Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.
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Articolo metodologico
Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attività citolitica delle cellule T CD8+ viene valutata raramente. Descriviamo qui un nuovo test basato su cellule per misurare la capacità delle cellule T CD8+ antigene-specifiche di uccidere le cellule T CD4+ caricate con il loro peptide affine. Le cellule T CD4+ bersaglio sono divise in due popolazioni, marcate con due diverse concentrazioni di CFSE. Una popolazione è pulsata con il peptide di interesse (CFSE-low) mentre l'altra rimane non pulsata (CFSE-high). Le cellule T CD4+ pulsate e non pulsate vengono miscelate in un rapporto uguale e incubate con un numero crescente di cellule T CD8+ purificate. L'uccisione specifica delle cellule T CD4+ bersaglio autologhe viene analizzata mediante citometria a flusso dopo cocoltura con cellule T CD8+ contenenti le cellule T effettrici CD8+ antigene-specifiche rilevate mediante colorazione con peptide/tetramero MHCI. La lisi specifica delle cellule T CD4+ bersaglio, misurata a diversi rapporti effettori rispetto a quelli bersaglio, consente il calcolo di unità litiche, LU30/106 cellule. Questo test semplice e diretto consente di misurare con precisione la capacità intrinseca delle cellule T CD8+ di uccidere le cellule T CD4+ bersaglio.
Introduzione
L'attività citolitica è la funzione principale delle cellule T CD8+, ma è ancora raramente misurata poiché i saggi utilizzati per questo scopo sono ingombranti e difficili da standardizzare. La misurazione accurata di questa funzione è di fondamentale importanza quando si caratterizzano le funzioni effettrici delle cellule T CD8+, poiché non sono stati ancora descritti predittori affidabili di un'efficace citotossicità cellulo-mediata1,2. Qui, proponiamo un nuovo test funzionale per misurare l'attività citotossica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche su cellule T CD4+ bersaglio. Sono stati sviluppati diversi approcci per fornire alternative al gold stan....
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Protocollo
1. Preparazione delle cellule T CD8+ effettrici
- Scongelare le PBMC crioconservate autologhe (2-3 fiale da 50 x 106 cellule) trasferendo il crioviale dall'azoto liquido a un bagno d'acqua a 37 °C.
- Lavare le cellule riempiendo la provetta fino a 50 ml con RPMI completo (4 mM di L-glutammina e 100 U/ml di penicillina e streptomicina, integrati con il 10% di FBS). Contare le PBMC e risospendere le cellule a una concentrazione di 5 x 106/ml in RPMI completo.
- Aggiungere peptide specifico (5 μg/ml) e IL-2 (10 ng/ml) alle PBMC.
- Preparazione della coltura in una piastra a 96 pozzetti; seminare 1 ml di sospensione ....
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Risultati
Lo schema in Figura 1 riassume il saggio. I linfociti T CD8+ purificati (cellule effettrici) sono stati sospesi in 450 µl di RPMI completo ed è stata eseguita una diluizione seriale aggiungendo 225 µl di cellule T CD8+ al tubo successivo contenente 225 µl di mezzo (pannello superiore). I linfociti T CD4+ purificati (cellule bersaglio) sono stati contati, suddivisi in due tubi e marcati con due diverse concentrazioni di CFSE (alta e bassa), come descritto nel protocollo. Le cellule T CD4+ con bassa intens.......
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Discussione
Il test qui descritto consente di quantificare la funzione principale delle cellule T CD8+: l'attività citolitica. La misurazione accurata di questa funzione è di fondamentale importanza quando si caratterizzano le funzioni effettrici delle cellule T CD8+, poiché studi precedenti hanno riportato una discordanza tra questa funzione e la secrezione di citochine delle cellule T CD8+ antigene-specifiche10,11. A causa del breve tempo di incubazione in cocoltura (6 ore) e dell'uso di cellule bersaglio autologhe, c'è.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dall'Ufficio del Turismo, del Commercio e dello Sviluppo Economico della Florida.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per l'arricchimento delle cellule T CD4+ umane EasySep | Cellule staminali | 19052 | |
| Kit per l'arricchimento delle cellule T CD8+ umane EasySep | Cellule staminali | 19053 | |
| Kit per la proliferazione cellulare CellTrace CFSE - Per citometria a flusso | Invitrogen | C34554 | |
| Cellule morte riparabili Far Red LIVE/DEAD | Invitrogen | L10120 | |
| Alexa Fluor 700 Topo Anti-umano CD3 | BD | ||
| Brilliant Violet 650 Anticorpo CD4 Anti-Umano | Biolegend | 317435 | |
| PerCP Anticorpo CD8 Anti-Umano | Biolegend | 344707 | |
| RPMI 1640 Medio 1x | VWR | 10-040-CV | |
| Penicillina-Streptomicina 100x Soluzione | Invitrogen | 15070063 | |
| Siero Fetale Bovino - Oro, PAA inattivato al calore | A15-252 | ||
| piastre a 96 pozzetti; Curato; fondo a U; con coperchio | BD Falcon | 353077 | |
| 25 ml di polistirene sterile, serbatoi confezionati singolarmente | USA Scientific | 2321-2230 | |
| 96 pozzetti con fondo a U, sterili 2 ml piastre profonde | Thermo Scientific | 275743 | |
| Human IL-2 (v126), per la ricerca | Miltenyi Biotec | 130-093-096 | |
| RoboSep Buffer, tampone di separazione | Cellule | staminali20104 | |
| Provetta conica in polipropilene da 15 ml | BD Falcon | 352097 | |
| Provetta a fondo tondo da 14 ml, polipropilene | BD Falcon | 352059 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem cell | 18001 | |
| PBS 1x | VWR | 21-040-CV | |
| a 96 pozzetti; Piastra con fondo a V con coperchio | Fisher | 12-565-481 | |
| Soluzione di formaldeide, reagente ACS, 37 % in peso in H2O | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| Microprovetta con tappo a vite da 1,5 ml, conica | Sarstedt | 72.692.005 |
Riferimenti
- Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
- Betts, M. R., Harari, A. Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV. Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).
- Roder, J. C., et al.
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Ristampe e permessi
