Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Sommario

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Abstract

L'attività citolitica delle cellule T CD8+ viene valutata raramente. Descriviamo qui un nuovo test basato su cellule per misurare la capacità delle cellule T CD8+ antigene-specifiche di uccidere le cellule T CD4+ caricate con il loro peptide affine. Le cellule T CD4+ bersaglio sono divise in due popolazioni, marcate con due diverse concentrazioni di CFSE. Una popolazione è pulsata con il peptide di interesse (CFSE-low) mentre l'altra rimane non pulsata (CFSE-high). Le cellule T CD4+ pulsate e non pulsate vengono miscelate in un rapporto uguale e incubate con un numero crescente di cellule T CD8+ purificate. L'uccisione specifica delle cellule T CD4+ bersaglio autologhe viene analizzata mediante citometria a flusso dopo cocoltura con cellule T CD8+ contenenti le cellule T effettrici CD8+ antigene-specifiche rilevate mediante colorazione con peptide/tetramero MHCI. La lisi specifica delle cellule T CD4+ bersaglio, misurata a diversi rapporti effettori rispetto a quelli bersaglio, consente il calcolo di unità litiche, LU₃₀/10⁶ cellule. Questo test semplice e diretto consente di misurare con precisione la capacità intrinseca delle cellule T CD8+ di uccidere le cellule T CD4+ bersaglio.

Introduzione

L'attività citolitica è la funzione principale delle cellule T CD8+, ma è ancora raramente misurata poiché i saggi utilizzati per questo scopo sono ingombranti e difficili da standardizzare. La misurazione accurata di questa funzione è di fondamentale importanza quando si caratterizzano le funzioni effettrici delle cellule T CD8+, poiché non sono stati ancora descritti predittori affidabili di un'efficace citotossicità cellulo-mediata^1,2. Qui, proponiamo un nuovo test funzionale per misurare l'attività citotossica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche su cellule T CD4+ bersaglio. Sono stati sviluppati diversi approcci per fornire alternative al gold standard, il saggio di rilascio del cromo. Presentiamo qui un saggio basato su cellule che rivela l'intero processo di uccisione mentre misura la morte delle cellule bersaglio vive. Questo metodo è stato derivato da protocolli di saggi citotossici basati sulla citometria a flusso in vivo nei topi^4,5 e in vitro nell'uomo⁶. In questo protocollo, le cellule T CD8+ antigene-specifiche contenute nella popolazione totale di cellule T CD8+ vengono utilizzate come cellule effettrici e le cellule T CD4+ autologhe vengono utilizzate come cellule bersaglio. Le cellule T effettrici CD8+ di interesse sono enumerate utilizzando MHCI/tetrameri peptidici⁷. La morte delle cellule bersaglio è calcolata dal rapporto tra le cellule T CD4+ caricate e non caricate con peptidi. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo metodo era riproducibile, sensibile, specifico e non dipendeva dal numero di cellule effettrici all'interno della popolazione totale di cellule T CD8+⁸. Enumerando sia il numero di cellule effettrici che quelle bersaglio nel saggio di cocoltura, la capacità intrinseca delle cellule T CD8+ di uccidere le cellule bersaglio può essere calcolata ed espressa in unità litiche⁹.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule T CD8+ effettrici

1. Scongelare le PBMC crioconservate autologhe (2-3 fiale da 50 x 10⁶ cellule) trasferendo il crioviale dall'azoto liquido a un bagno d'acqua a 37 °C.
2. Lavare le cellule riempiendo la provetta fino a 50 ml con RPMI completo (4 mM di L-glutammina e 100 U/ml di penicillina e streptomicina, integrati con il 10% di FBS). Contare le PBMC e risospendere le cellule a una concentrazione di 5 x 10⁶/ml in RPMI completo.
3. Aggiungere peptide specifico (5 μg/ml) e IL-2 (10 ng/ml) alle PBMC.
4. Preparazione della coltura in una piastra a 96 pozzetti; seminare 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto.
5. Dopo 3 giorni di coltura, sostituire metà del terreno di coltura cellulare con un RPMI completo fresco.
6. Dopo 6 giorni di coltura, raccogliere tutte le PBMC con pipetta multicanale e trasferire le cellule in un serbatoio sterile.
7. Contare, lavare e risospendere le PBMC a 5 x 10⁷/ml nel tampone di separazione raccomandato in provette a fondo tondo da 14 ml. Aggiungere un cocktail di arricchimento di cellule T CD8+ umane a 50 μl/ml di cellule. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere particelle magnetiche a 150 μl/ml e incubare per 5 minuti.
8. Portare la sospensione cellulare fino a 7 ml aggiungendo il tampone di separazione. Procedere all'isolamento immunomagnetico di una cellula T CD8+ non toccata inserendo la provetta nel magnete. Dopo 5 minuti, con la provetta ancora nel magnete, versare le cellule di interesse in una nuova provetta conica da 15 ml. Prelevare una piccola aliquota e colorare le cellule con anticorpi contro CD3 e CD8 in 1X PBS-2% FBS per 30 minuti a 4 °C. La purezza delle cellule T CD8+ può quindi essere misurata tramite citometria a flusso con una purezza prevista del 95% o superiore.
9. Risospendere le cellule T CD8+ in 450 μl con RPMI completo.
10. Aggiungere 225 μl di RPMI completo in 5 provette con tappo a vite.
11. Preparare diluizioni seriali (da 1:2 a 1:32) trasferendo 225 μl di CD8+ nella provetta successiva (vedere il pannello superiore della Figura 1).

2. Preparazione delle cellule T CD4+ target

1. Scongelare le PBMC crioconservate autologhe (1 fiala da 50 x 10⁶ cellule) trasferendo la crioviale da azoto liquido a un bagno d'acqua a 37 °C.
2. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml contenente 10 ml di RPMI.
3. Lavare le cellule e risospendere le PBMC a 5 x 10⁷/ml con tampone di separazione in provette a fondo tondo da 14 ml. Aggiungere un cocktail di arricchimento di cellule T CD4+ umane a 50 μl/ml di cellule. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aggiungere particelle magnetiche a 100 μl/ml e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Portare la sospensione cellulare fino a 7 ml aggiungendo un tampone di separazione. Procedere all'isolamento delle cellule T CD4+ inserendo la provetta nel magnete. Dopo 5 minuti, con la provetta ancora all'interno del magnete, versare le cellule desiderate in una nuova provetta conica da 15 ml. Prelevare una piccola aliquota e colorare le cellule con anticorpi contro CD3 e CD4 in 1x PBS-2% FBS per 30 minuti a 4 °C. La purezza delle cellule T CD4+ può quindi essere misurata tramite citometria a flusso con una purezza prevista del 95% o superiore.
5. Contare le cellule T CD4+, dividerle in due provette coniche da 15 ml e lavarle in 1x PBS caldo.
6. Preparare una soluzione di lavoro ad alto CFSE da 0,4 μM in PBS caldo.
7. Preparare una soluzione di lavoro a basso contenuto di CFSE da 0,04 μM diluendo una parte della soluzione ad alto tenore di lavoro CFSE 10x in PBS caldo.
8. Risospendere le cellule a 20 x 10,⁶/ml di PBS (se il numero di cellule T CD4+ è inferiore a 10 x 10,⁶/ml risospendere le cellule in 0,5 ml di PBS) e colorare metà delle cellule T CD4+ aggiungendo un volume uguale di soluzione di lavoro ad alto CFSE da 0,4 μM (concentrazione finale 0,2 μM). Ad esempio, per 1 ml di cellule, aggiungere 1 ml della soluzione di lavoro CFSE. Colorare la metà rimanente del CD4+ aggiungendo un volume uguale di 0,04 μM di soluzione di lavoro a basso contenuto di CFSE (concentrazione finale 0,02 μM). Colorare le celle per 15 minuti a 37 °C in atmosfera al 5% di CO₂.
9. Dopo l'incubazione, pellettare le celle a 1.500 giri/min per 5 minuti e risospendere in 1 ml di RPMI completo caldo per spegnere la reazione di marcatura.
10. Pulsare le cellule T CD4+ CFSE-low aggiungendo il peptide di interesse a una concentrazione finale di 5 μg/ml nell'RPMI completo e incubare per 45 minuti in atmosfera di CO₂ al 5% a 37 °C.
11. Lavare le cellule T CD4+ CFSE-high e CFSE-low in RPMI completo. Ripetere per un totale di due lavaggi. Risospendere a una concentrazione di 2 x 10⁵ cellule/ml ciascuna in RPMI completo.
12. Mescolare le due popolazioni target con un rapporto di 1:1 (CFSE-High:CFSE-Low) (vedere la Figura 1 nel pannello inferiore).

3. Cocultura

1. Da ogni diluizione di cellule T CD8+, seminare 100 μl in duplicato su piastra a 96 pozzetti a fondo tondo.
2. Aggiungere le cellule T CD4+ target misti (100 μl) a ciascuna diluizione di cellule effettrici per un volume finale di 200 μl.
3. Per misurare l'apoptosi basale, seminare 3 pozzetti con le sole cellule bersaglio.
4. Incubare la cocoltura per 6 ore in atmosfera di CO₂ al 5% a 37 °C.

4. Colorazione e acquisizione della citometria a flusso

1. Trasferire le cellule su una piastra a 96 pozzetti con fondo a V e colorarle con tetrameri pMHC coniugati in PE per 15 minuti in atmosfera di CO₂ al 5% a 37 °C.
2. Lavare in 1x PBS-2% FBS e colorare le cellule con Far Red LIVE/DEAD fixable dead cell, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 per 30 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce.
3. Lavare le celle una volta con 1x PBS-2% FBS e risospendere in 100 μl con formaldeide al 2% in 1x PBS.
4. Acquisire le cellule sul citometro a flusso.

Risultati

Lo schema in Figura 1 riassume il saggio. I linfociti T CD8+ purificati (cellule effettrici) sono stati sospesi in 450 µl di RPMI completo ed è stata eseguita una diluizione seriale aggiungendo 225 µl di cellule T CD8+ al tubo successivo contenente 225 µl di mezzo (pannello superiore). I linfociti T CD4+ purificati (cellule bersaglio) sono stati contati, suddivisi in due tubi e marcati con due diverse concentrazioni di CFSE (alta e bassa), come descritto nel protocollo. Le cellule T CD4+ con bassa intens...

Discussione

Il test qui descritto consente di quantificare la funzione principale delle cellule T CD8+: l'attività citolitica. La misurazione accurata di questa funzione è di fondamentale importanza quando si caratterizzano le funzioni effettrici delle cellule T CD8+, poiché studi precedenti hanno riportato una discordanza tra questa funzione e la secrezione di citochine delle cellule T CD8+ antigene-specifiche^10,11. A causa del breve tempo di incubazione in cocoltura (6 ore) e dell'uso di cellule bersaglio autologhe, c'è...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per l'arricchimento delle cellule T CD4+ umane EasySep	Cellule staminali	19052
Kit per l'arricchimento delle cellule T CD8+ umane EasySep	Cellule staminali	19053
Kit per la proliferazione cellulare CellTrace CFSE - Per citometria a flusso	Invitrogen	C34554
Cellule morte riparabili Far Red LIVE/DEAD	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 Topo Anti-umano CD3	BD
Brilliant Violet 650 Anticorpo CD4 Anti-Umano	Biolegend	317435
PerCP Anticorpo CD8 Anti-Umano	Biolegend	344707
RPMI 1640 Medio 1x	VWR	10-040-CV
Penicillina-Streptomicina 100x Soluzione	Invitrogen	15070063
Siero Fetale Bovino - Oro, PAA inattivato al calore		A15-252
piastre a 96 pozzetti; Curato; fondo a U; con coperchio	BD Falcon	353077
25 ml di polistirene sterile, serbatoi confezionati singolarmente	USA Scientific	2321-2230
96 pozzetti con fondo a U, sterili 2 ml piastre profonde	Thermo Scientific	275743
Human IL-2 (v126), per la ricerca	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Buffer, tampone di separazione	Cellule	staminali20104
Provetta conica in polipropilene da 15 ml	BD Falcon	352097
Provetta a fondo tondo da 14 ml, polipropilene	BD Falcon	352059
The Big Easy EasySep Magnet	Stem cell	18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
a 96 pozzetti; Piastra con fondo a V con coperchio	Fisher	12-565-481
Soluzione di formaldeide, reagente ACS, 37 % in peso in H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
Microprovetta con tappo a vite da 1,5 ml, conica	Sarstedt	72.692.005