Un metodo quantitativo per studiare la migrazione spontanea di cellule in un microambiente confinato unidimensionale è descritto. Questo metodo sfrutta canali microfabbricati e può essere usato per studiare la migrazione di un gran numero di cellule in condizioni diverse in singoli esperimenti.
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Articolo metodologico
Studio della Migrazione cellulare in canali microfabbricati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il metodo qui descritto consente di studiare la migrazione delle cellule sotto confinamento in una dimensione. Si basa sull'uso di canali microfabbricati, che impongono un fenotipo polarizzato a cellule da limitazioni fisiche. Una volta che i canali interni, le cellule hanno solo due possibilità: andare avanti o indietro. Questa migrazione semplificata in cui direzionalità è limitato facilita il tracciamento automatico delle celle e l'estrazione di parametri quantitativi per descrivere il movimento delle cellule. Questi parametri includono la velocità delle cellule, cambi di direzione, e pause durante il movimento. Microcanali sono anche compatibili con l'uso di marcatori fluorescenti e sono quindi adatti per studiare la localizzazione di organelli e strutture intracellulari durante la migrazione cellulare ad alta risoluzione. Infine, la superficie dei canali può essere funzionalizzato con substrati differenti, permettendo il controllo delle proprietà adesive dei canali o lo studio di haptotaxis. In sintesi, il sistema here descritto è destinato ad analizzare la migrazione di grandi numeri di cellule in condizioni in cui sia la geometria e la natura biochimica dell'ambiente sono controllate, facilitando la normalizzazione e riproducibilità di esperimenti indipendenti.
Introduzione
La migrazione è una funzione cellulare complessa che è importante per molti processi fisiologici negli organismi multicellulari, incluso lo sviluppo, le risposte immunitarie e la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, alcune situazioni patologiche come invasione tumorale e metastasi basano sulla motilità cellulare 1. Per queste ragioni, la migrazione cellulare è diventato un importante campo di studio nell'ambito della ricerca sia fondamentale e traslazionale. In vivo, la maggior parte dei tessuti sono caratterizzati da una ricca matrice extracellulare ed elevata densità cellulare. La migrazione cellulare quindi, in condizioni fisiologiche, avvie....
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Protocollo
Nota importante: Questo protocollo presuppone che lo stampo contenente la forma per i microcanali desiderato è stato già fatto. Ulteriori informazioni sulla preparazione dello stampo è stato già pubblicato 10. Questo protocollo presuppone inoltre che la cultura DC midollo osseo è noto.
1. Chip Fabrication
- Mescolare olio PDMS e l'agente indurente in un rapporto in peso 10:1 in una tazza di plastica. Mescolare accuratamente entrambi i composti.
- Gettate la miscela sopra microcanali cuscinetto stampo. L'altezza totale deve essere compresa tra 0,5-1 cm.
- Rimuovere le bolle d'....
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Risultati
In ogni esperimento la superficie del PDMS è rivestita con una molecola adattato all'interesse dello studio. Figura 2 mostra canali rivestiti con una molecola fluorescente, PLL-g-PEG, prima e dopo il lavaggio (passo 2.4). Un simile esperimento permette di controllare l'omogeneità del rivestimento nei canali.
Dopo il caricamento delle cellule, microscopia video può essere eseguito per seguire la migrazione cellulare. Figura 3A mostra un esempio di DC .......
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Discussione
Qui si descrive un dispositivo composto di microcanali come metodo per studiare le proprietà migratorie di gran numero di cellule in singoli esperimenti. Questo sistema sperimentale imita i vincoli ambientali confinati trovati nei tessuti da cellule migranti endogene. Tuttavia, forzando la migrazione in una sola dimensione, facilita inseguimento cella automatica e l'estrazione di measurables (Figura 5). Mostriamo anche che il nostro dispositivo è compatibile con microscopia a fluorescenza e può pert.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono notevolmente la piattaforma PICT IBiSA presso l'Institut Curie (CNRS UMR144). Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal: Consiglio europeo della ricerca per AM.LD (Strapacemi 243.103), l'Associazione Nationale pour la Recherche (ANR-09-piri-0027-PCVI), la fondazione InnaBiosanté (Micemico) a MP e AM. LD e il giovane ricercatore sovvenzione CER Strapacemi a AM.LD.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Polidimetilsilossano (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Confezione di 90% base siliconica e 10% agente indurente |
| Taglierina per campioni di anime | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diametro 2,5 mm |
| Piatto con fondo in vetro | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Pulitore ad ultrasuoni | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Pulitore al plasma | Harrick Plasma | PDC 32 G | Per piccoli campioni (35 piatti). È disponibile anche una versione più grande |
| Fibronectina da plasma bovino | Sigma Aldrich | F0895 | |
| Polilisina innestata PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
Riferimenti
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008). <....
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Ristampe e permessi
