Articolo metodologico

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

DOI:

10.3791/51095

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22 febbraio 2014

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1School of Life Sciences, University of Warwick, 2The Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, 3Research School of Biology, The Australian National University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo qui un protocollo per la purificazione e caratterizzazione di complessi proteici vegetali. Dimostriamo che immunoprecipitando una singola proteina all'interno di un complesso, in modo da poter identificare le sue modificazioni post-traslazionali e dei suoi partner interagenti.

Abstract

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Le piante si adattano rapidamente alle mutevoli ambienti grazie ad elaborare la percezione e sistemi di segnalamento. Durante l'attacco di patogeni, le piante reagiscono rapidamente alle infezioni tramite il reclutamento e l'attivazione di complessi immuni. Attivazione di immunocomplessi è associato a modificazioni post-traduzionali (PTM) di proteine, come fosforilazione, glicosilazione, o ubiquitinazione. Capire come questi PTM sono coreografati porterà a una migliore comprensione di come si ottiene resistenza.

Qui si descrive un metodo di purificazione di proteine ​​per ricchi di leucina repeat nucleotide-binding (NB-LRR)-proteine ​​interagenti e la successiva identificazione dei loro modificazioni post-traduzionali (PTM). Con piccole modifiche, il protocollo può essere applicato per la purificazione di complessi di proteine ​​vegetali. Il metodo si basa sull'espressione di una versione epitopo-tag della proteina di interesse, b che viene successivamente parzialmente purificatoy immunoprecipitazione e sottoposti a spettrometria di massa per l'identificazione di proteine ​​che interagiscono e PTM.

Questo protocollo dimostra che: i). Cambiamenti dinamici nella PTM come fosforilazione possono essere rilevati mediante spettrometria di massa, ii). E 'importante avere quantità sufficienti di proteina di interesse, e questo può compensare la mancanza di purezza della immunoprecipitato; iii). Per rilevare PTMs di una proteina di interesse, questa proteina deve essere immunoprecipitate per ottenere una quantità sufficiente di proteine.

Introduzione

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Percorsi immunitario si basano su varie modificazioni post-traduzionali (PTM) di proteine ​​per trasdurre rapidamente i segnali e attivare risposte immunitarie 1. PTM sono rapide, reversibili e altamente specifiche alterazioni chimiche della struttura delle proteine ​​che possono influenzare la conformazione proteica, l'attività, la stabilità, la localizzazione e le interazioni proteina-proteina 2-4. Nelle piante, sono stati identificati più di 300 tipi di PTM compresi ubiquitination, sumolazione, solfatazione, glicosilazione e fosforilazione 2,5. Un crescente corpo di evidenze sottolinea l'importanza di PTM in diversi aspetti della pianta immunità 1,5,6. Fosforilazione proteica, il fissaggio reversibile di un gruppo fosfato ad una serina, residuo di treonina o tirosina è un regolatore di molte funzioni cellulari e non sorprendentemente più altamente studiato PTM nella difesa delle piante cascate di segnalazione 5-11. Segnalazione fosforilazione-dipendente è parte integrante della pianta féattivazione nse avviata dopo la percezione extracellulare di microbi da recettori transmembrana, o il riconoscimento intracellulare di proteine ​​resistenza multidominio 5,8.

Su invadendo le piante, i microbi vengono rilevati dai recettori della membrana plasmatica chiamati recettori di riconoscimento di pattern (PRR) 12. PRRs noti sono o recettore-come le proteine ​​(PLR) o chinasi del recettore-like (RLKs), sia portando un ectodomain-ligando e un dominio transmembrana single-pass. In contrasto PLR, RLKs hanno un dominio di chinasi intracellulare 13-15. Ectodomain di PRRs lega alle molecole conservate microbo elicitori chiamati pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP) principali, nel caso di RLKs, di autofosforilazione e transfosforilazione all'interno del dominio intracellulare 6, 16. A valle della percezione indotta fosforilazione della PRRS, conseguente fosforilazione di proteine ​​citoplasmatiche compresi chinasi 17, 18, E3 ligasi 19, mitogeno-activated protein chinasi (MAPK) 20, 21, calcio-dipendente proteina chinasi (CDPK) 22, 23, e la trascrizione Fattori 24, 25 porta alla immunità PAMP-triggered (PTI).

Oltre alla percezione extracellulare da PRRs, riconoscimento intracellulare di agenti patogeni è ottenuta attraverso recettori citoplasmatici. Questi resistenza multidominio (R) proteine ​​contengono un dominio variabile N-terminale, un nucleotide-binding (NB) motivo centrale, e ripete ricchi di leucina C-terminale (LRR) e quindi chiamati NB-LRR proteine ​​26, 27. Proteine ​​R direttamente o indirettamente riconoscono molecole di virulenza patogeni derivate dette effettori, noto anche per PRRs e altri nodi del sistema immunitario bersaglio. Riconoscimento induce forti difese che portano a effettrici-triggered immunità (ETI) 28-31. Proteine ​​NB-LRR hanno una requisizionemotivo TE ATP-binding all'interno del dominio NB 30, 32, ma sono privi di un dominio di chinasi. La fosforilazione di domini conservati di NB-LRR è stata riportata in una grande indagine proteomica 33, ma la sua rilevanza per l'ETI non è chiaro. Analogamente a PTI, l'attivazione di proteine ​​NB-LRR porta alla fosforilazione di proteine ​​citoplasmatiche compresi MAPK 34-37 e 38-40 CDPKs. Ancora più importante, il riconoscimento effettore può portare alla fosforilazione di proteine ​​accessorie che interagiscono direttamente con le proteine ​​NB-LRR 41. Alcuni esempi includono RIN4 (Arabidopsis thaliana) e Pto (pomodoro, Solanum lycopersicum), proteine ​​che interagiscono con le proteine ​​NB-LRR, RPM1 42, 43 e Prf 44, rispettivamente. Durante l'infezione da batteri Pseudomonas syringae, la proteina effettore AvrB induce RIN4 fosforilazione, molto probabilmente dalla chinasi recettore-like RIPK 45, 46. Analogamente, in pomodoro P. syringae effettori AvrPto e AvrPtoB inducono fosforilazione di Pto 47. In contrasto con RIN4 che manca di un dominio chinasi e deve essere trans-fosforilata, Pto è una chinasi attiva capace di auto-fosforilazione 48 e trans-fosforilazione di substrati 49, 50. Mentre Pto richiede la sua attività chinasi di effettori-dipendente apertura di segnalazione, mutanti Pto chinasi-morti sono ancora in grado di segnalare in modo effettore indipendente 51. Recentemente abbiamo spiegato queste osservazioni dimostrando che il complesso Prf / Pto è oligomeri, contenente più Prf e Pto molecole 52 e che le molecole Pto all'interno dello stesso complesso possono trans-fosforilazione l'altro 47. Abbiamo proposto un modello in cui una molecola di Pto (sensore) interagisce con la proteina effettore, causando un cambiamento di conformazione della proteina NB-LRR (PRF) che a sua volta attiva una seconda molecola Pto (helper) spiritohin complesso. Successivamente, l'helper Pto molecola trans-fosforila il sensore Pto conduce alla piena attivazione della resistenza complesso 47.

Questi esempi dimostrano che l'identificazione dei componenti complessi immunitari e loro potenziali PTMs momento della rilevazione effettrice può portare ad una migliore comprensione di come i segnali vengono trasdotte dalla percezione effettore a target a valle. Qui si descrive un metodo di purificazione della proteina per le proteine ​​NB-LRR interagenti e la successiva identificazione dei PTM. Usiamo Nicotiana benthamiana e il complesso pomodoro Prf / Pto come modello, ma lo stesso protocollo può essere facilmente applicato a RLKs da N. benthamiana e A. thaliana 53 con piccole modifiche, come si descrive nel protocollo.

Protocollo

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Nota: tutti i passi sono fatti a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.

1. Preparazione di materiali vegetali e tamponi

  1. Per N. benthamiana
    1. Coltivare l'Agrobacterium tumefaciens ceppi di interesse per l'espressione transiente (in questo esempio PRF-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG e il vettore vuoto come controllo) per agitazione (200 rpm) in coltura liquida (L medie con antibiotici appropriati) a 28 ° C fino alla fase stazionaria.
    2. Raccogliere e pellet agrobatteri per centrifugazione (3000 xg per 5 min). Gettare il surnatante e risospendere agrobatteri pellet in tampone di infiltrazione.
    3. Misurare la quantità di agrobatteri ottenendo la densità ottica (OD) valore in assorbanza a 600 nm (Abs 600 nm). Regolare il diametro esterno dei batteri a 0,1-0,8.
    4. Infiltrati 4 settimane di età N. piante benthamiana (22 ° C, 16 ore di luce) con agrobatteri da Hand (con una siringa senza ago 1 ml) o sotto vuoto (aggiungere 0,02% v / v tensioattivo).
      Nota: Utilizzare il primo foglio quasi integralmente espansa, e le due foglie più vecchie immediatamente per l'espressione più efficace della proteina. Per il rilevamento di proteine ​​ubiquinate o acetilate infiltrarsi foglie con 100 nM MG-132 o 100 ng / ml Trichostatin A, rispettivamente a 1 e 2 giorni dopo l'infiltrazione.
    5. Raccogliere le foglie infiltrate 2-5 giorni post-infiltrazione e congelamento in azoto liquido. Conservare i campioni in una -80 ° C freezer.
      Nota: Determinare il miglior livello di espressione della proteina di interesse in anticipo prelevando campioni su un percorso di 5 giorni e rilevare i livelli di proteina mediante immunoblotting.
  2. Per A. thaliana linee transgeniche stabili
    1. Crescere A. thaliana semi in piastre da 6 pozzetti integrati con 5 ml di terreno liquido MS (1% w / v saccarosio) per pozzetto. Mettere 3-5 semi (sterilizzati e stratificati) della linea transgenicadi interesse o linea di controllo non trasformata per pozzetto. Agitare a 200 rpm per due giorni prima di trasferire la piastra ad una camera di crescita e lasciare per 2 settimane (22 ° C, 10 ore di luce).
    2. Campioni raccolto e congelare in azoto liquido.
      Nota: è possibile utilizzare come un controllo di una linea transgenica che esprime una proteina non correlata con la stessa etichetta, come la proteina di interesse.
  3. Buffer
    1. Preparare tampone A. De-gas buffer per 1-2 ore (per RLKs, altre proteine ​​di membrana e proteine ​​nucleari, aggiungere 1% v / v IGEPAL CA-630 53).
      Nota: È possibile mantenere tampone A a 4 ° C a tempo indeterminato. È possibile utilizzare 1% v / v Triton invece di IGEPAL CA-360.
    2. Preparare 80 ml di freddo tampone B almeno 1-2 ore prima dell'estrazione.
      Nota: Il rapporto ideale di tessuto contro tampone di estrazione 1:4 (w / v).

2. Estrazione Protein

  1. Poco prima dell'estrazione preparare 80 ml di freddo tampone C.
    Nota: Aggiungere 10 micron MG-132 per la rilevazione delle proteine ​​ubiquitinate.
  2. Grind 20 g di N. benthamiana tessuto (circa 15 foglie) o A. thaliana piantine (2-4 g per 6 pozzetti) in azoto liquido con un mortaio e pestello.
  3. Aggiungere 80 ml di freddo tampone C per 20 g di tessuto a terra, mescolare bene, e scongelare il ghiaccio.
    Nota: Macinare tutti i campioni allo stesso tempo (proteina di interesse e controllo).
  4. Omogeneizzare con 3 raffiche di 10 secondi ciascuno a piena velocità con un omogeneizzatore tessuto (prechilled a 4 ° C). Filtrare su un tessuto 22-25 micron e centrifugare a 30.000 xg per 30 min a 4 ° C.
    Nota: in alternativa, mescolare con un mortaio prechilled fresco e pestello.
  5. Per la procedura di blocco e di lavaggio di matrice di affinità, preparare 20 ml di tampone D.
  6. Blocco 100 ml di matrice di affinità adatto utilizzando 500 ml di tampone freddo D contenente BSA 1% per 5 minuti a 4 ° C.
    Nota: Preferred afmatrici Finity includono anti-FLAG M2 agarosio, streptavidina agarosio, GFP-Trap_A e anti-HA agarosio.
  7. Lavare 3x con 1 ml di tampone a freddo D.
  8. Rimuovere il surnatante di estratto di foglie e filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,45 micron in un nuovo tubo sul ghiaccio.
    Nota: Il colore estratto dovrebbe essere verde o giallo, se il campione si è trasformato marrone, scartare e ricominciare.
  9. Prelevare un 'aliquota del greggio estratto per immunoblot, aggiungere 5x tampone SDS-PAGE carico, vortex e denaturare da campioni bollente per 10 min a 80-100 ° C in un blocco di calore.

3. Proteine ​​Immunoprecipitation

  1. Dividere l'estratto proteico in due provette da 50 ml e aggiungere 50 ml di matrice di affinità sospesa in tampone D ad ogni provetta. Incubare con lieve rotazione per 2 ore a 4 ° C.
    Nota: incubazione più lunghi non sono stati trovati per aumentare il rendimento.
  2. Preparare 600 microlitri (6x volume dei cordoni di matrice di affinità) di tampone di eluizione aggiungendoBuffer D (concentrazioni finali): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG peptide (anti-FLAG M2 agarosio) o 10 mm D-biotina (per Streptavidin agarosio).
    Nota: eluizione non è raccomandato nel caso di GFP-Trap_A e anti-HA matrici, in modo da procedere direttamente ad ebollizione in 1x tampone SDS-PAGE carico, passo 3.11.
  3. Precipitare matrice di affinità mediante centrifugazione a 4 ° C (5 min a 1000 xg).
  4. Prelevare una aliquota dell'estratto applicano restrizioni per immunoblot, scartare il resto del supernatante, lasciando circa 500 microlitri sul fondo della provetta.
  5. Risospendere la soluzione impasto con una punta wide-bore.
  6. Trasferire la soluzione mista slurry da entrambi i tubi di un unico tubo 1,5 ml.
    Nota: Da ora in poi, utilizzare 1,5 ml a basso legame alle proteine ​​tubi microcentrifuga.
  7. 3x impulsi per 5 sec utilizzando una centrifuga da banco per precipitare la matrice di affinità e rimuovere il surnatante.
  8. Lavare 3-5x con 1 ml di tampone a freddo D. Tra i lavaggi precipitare il matri affinitàx come descritto in precedenza e scartare il surnatante. In ultimo lavaggio rimuovere l'eccesso di tampone D con l'ago di una siringa.
    Nota: un lavaggio finale con tampone D con 0.1% IGEPAL può essere utilizzato per ridurre ulteriormente il legame non specifico.
  9. Eluire con 200 ml di tampone di eluizione appropriato (per anti-FLAG M2 o streptavidina agarosio vedere la fase 3.2) 3x, 5 min ogni volta con costante agitazione.
  10. Si riuniscono gli eluati 3 in un singolo tubo. Concentrare le proteine ​​utilizzando 30 ml di resina assorbimento. Vortex, lasciate riposare per 5 minuti e precipitare la resina (2 min a 10.000 xg). Scartare il surnatante.
    Nota: Per GFP-Trap_A e anti-HA agarosio, saltare i passaggi 3.9 e 3.10.
  11. Aggiungere 50 ml di 1x tampone SDS-PAGE carico alla matrice di affinità precipitato o resina assorbimento. Vortex e far bollire per 10 minuti a 80-100 ° C in un blocco di calore.
  12. Centrifugare la matrice di affinità bollito o resina per 2 minuti a 10.000 x g. Aliquota 5 microlitri del supernatant per immunoblot, e correre con altre frazioni su un ~ 10 cm SDS-PAGE gel (Figura 2).
  13. Per la separazione e l'identificazione di proteine ​​fosforilate mediante spettrometria di massa, caricare il restante 45 microlitri su un ~ lunga 19 cm gel SDS-PAGE se separazione supplementare è richiesto (Figura 2).
    Nota: Una corsia vuota può essere incluso tra tutti i campioni per ridurre la contaminazione dei campioni.

4. Digestione delle proteine

  1. Colorare il gel SDS-PAGE con colloidale Coomassie blu brillante (CCBB) macchia.
    Nota: Ridurre al minimo la manipolazione del gel per ridurre la contaminazione con cheratine. Assicurarsi che nessuna delle attrezzature o gli strumenti sono stati utilizzati per immunoblotting o altre attività che potrebbero aver lasciato la contaminazione proteine ​​residue.
  2. Destain il gel con abbondante lavaggio in acqua, preferibilmente O / N. Tagliare la banda di interesse dal gel con una lama di rasoio pulito.
    Nota: Allineare il gel con la immunoblot se necessary di individuare l'area corretta. Come fosforilazione può ritardare la migrazione delle proteine ​​su SDS-PAGE intercettato zona immediatamente sopra e sotto la banda di interesse.
  3. Tagliate la fetta gel a cubetti di 2-4 mm (questo assicura che il gel sarà coperto da soluzioni nel tubo senza bloccare i puntali delle pipette). Mettere in un tubo.
  4. Stimare il volume richiesto per mantenere il gel bene sommerso. Utilizzare questo importo per derivatizzazione, incubazione con proteasi ed estrazione peptide, e quindi utilizzare il doppio per i volumi triple per il lavaggio.
    Nota: In un tipico digerire con circa 100 ml di pezzi gel taglio, usare la soluzione di 500 ml per il lavaggio, 2 x 180 microlitri per disidratazione, 150 microlitri di riduzione, 120 microlitri di alchilazione, e 120 microlitri per la digestione.
  5. Lavare i pezzi di gel 2 x 20 minuti (o fino decolorato) aggiungendo 50% acetonitrile (in bicarbonato di ammonio 50 mM, ABC). Pipettare fuori la soluzione facendo attenzione a non rimuovere pezzi di gel.
  6. Disidratare con il 100% acetonitrile per 5 minuti e rimuovere il liquido libero.
    Nota: Il gel dovrebbe apparire rimpicciolito e nero. Se il colore blu persiste, incubare più in acetonitrile / ABC e / o ad elevata temperatura (45-55 ° C).
  7. Ridurre legami disolfuro di proteine ​​con l'aggiunta di DTT 10 mM in acqua e incubare per 30-45 minuti a 56 º C con agitazione. Rimuovere il liquido libero.
  8. Residui di cisteina alchilata per l'aggiunta di cloroacetammide 55 mm (nel 50 ABC mm) per 20-30 minuti (a temperatura ambiente, scuro). Rimuovere il liquido libero.
  9. Lavare pezzi di gel 2 x 10 min con 50% acetonitrile (in 50 mM ABC). Rimuovere il liquido libero.
  10. Disidratare pezzi di gel con il 100% di acetonitrile per 5 minuti e rimuovere il liquido libero.
  11. Per il trittico digerire, aggiungere 40 ml di soluzione di lavoro tripsina (100 ng di tripsina in tampone di digestione: 50 ABC mm, 5% acetonitrile per una fascia media di Coomassie macchiati). Lasciare pezzi di gel per reidratare per 10 min. Aggiungere sufficiente di tampone di digestione per coprire pezzi di gel se necessario. Incubare a 37 ° CO / N.
  12. Per arrestare la digestione ed estrarre i peptidi dai pezzi di gel, aggiungere l'acido formico al 5% (in 50% acetonitrile) (aggiungere lo stesso volume come volume digestione). Ultrasuoni per 5-10 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetere l'estrazione 3x.
  13. Essiccare i peptidi mediante liofilizzazione (preferito) o un concentratore a vuoto (come Speed-Vac o Savant). Conservare a -20 ° C.
  14. Invia il tuo campione per la spettrometria di massa.
    Nota: Abbiamo presentato il nostro campione alla struttura spettrometria di massa a The Sainsbury Laboratory (Norwich, UK). Protocolli in strutture di spettrometria di massa variano notevolmente, ma in genere i peptidi saranno sciolti in acido trifluoroacetico 0,2% con il 2% acetonitrile prima di caricare su un sistema di cromatografia liquida accoppiata elettro-spruzzo spettrometria di massa tandem.

Risultati

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Descriviamo qui un protocollo per la purificazione di proteine ​​marcate da stabile transgenico A. thaliana linee o dopo l'espressione transiente di proteine ​​in N. benthamiana. Come illustrato in figura 1 la purificazione della proteina bersaglio è accoppiata alla spettrometria di massa per consentire l'identificazione di proteine ​​interagenti e le PTMs della proteina bersaglio. Il protocollo è stato progettato per la purificazione di proteine ​​coinvolte nell'immunità impianti e identificazione dei PTM, ma può essere applicata a qualsiasi purificazione di proteine ​​vegetali targhetta.

Come esempio usiamo la purificazione del complesso Prf / Pto da N. benthamiana. L'N. transgenico benthamiana linea 38-12 54, esprimendo 35S: Pto, è stata transitoriamente trasformato con 35S: PRF-FLAG e il complesso è stato immunoprecipitati con anti-FLAG M2 agarosio (Figura 2A). Gli immunoblot (IB) in Figura 2Aillustrano che la maggior parte della proteina mirata (PRF) è stato immunoprecipitato. Pto e la proteina effettore interagendo AvrPtoB stati copurified con Prf e rilevato usando anticorpi e spettrometria di massa (Figure 2A e 2B). Abbiamo trovato che il Pto che copurified con Prf migrato più lenta su SDS-PAGE gel quando coexpressed con l'attuatore costruisce 35S: AvrPto e 35S: AvrPtoB (Figura 2A). Entrambe le proteine ​​effettrici indotte lenta migrazione del Pto PRF-interagenti (Figura 2A). Questo riconoscimento effettore-dipendente lenta migrazione di Pto stato precedentemente attribuito alla fosforilazione come potrebbe essere rimosso mediante trattamento con fosfatasi 44. Per rilevare i siti di fosforilazione che contribuiscono alla lenta migrazione di Pto, abbiamo sottoposto il copurifying Prf Pto per analisi di spettrometria di massa. Nonostante l'alta espressione di Pto e la sua facilità di rilevamento con immunoblots potremmo recuperare peptidi cOvering solo il 57% di sequenza Pto e siamo riusciti a identificare tutti i siti di fosforilazione (Figura 2B).

Successivamente, abbiamo cambiato le strategie per indirizzare la proteina Pto con l'anti-FLAG. N. piante benthamiana WT sono stati transitoriamente trasformate con 35S: PRF-3HA e 35S: Pto-FLAG, con o senza 35S: AvrPto e 35S:. AvrPtoB La quantità totale di proteine ​​Pto, comprendente sia il Prf-complessato e le forme libere, è stato immunoprecipitato con anti-FLAG M2 agarosio e sottoposti a SDS-PAGE frazionamento, in-gel digestione con tripsina e analisi di spettrometria di massa (Figura 2C). Con questo approccio abbiamo identificato i peptidi Pto coprono circa il 80% della sua sequenza e uno sconosciuto 100 kDa proteine ​​interagiscono. Abbiamo identificato un insieme di siti singoli e doppi di fosforilazione per PTO peptidi 187-202 e 188-202 (Tabella 1). Ser-198 e Thr-199 sono stati i siti di fosforilazione predominanti, ma altri phoSono stati inoltre individuati i siti sphorylation (Tabella 1). Soprattutto doppia fosforilazione sulla Ser-198 e Thr-199 è stato identificato solo in presenza di una delle proteine ​​effettrici (Tabella 1). Recentemente abbiamo identificato un simile insieme di siti di fosforilazione Pto ed illustrato il significato della manifestazione doppia fosforilazione per la segnalazione 47. Seguendo il protocollo descritto qui siamo stati in grado di identificare i cambiamenti dinamici nello stato di fosforilazione della proteina bersaglio.

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Figura 1. Disegno sperimentale generale. La proteina bersaglio per immunoprecipitazione (IP) è etichettato ed espresso in planta, transitoriamente in Nicotiana benthamiana o stabilmente in Arabidopsis thaliana. Dopo l'estrazione di proteine ​​delproteina bersaglio viene immunoprecipitata con una matrice di affinità. Le proteine ​​sono separati su un gel di acrilamide mediante elettroforesi. Bande di gel sono escisse. Le proteine ​​sono estratti dalle bande di gel e sottoposto a spettrometria di massa. Siti di fosforilazione e proteine ​​che interagiscono sono identificati. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Figura 2. Prf e Pto immunoprecipitazione. A). Il costrutto 35S: PRF-bandiera è stata transitoriamente espresso in 38-12 linea (35S: PTO) con vettore vuoto (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB. Tre giorni dopo l'infiltrazione Prf è stata immunoprecipitata con matrice di affinità anti-FLAG. Immusono stati eseguiti noblots (IB) per Prf, AvrPtoB e Pto. Come sottolineato da frecce nella parte inferiore del pannello immunoblot Pto, AvrPto e AvrPtoB inducono una migrazione più lenta di Pto. B). Il costrutto 35S: PRF-bandiera è stata transitoriamente espresso in 38-12 linea (35S: PTO) con vettore vuoto (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB. Tre giorni dopo l'infiltrazione Prf stata immunoprecipitata con anticorpi anti-FLAG agarosio e separati su SDS-PAGE. Il gel è stato colorato con blu brillante Coomassie colloidale (CCBB) e il visibile Prf, PTO e AvrPtoB proteine ​​bande sono state tagliate dal gel e analizzati mediante spettrometria di massa. Viene indicata la copertura peptide percentuale di presa di forza e PRF sequenze identificate mediante spettrometria di massa. C). I costrutti 35S: PRF-3xHA e 35S: Pto-FLAG sono stati transitoriamente espressi con 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto o vettore vuoto (EV) in N. benthamiana. Tre giorni dopo l'infiltrazione totale dellaPto-FLAG è stata immunoprecipitata utilizzando anti-FLAG agarosio e deliberato SDS-PAGE. Il visibile Pto e Pto interagenti bande proteiche sono state asportate dal gel e analizzati mediante spettrometria di massa. Pto e la band proteina di 100 kDa Pto interagenti sono chiaramente visibili sul colloidale Coomassie blu brillante (CCBB)-gel colorato, che Prf è leggermente meno visibile (come indicato dalle frecce). IP: immunoprecipitazione; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie blu brillante colorazione; ccbb: colloidale Coomassie Brilliant colorazione blu. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Prf
EV AvrPto AvrPtoB
Pto peptide 188-202
GTELDQ [p T 195] HLSTVVK 1 1 0
GTELDQTHL [p S 198] TVVK 10 7 5
GTELDQTHLS [p T 199] VVK 8 3 4
G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK 0 1 2
GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 8 4
GTELDQTHLSTVVK 46 26 48
Pto peptide 187-202
KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK 0 1 0
KGTELDQTHL [p S 198] TVVK 17 17 12
KGTELDQTHLS [p T 199] VVK 4 2 2
KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK 0 1 1
KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK 0 7 5
KGTELDQTHLSTVVK 21 37 18
Peptidi 187-202 e 188-202 83 88 50
Percentuale di peptidi con due eventi di fosforilazione 0% 26,9% 11,2%
Pto copertura Sequence 78% 79% 82%

Tabella 1 doppio fosforilazione di un peptide Pto previa attivazione di segnalazione 35S:.. PRF-3xHA e 35S: Pto-FLAG sono stati transitoriamente espresso con empty vettore (EV), 35S: AvrPto o 35S: AvrPtoB in N. benthamiana. Tre giorni dopo l'infiltrazione della quantità totale di proteine ​​Pto-FLAG è stata immunoprecipitata con matrice di affinità anti-FLAG e deliberato SDS-PAGE. Le bande visibili Pto sul colloidale Coomassie brillante gel colorato blu sono stati asportati ed analizzati con spettrometria di massa. È indicato il numero di peptidi Pto identificati con 0, 1, e 2 eventi di fosforilazione.

Tabella dei buffer
L medio Triptone 10 g / L
Estratto di lievito 5 g / L
NaCl 5 g / L
D-glucosio 1 g / L
Tampone Agro-infiltrazione MgCl 2 10 mM
MES 10 mM
Regolare a pH 5,5
Acetosyringone (opzionale) 150 pM
Tampone A Tris-HCl pH 7.5 150 mm
NaCl 150 mm
EDTA 5 mM
EGTA 2 mM
Glicerina 5% (v / v)
Buffer B Tampone A
PVPP 2% (w / v)
Buffer C Buffer B
Ditiotreitolo (DTT) 10 mM
Pianta Protease Inhibitor Cocktail 1% (v / v)
Fluoruro Phenylmethylsulfonyl (PMSF) 0,5 mm
Calyculin A 50 Nm
Fluoruro di sodio (NaF) 50 mM
Molibdato di sodio (Na 2 Moo 4) 10 mM
Sodio orthovanadate 1 mM
Acido okadaico 100 nM
Buffer D Buffer C senza PVPP
Tampone di caricamento 5x SDS-PAGE Tris-HCl pH 6.8 60 mM
SDS 2%
Glicerina 0,15%
Bromofenolo blu 0,10%
DTT (aggiungere solo prima dell'uso) 50 mM

Tabella 2. Tampone e le ricette dei media.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chiarire il meccanismo di attivazione del recettore da parte PAMPs e effettori può contribuire notevolmente alla nostra comprensione dell'immunità pianta. Negli ultimi 20 anni, gli schermi di due ibridi genetici e lievito sono state fondamentali per la scoperta di PRRs e proteine ​​NB-LRR. Più recentemente, sono stati stabiliti protocolli basati spettrometria di massa per l'identificazione di proteine ​​differenzialmente regolati durante immunitario segnalazione 55-58, loro PTMs 11,33,59,60, la composizione di immunocomplessi 61 e effettore obiettivi 62. Qui si descrive un protocollo semplice per l'identificazione di PTMs regolano l'attivazione di complessi immuni.

In confronto con i protocolli descritti in precedenza, questo protocollo permette l'identificazione dettagliata delle modifiche dinamiche dei PTM. Protocolli degli approcci di proteomica su larga scala possono identificare PTM di proteine, ma non sono in grado di rivelare il sito plasticità del PTM dovuti limitareEd quantità di proteine. Nel caso di fosforilazione proteica, su larga scala proteomica approcci tipicamente individuano solo i siti di fosforilazione predominanti 11,33,59. La caratterizzazione dettagliata di uno stato di fosforilazione di proteine ​​richiede una notevole quantità di proteina che può essere ottenuto solo mediante parziale purificazione della proteina bersaglio 47. Il protocollo qui descritto coppie un approccio purificazione proteina che produce una notevole quantità di proteina bersaglio, con analisi di spettrometria di massa della proteina purificata. A seguito di tale protocollo, l'evento fosforilazione singolo di Pto è stata attribuita principalmente al Ser-198 come descritto in precedenza 52, ma alcuni spettri di spettrometria di massa ha anche sostenuto un singolo evento di fosforilazione su Thr-195 o Thr-199. Quando sono stati osservati eventi matrimoniali fosforilazione della Pto, la combinazione predominante di aminoacidi fosforilati era Ser-198 e Thr-199, anche se sono state osservate anche combinazioni su altri siti (Tabella 1). Questi risultati dimostrano chiaramente il sito di fosforilazione plasticità delle protein chinasi e la capacità del protocollo descritto per caratterizzare in dettaglio tutti i potenziali siti di fosforilazione.

Le fasi più critiche di questo protocollo sono: 1) estrazione sufficiente di proteine, 2) protezione dei PTM e 3) quantità sufficiente di proteine ​​bersaglio. In primo luogo, per l'estrazione sufficiente di proteine, è importante macinare il tessuto in azoto liquido e successivamente utilizzare un omogeneizzatore tessuto come descritto nel protocollo. Se un omogeneizzatore tessuto non è disponibile, può essere utilizzato un mortaio e pestello. E 'anche importante utilizzare un rapporto di uno a tre (o quattro) grammi di tessuto a volume di tampone di estrazione. Questo tessuto di tamponare rapporto e il buffer ad alta resistenza che suggeriamo farà sì che il pH resti neutrale durante il processo di estrazione. Abbiamo scoperto che questo è di particolare importanza per A. thaliana e pomodoro in piùZIONI 52. Protezione dei PTM può essere ottenuto anche in tutti i buffer inibitori appropriati di enzimi che possono rimuovere PTMs. E 'anche fondamentale per eseguire tutti i passaggi a 4 ° C e pre-raffreddamento tamponi e strumenti. Rendimenti più elevati di proteina bersaglio possono essere realizzati utilizzando piante che esprimono la proteina in quantità sufficienti e utilizzando elevate quantità di tessuto (circa 20 g). Il passo più importante per ottenere quantità sufficienti di proteina bersaglio sta concentrando la proteina bersaglio mediante immunoprecipitazione diretta. Il significato di questo passaggio è sottolineata dalla nostra incapacità di identificare PTM di Pto dopo un immunoprecipitazione Prf a causa della limitata quantità di coimmunoprecipitated Pto (Figura 2B). Al contrario, immunoprecipitazione diretta di Pto prodotto peptidi sostanzialmente più misurabili (Figura 2C) che portano alla copertura circa il 80% della sequenza proteica e l'identificazione dei PTM (Tabella 1). Abbiamo anche stconsiglia rongly l'uso di epitopi-tags per le proteine ​​immunoprecipitazione. In confronto ad anticorpi contro proteine ​​native matrice epitopo tag di affinità può produrre una maggiore quantità di proteina parzialmente purificato. Utilizzando un anticorpo sollevata contro la proteina nativa Pto 51 (Figura 2A) per immunoprecipitazione, siamo stati in grado di identificare solo singolo fosforilazione dei due siti di fosforilazione predominanti di Pto.

Questo protocollo è stato sviluppato principalmente per la purificazione parziale di N. benthamiana proteina citoplasmatica e successiva identificazione dei siti di fosforilazione. Tuttavia, in base alle modifiche qui descritte, questo protocollo può essere facilmente adattato per A. thaliana proteine ​​e proteine ​​di membrana vincolati. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di produrre quantità sufficienti di proteina bersaglio per l'identificazione dei PTM e non per ottenere la massima purezza del complesso. Se maggiore purezzadel complesso è necessaria una seconda fase di purificazione può essere aggiunto a questo protocollo 52. In tal caso, una prima fase consentirà eluizione della proteina bersaglio dalla matrice di affinità senza l'uso di sali alti o acido e il passo successivo può comportare una matrice, che richiede condizioni di eluizione dure. E 'importante sottolineare che abbiamo testato solo questo protocollo per l'identificazione di siti di fosforilazione e che stiamo attualmente testando la sua capacità per l'identificazione dettagliata del PTM supplementari.

I nostri risultati rappresentativi dimostrano chiaramente il sito di fosforilazione plasticità delle protein chinasi e la capacità del protocollo descritto per caratterizzare siti di fosforilazione. Soprattutto, essi sottolineano che l'identificazione dei siti di fosforilazione ricorrendo in bassa quantità di proteine ​​mediante spettrometria di massa e da mutazioni puntiformi di siti auto-fosforilazione può dare risultati confusi. Mostriamo qui e in precedenza 47 Che doppia fosforilazione della presa di forza Ser-198 e Thr-199 è associata con l'attivazione del complesso Prf / Pto. Al contrario, i risultati precedentemente pubblicati 47,63 hanno dimostrato che le mutazioni puntiformi di Ser-198 e Thr-199 in alanina, che impediscono la fosforilazione in questi siti, sono in grado di segnalare suggerendo che la fosforilazione di questi siti non è un prerequisito per l'attivazione complesso . Questi risultati possono essere spiegati dalla fosforilazione del sito secondario Thr-195. Intuizione simili nel sito di fosforilazione plasticità di altra proteina chinasi può essere ottenuta seguendo questo protocollo. Inoltre, un approccio combinato siti di fosforilazione mutazioni puntiformi, proteine ​​che possono inibire specifiche chinasi (effettori) accoppiati con proteine ​​immunoprecipitazione e spettrometria di massa porterà ad una migliore comprensione del significato evolutivo del sito di fosforilazione plasticità delle protein chinasi.

Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco (finanziari o di altro tipo).

Ringraziamenti

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VN è sostenuto dalla Royal Society. JPR è un futuro Fellow Australian Research Council (FT0992129). Ringraziamo il Dott. Miriam Gifford per criticamente la lettura del manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MgCl2SigmaM8266
MESSigmaM8250
AcetosyringoneSigmaD134406tossico - 1 M stock in DMSO
Siringa 1 ml sterileTerumo
Ago per siringaTerumoNN-2525R
Silwet L-77 (tensioattivo)Lehle SeedsVIS-01tossico
MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)SigmaC22111 M stock in DMSO, conservare a -80 ° C
Sali MSSigmaM5524ossidante, tossico
SaccarosioSigma16104
Trizma baseSigmaT1503regolare il pH con 1 N HCl per rendere 1 M Tris-HCl tampone
NaClSigmaS30145 M stock
EDTASigmaE6758tossico - 0,5 M stock
EGTASigmaE4378
GliceroloNational DiagnosticsEC-606
IGEPAL CA-630SigmaI8896corrosivo
PVPP (polivinilpolipirrolidone)SigmaP5288non confondere con PVP
DTT (DL-ditiotreitolo)Sigma43815tossico - 1 M di magazzino, conservare a -20 ° C
Cocktail di inibitori della proteasi vegetaleSigmaP9599non congelare/scongelare troppe volte
PMSF (fenilmetilsulfonilfluoruro)SigmaP7626corrosivo, tossico
CaliculinaA Tecnologia di segnalazione cellulare9902
Fluoruro di sodio (NaF)SigmaS7920tossico - 1 M stock
Molibdato di sodio (Na2MoO4)SigmaS66460,5 M stock
Ortovanadato di sodio (Na3VO4)Sigma450243tossico - Preparare una soluzione da 200 mM di ortovanadato di sodio. Regolare il pH a 10,0 utilizzando 1 N NaOH o 1 N HCl. Il pH iniziale della soluzione di ortovanadato di sodio può variare con molta sostanza chimica. A pH 10,0 la soluzione sarà gialla. Far bollire la soluzione fino a quando non diventa incolore (circa 10 minuti). Raffreddare a temperatura ambiente. Regolare nuovamente il pH a 10,0 e ripetere i passaggi 3 e 4 fino a quando la soluzione rimane incolore e il pH si stabilizza a 10,0.
Acido okadaicoSanta Cruz Biotechnologysc-3513
Kinematica Polytron omogeneizzatore tissutaleFisher Scientific08-451-320
MiraclothMerck Millipore475855-1R
anti-FLAG M2 agarosioSigmaA2220questa matrice è consigliata
Streptavidina-agarosioThermo-Scientific20347questo matrice è consigliata
GFP-Trap_AChromotekgta-20questa matrice è consigliata
Anti-HA-AgarosioSigmaA2095questa matrice è consigliata
0,45 μ m filtroVWR513-1902
BSASigmaA7906
FLAG peptideSigmaF3290
D-biotinaSigma47868
Resina StrataCleanAgilent400714questa resina di assorbimento è consigliata per la precipitazione delle proteine
Mini-PROTEAN Tetra CellBiorad
PROTEAN II XL CellBiorad
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC6060questa colorazione è consigliata
Provette proteiche a basso legame (LoBind)Eppendorf0030 108.116queste provette sono consigliate
Bicarbonato di ammonio (ABC)Sigma9830tossico
AcetonitrileVWR83639tossico, infiammabile
2-cloroacetammideSigma22790tossico
TripsinaPromegaV5280irritante, sensibilizzante
acido formicoSigma14265tossico, corrosivo
Sonicatore a bagno d'acquaUltravaweUltra BT Bagno
LTQ-Orbitrap XLTermo-scientifico
Tricostatina ASigmaT8552tossico
ultrasonico

Riferimenti

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