in questo settore possono infine contribuire a comprendere la patogenesi della sepsi, che rappresenta un problema importante in terapia intensiva.

Introduzione

La sepsi, la risposta infiammatoria sistemica all'infezione, rappresenta una delle principali cause di morte nei pazienti criticamente malati-1. Infezioni intra-addominali, spesso portano alla sepsi polimicrobica, rappresentano il 20% dei casi di sepsi, che hanno sostanziale la mortalità fino al 60% 2. La mortalità associata alla sepsi risulta principalmente dalla disfunzione multi-organo con conseguente insufficienza d'organo 3,4. Ulteriori indagini nel meccanismo patogenetico di questa malattia è urgentemente necessaria per promuovere lo sviluppo di nuove e più efficaci terapie.

Il metodo di legatura del cieco e puntura (CLP) è una procedura comunemente utilizzata per la modellazione sepsi in vivo. Come il cieco è piena di batteri, i risultati di puntura in peritonite polimicrobica, traslocazione di batteri nel sangue (batteriemia), shock settico, disfunzione multi-organo e, infine, morte 5. E 'generalmente accettato che CLP riflette clinicarealtà più accurato rispetto alle tecniche precedenti, come l'iniezione di endotossina o batteri anche depurati nei roditori, Così, CLP è considerato il gold standard (non senza limitazioni) 6 per l'induzione sperimentale e, quindi, l'indagine della patogenesi della sepsi. In questa monografia, descriviamo protocolli progettati per valutare se i meccanismi patogenetici di sepsi sono autofagia.

L'autofagia, un processo cellulare evolutivamente conservata, facilita il turnover delle proteine ​​e organelli come i mitocondri danneggiati e svolge un ruolo importante nella clearance dei patogeni intracellulari, tra cui i batteri 7,8. Durante l'autofagia, proteine ​​citosoliche o organuli sono sequestrate in vescicole di membrana matrimoniali sono nominate autophagosomes, che vengono successivamente consegnati ai lisosomi per la degradazione 9. Un certo numero di proteine ​​sono stati identificati come gli omologhi mammiferi di geni autophagy correlati (ATG),originariamente identificato nel lievito, che regolano il processo di autofagia. La conversione dei microtubuli proteina associata-1 catena leggera 3B (LC3B) (omologo di Atg8) dal LC3B-I (forma libera) per LC3B-II (forma fosfatidiletanolamina coniugata) rappresenta un passo importante nella formazione dell'autofagosoma 9. La disfunzione autophagic è associato con l'invecchiamento e le malattie umane, tra cui il cancro e le malattie neurodegenerative 10. Inoltre, l'autofagia colpisce l'immunità innata e adattativa quali la presentazione dell'antigene, lo sviluppo dei linfociti e la secrezione di citochine da parte delle cellule immunitarie 8. Pertanto, sembra ragionevole che autofagia potrebbe anche svolgere un ruolo nella risposta infiammatoria sistemica all'infezione (cioè nella sepsi).

Fino ad oggi diversi metodi sono stati descritti per valutare il ruolo dell'autofagia in lesioni dei tessuti in vivo. Questi includono l'uso di proteina fluorescente verde (GFP)-LC3 topi che esprimono e la quantificazione delle autophagosomes nel tessuto mediante microscopia elettronica (questi due metodi sono descritti in questa monografia). Altri metodi includono la quantificazione dell'espressione della proteina autophagic in omogenati di tessuto, e l'analisi del flusso autofagica (come descritto altrove) 11-13. L'obiettivo di questa revisione è quello di fornire attuali protocolli per valutare l'autofagia in vivo nel contesto della sepsi sperimentale.

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Protocollo

Nota: Il Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso il Brigham and Women Hospital / Harvard Medical School di Ambito ha approvato le procedure seguenti.

1. Cecal legatura e puntura

Utilizzare i topi dello stesso background (C57Bl / 6), di sesso maschile, 8-10 settimane di vita. Topi di sesso femminile sono più resistenti dei maschi contro letalità indotta da sepsi. I topi più vecchi di 8 settimane producono risultati variabili in meno rispetto ai topi più giovani in termini di sopravvivenza dopo CLP. Circa N = 10 topi per gruppo rispetto dovrebbero essere usati per l'analisi di sopravvivenza. N = 3-5 topi è sufficiente per saggi autofagia.

  1. Usare piccoli strumenti chirurgici sterili (cioè bisturi, forbici e pinze anatomiche contundenti), che dovrebbero essere adeguate per un intervento chirurgico roditore.
  2. Preparare la miscela di anestesia: per 7,95 ml di PBS aggiungere 150 ml di xylazina (AnaSed iniezione di 100 mg / ml) e 700 ml di ketamina (Ketaset   CIII, 100 mg / ml).
  3. Per garantire condizioni asettiche durante la procedura, indossare guanti, mascherina e camice chirurgico.
  4. Pesare animali. Li anestetizzare iniettando intraperitonally (ip) la miscela di cui al punto 3 in un dosaggio di microlitri (10x peso corporeo in g). Ad esempio, per un mouse pesatura 22 g, amministrare 10x22 = 220 microlitri della miscela anestetica. Così, le dosi finali di xilazina e ketamina sono 17 e 80 mg / kg di peso corporeo, rispettivamente. Assicurarsi che l'anestesia sia adeguata, senza la flessione di arto dovrebbe essere prodotto dopo pizzico punta. Nota: Usare pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  5. Posizionare gli animali su una superficie di lavoro pulita sulle loro spalle. Coda e le zampe posteriori sono orientati verso l'investigatore. Disinfettare la cute addominale con alcool (soluzione di EtOH 70%) Nota:. Area chirurgica deve essere completamente rasata, per evitare la contaminazione della ferita attraverso il contatto conpelliccia. Inoltre, in modo ottimale, un pad circolare l'acqua calda deve essere utilizzato per mantenere la normotermia di topi anestetizzati durante l'intervento chirurgico.
  6. Utilizzando un bisturi, fare una piccola incisione cutanea longitudinale parallelo e circa 1 cm a sinistra per linea mediana. Ancora non lo penetrare nella cavità peritoneale. Utilizzare piccole forbici per estendere l'incisione iniziale.
  7. Identify muscoli addominali e sezionare loro di accedere nella cavità peritoneale.
  8. Utilizzando pinze anatomiche smussato, identificare il cieco e spostare fuori della cavità peritoneale. Fare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni mesenterial (questo potrebbe portare a un'emorragia letale).
  9. Legare il 60% del cieco per ottenere una sepsi di grado medio. Legando pari o superiore al 75% del cieco genere provoca alta qualità sepsi, mentre legando pari o inferiore al 25% dei risultati cieco a basso grado di sepsi. Fare attenzione a non legare la valvola ileocecale (questo potrebbe bloccare la continuità intestinale).
  10. Utilizzando un21 ago G, perforare il cieco per uno attraverso-e-attraverso puntura (due fori) vicino al legatura. La direzione della perforazione dovrebbe essere dalla mesenterica al lato anti-mesenterico del cieco. Fare attenzione a non forare i vasi sanguigni mesenterial.
  11. Rimuovere l'ago. Premere delicatamente il cieco legatura per confermare la pervietà attraverso i due fori, solo una piccola quantità di feci deve essere estruso attraverso di loro.
  12. Spostare il cieco ligato e forato nella cavità peritoneale.
    Nota: Per i topi sham, saltare i punti 1,10-1,12.
  13. Utilizzare seta suture chirurgiche 6-0 con il taglio ago per chiudere muscolatura addominale. Utilizzare seta suture chirurgiche 6-0 con il taglio ago per chiudere cute addominale.
  14. Iniettare 1 ml preriscaldata (37 ° C) normale ip soluzione fisiologica per sostituire il calore e l'idratazione persa durante la procedura. Mettere i topi sotto una lampada di calore fino alla loro rianimazione Nota:. Ottimale, un dispositivo di riscaldamento più sicuro (such come pad acqua calda circolante) può essere usata al posto di una lampada di calore.
  15. Dopo l'intervento iniettare buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo sc.) Per ottenere analgesia. Nota: Un animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Un animale che ha subito un trattamento chirurgico non deve essere restituito alla compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
  16. Mettere gli animali nel loro gabbie con accesso illimitato al cibo e all'acqua. I topi saranno sacrificati quando diventano moribondi (indicato da segni clinici come l'insufficienza di muoversi quando è toccato o cianosi). Controllare topi ogni 4 ore per evitare di dover morire prima di eutanasia.

2. Tissue Harvest e Fixation

  1. Preparare una soluzione al 4% paraformaldeide (PFA): per 889 ml di PBS aggiungere 111 ml di 37% PFA.
  2. Sacrifica topi utilizzando CO 2 narcosi indotta o ketamina / xylazina soluzione in un alto dosaggio.
  3. Immobilizzare il mouse su una superficie di lavoro pulita. Spruzzare la cute addominale e toracica con una soluzione di EtOH 70% di disinfettarlo.
  4. Utilizzare un bisturi e piccole forbici per rimuovere la pelle addominale e toracica, nonche la pelle che copre la zona tracheale.
  5. Rivela trachea rimuovendo suoi tessuti circostanti (muscoli e tessuto connettivo).
  6. Collocare una sutura (senza tagliare ago) intorno alla trachea. Non serrare ancora.
  7. Utilizzare un piccolo catetere venoso periferico (20 G) per trachea 'intubate'. Prestare attenzione durante l'inserimento del catetere per evitare tracheale strappo. Si noti che il diametro della trachea è appena sotto la cartilagine cricoide.
  8. Stringere la sutura intorno alla trachea / catetere. Rimuovere l'ago lasciando solo la cannula di plastica del catetere nella trachea. Ago serviva solo come un filo guida per l'inserimento della cannula di plastica.
  9. Dopo aver ottenuto la cannula di plastica nella trachea, tagliare the muscolatura addominale, aprire l'addome e rivelare la membrana.
  10. Utilizzando un ago, forare la membrana per produrre pneumotorace (cioè inserimento di aria nella cavità pleurica). I polmoni dovrebbero quindi essere crollati.
  11. Utilizzando piccole forbici, rimuovere il diaframma, tagliare lungo lo sterno (sternotomia), rimuovere la gabbia toracica e rivelare il cuore ei polmoni.
  12. Attraverso la cannula di plastica inserito nella trachea, fissare i polmoni con la soluzione di formaldeide sotto i 30 cm H 2 O di pressione.
  13. Rimuovere i polmoni e metterli nel 4% PFA per 24 ore e successivamente in soluzione al 70% EtOH fino al trattamento.
  14. Identificare e rimuovere cuore, fegato e reni. Allo stesso modo, posizionarli nel 4% PFA per 24 ore e successivamente in soluzione al 70% EtOH fino trasformazione.

3. I topi GFP e la visualizzazione di diapositive GFP

  1. Eseguire CLP e chirurgia simulata su topi GFP-LC3, come descritto al punto 1, e la procedura di postoperatorias come descritto al punto 2 del protocollo.
  2. Incorporare i tessuti (in particolare i polmoni, cuore, fegato e reni) in paraffina e tagliarli in serie 5 micron sezioni.
  3. Quando pronto per GFP colorazione, incubare a 60 ° C per 30-60 min finché si scioglie e tessuto paraffina appare traslucido.
  4. Deparaffinare con lo standard serie graduata di xilene o sostituti, 5 min xilene 1, 2, xilene e xilene 3 di 3 min di incubazione in serie graduata di EtOH: 100%, 95%, 75%, e poi sciacquare con acqua distillata.
    Nota: Dopo deparaffinizzazione evitare l'essiccamento dei tessuti, che aumenta del campione sfondo.
  5. Eseguire recupero dell'antigene utilizzando tampone acido citrico (10 mM acido citrato di sodio, 0,05% Tween 20, pH 6,0), nell'apparecchiatura a microonde per 10-20 min. Fare attenzione di sostituire tampone periodicamente per evitare l'essiccamento del tessuto.
  6. Lasciare raffreddare la soluzione per 20 minuti in panchina per completare il recupero dell'antigene.
  7. Lavare 2-3x con PBS. Rimuovere l'eccesso di tampone e tradinsfer scivola da rack per posizione orizzontale in una scatola diapositiva o altra camera umidificata per evitare l'essiccamento.
  8. Bloccare 45-60 min a temperatura ambiente con 10% di siero asino normale (anche 5% di siero albumina bovina, o preferibilmente siero dall'animale in cui si genera l'anticorpo secondario) in PBS.
  9. Incubare i campioni in anticorpo GFP primario in diluizione 1:100 in PBS notte a 4 ° C in camera umidificata. Applicare delicatamente piccoli pezzi di Parafilm su tessuto con anticorpi per favorire il contatto omogeneo con il tessuto ed evitare l'evaporazione.
    Nota: passaggi rimanenti vengono eseguiti a temperatura ambiente.
  10. Lavare 5x con PBS per rimuovere l'anticorpo primario in eccesso. Incubare con anticorpo secondario 1:500-1:1,000 in PBS per 1-2 ore a temperatura ambiente.
  11. Lavare 5x con PBS per rimuovere l'anticorpo secondario in eccesso. Se lo si desidera, Controcolorare il vetrini in questa fase.
  12. Se si utilizza anticorpo secondario fluorescente, incubare 0,1% di nero Sudan nel 70% EtOH fo 15-20 min per ridurre autofluorescenza. Pulire l'eccesso Nero Sudan da circa tessuto e lavare 5x con PBS oltre 20 min.
  13. Montare campione con vetrino e conservare in orizzontale, fino a soluzione di montaggio è impostato.

4. Protocollo Alternativa: Rilevazione diretta di GFP-LC3

  1. Cannulare e gonfiare i polmoni con una ~ 500 ml di 50/50 v / v Ottobre PBS.
  2. Incorporare in OCT mettendo una piccola quantità di Office nella parte inferiore di un cryomold.
  3. Posizionare con cura il complesso polmone sezionato nello stampo.
  4. Lentamente gelare metilbutano refrigerati con ghiaccio secco.
  5. Aggiungere più OCT finché il tessuto è completamente coperto e solidifica. Tenere in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C.
  6. Utilizzando un cryomicrotome, tagliare 5-10 micron sezioni spesse proteggono le sezioni dalla luce. Sezioni negozio e tessuto rimanente a -80 ° C.
  7. Per preparare i vetrini per l'imaging, togliere la parte dal congelatore e applicare immediatamente una goccia di PBS per prevenire l'essiccamento.
  8. Fix per 30 minuti con 4% PFA. Lavare con PBS.
  9. Applicare DAPI / Hoescht per 10 min. Lavare 3x con PBS.
  10. Montare campione con vetrino e conservare in orizzontale, fino a soluzione di montaggio è impostato.
  11. Immagine con epifluorescenza o microscopio confocale. Conservare i campioni a 4 ° C per un massimo di un mese.

5. Preparazione di tessuto per microscopia elettronica

  1. Tagliare i tessuti in circa 1 millimetro cubi per il fissaggio.
  2. Fissare il tessuto in 2% di formaldeide, glutaraldeide al 2,5% in 0,1 M tampone cacodilato di sodio, pH 7,4.
  3. Lavare con 0,1 M tampone cacodilato di sodio per 1-2 ore.
    Nota: tessuto fisso può essere memorizzato in 0.1 M sodio cacodilato a 4 ° C.
  4. Posta fix in 1% tetrossido di osmio in 0.2 M di sodio tampone cacodilato per 1 ora.
  5. Sciacquare in 0.2 M di sodio tampone cacodilato per 10 min 3x.
  6. Disidratare nel 70% EtOH, 20 min 2x. Disidratare nel 90% EtOH, 10 min 2x. Disidratare in 100% EtOH,20 min 2x.
  7. Incubare con ossido di propilene (propano epossidica) per 10 min 2x.
  8. Incubare con miscela di resina di ossido di propilene / epossidico (50:50) per 1 ora. La miscela di resina epossidica è: 24 g Agar resina 100, 13 g di anidride dodecenylsuccinic, 13 g di anidride methylnadic e 1 ml di N-benzildimetilammina. Mescolare accuratamente in un bicchiere usa e getta con una spatola di legno.
  9. Incubare con epossidica notte resina in fiale non ridotti (questo consente a qualsiasi ossido di propilene residuo evaporare).
  10. Incorpora in capsule etichettati con resina appena preparato. Polimerizzare a 60 ° C per 48 ore.
  11. Sezioni di tessuto delle fotografie al microscopio elettronico a trasmissione a 80 o 60 kV su pellicola microscopio elettronico. Stampare le immagini su carta fotografica o memorizzare media come digitali.
  12. Analizzare la formazione dell'autofagosoma in cellule intatte contenenti nucleo. Campi a bassa potenza (e. G. 2.000-4.000 X) possono essere utilizzate per identificare le cellule nucleate. Tipicamente 6,800-10,000 immagini X vengono utilizzati per ªè la quantificazione dell'autofagosoma. Conte autophagosomes per unità di superficie 15-30 campi per la rappresentazione statistica del caso. Autophagosomes hanno una struttura a doppia membrana, dove autophogosomes fase avanzata somigliavano vacuoli pieni.

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Risultati

La batteriemia è presente nei topi fin da 6 ore dopo sepsi CLP-indotta 14. I segni clinici di sepsi (compresi i brividi, tachipnea e l'attività motoria) compaiono circa 12 ore dopo la procedura. I topi sottoposti a CLP cominciare a morire in circa 18 ore dopo l'induzione di peritonite. Il più grave è la sepsi più aumentata è la letalità 15. In particolare, ad alto grado di sepsi provoca una mortalità del 100% nel giro di 2-3 giorni, mentre i mid-grade risultati sepsi nella mortalità di circ...

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Discussione

Il principale vantaggio di CLP è che permette ai ricercatori di indagare sepsi di diversi livelli di gravità (cioè da basso a medio e alto grado). Gravità della sepsi indotta è influenzata dalla lunghezza del cieco ligato (che il determinante più importante), la dimensione di ago usato per puntura e il numero di fori eseguiti 15. Inoltre, il ceppo di topi e di genere possono avere un impatto sulla gravità della sepsi; diversi ceppi sono più sensibili di altri e maschi sono generalmente più sensibili ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari di dichiarare

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni P01 HL108801, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, a AMK Choi. S. Ryter ricevuto il sostegno di stipendio dal Lovelace Respiratory Research Institute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
GFP-LC3 Topi transgeniciRiken (Giappone)RBRC00806GFP-LC3 # 53
XilazinaHenry-Schein568-0606Xilazina HCl Iniezione Veterinaria
KetaminaHenry-Schein995-2949Ketaset Inj 100 mg / ml
EtOHFisherA405-20Grado istologico
EtOHFisherA407-1per sterilizzazione
suture chirurgiche di seta 6-0Owens & Minor2300-0078OG, 017624
buprenorfina-HClHenry-Schein614-5157Buprenex Ampolle
paraformaldeide (37%) soluzioneJT BakerS898-09
xileniFisherX3P-1GAL
anticorpo monoclonale anti-GFPLife TechnologiesG10362
HoeschtSigma944403
DAPIInvitrogenD1306
OCTVWR scientific25608-930
Sudan BlackSanta Cruzsc-203760
Grado EM Glutaraldeide 2,5% in cacodilato di sodioMicroscopia elettronica Scienze15960
ossido di propileneSigma240397
Agar 100 resinaAgar scientific R1045
anidride dodecenilsuccinicaSigma46346
anidride metilnadicaSigma45359
N-benzildimetilamminaSigma185582

Riferimenti

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